重組大腸桿菌制備副溶血弧菌噬菌體內溶素Lys qdvp001 CHAP域及誘導條件初步優化

鞠曉晨,呂新偉,王靜雪,林 洪

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性致病菌,會引起海鮮類食品污染,是引發海產品類食源性疾病最主要的因素之一,常導致腸胃炎、傷口感染和敗血癥[1]。然而近年來,由于水產養殖過程中抗生素的濫用,導致了多重耐藥性的副溶血弧菌的產生,這嚴重威脅著人類健康,同時也制約了魚類及貝類養殖產業的發展[2]。有文獻報道,從取自河北省地區的水產品中,采用稀釋法分離得到38株副溶血弧菌菌株,結果發現所有的菌株都對氨芐西林有耐藥性,其中44.74%對磺胺異惡唑有耐藥性,34.21%對甲氧芐氨嘧啶有耐藥性,68.42%對妥布霉素有耐藥性,21.05%對頭孢曲松有耐藥性,28.95%對先鋒霉素有耐藥性,73.68%對呋喃妥因有耐藥性,39.47%對頭孢哌酮有耐藥性,26.32%對環丙沙星有耐藥性[3],表明細菌抗藥性問題已經非常嚴重。因此,找到能夠替代抗生素并能有效防控副溶血弧菌的抑菌劑迫在眉睫。

由于耐藥菌的出現,新型抗菌劑——內溶素，成為替代抗生素的一種絕佳選擇。內溶素是天然存在的殺菌劑,是噬菌體編碼的一種肽聚糖裂解酶,在噬菌體侵染細菌階段起作用，用于細菌的肽聚糖層,在噬菌體侵染細菌最后的裂解階段,水解肽聚糖,裂解細菌,使得繁殖在細菌體內的子代噬菌體得以釋放出來[4]。用重組菌克隆表達制備的內溶素已經成功應用于抑制有耐藥性的革蘭氏陽性病原體,且內溶素在控制食品安全,醫療器械表面消毒,消除細菌生物膜的產生以及病原體檢測和疫苗制備方面都有很好的應用[56]。因此,內溶素作為新型抑菌劑有很好的應用前景。

本實驗室前期成功克隆表達溶血弧菌噬菌體qdvp001的ORF60,制備出新型的內溶素抗菌劑Lys qdvp001[7],并對其進行結構物預測,發現ORF60為模塊化結構,包含兩個部分,PG_binging_1域和CHAP域[8]。本研究將對其CHAP域進行克隆表達,確定Lys qdvp001 CHAP域表達形式,對誘導表達條件進行初步優化,并對其進行了復性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原核表達載體 pET30a、BL21(DE3) 均由實驗室保存;質粒抽提試劑盒、DNA回收試劑盒 購自天根生化公司;T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶 購自康為公司;電泳相關試劑(Tris,Glycine,SDS,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒等) 購自北京索萊寶科技有限公司;0.22 um 濾器及透析袋 購于Millipore公司;異丙基βD硫代半乳糖苷(簡稱 IPTG) 購于北京索萊寶生物技術有限公司;溶菌酶 購于北京索萊寶生物技術有限公司;卡那霉素(硫酸鹽) 購于上海生工生物工程股份有限公司;Ni2+SepharoseTM6 Fast Flow填料 購于美國GE healthcare公司;咪唑 購于北京索萊寶科技有限公司;LB肉湯培養基、LB培養基瓊脂 購于北京陸橋技術有限公司;LArginine 購于北京索萊寶科技有限公司;尿素、甘油、氯化鈉 購于上海滬試有限公司;GSSG,GSH 購于上源葉生物有限公司。

DNA合成儀 美國BIOAUTOMATION公司;PCR儀 中國賽默飛世爾公司;電泳儀 伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;超聲細胞破碎儀 寧波新芝生物有限;高速冷凍離心機 湖南湘儀有限公司;四維旋轉混合儀江蘇 海門其林貝爾儀器制造有限公司;SWCJ2FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司;Power Wave XS2微孔板分光光度計 美國百特國際有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 pET30aCHAP表達載體的構建 對已知的Lysqdvp001中CHAP域的蛋白氨基酸序列進行密碼子優化,在合成序列的上下游段引入NdeI/HindII酶切位點序列,通過DNA合成儀合成所需的DNA序列,以合成的DNA片段為模板進行PCR擴增,為方便表達載體的構建,選擇在上下游引物的5′端也分別引入限制性內切酶 NdeI/HindII的酶切位點,根據優化設計序列設計引物,引物序列如下:上游引物P1:5′(CGTCATATGCATCATCATCACCATCACGAC)3′,下游引物P2:5′(TCGAAGCTTTCATTATTGA TGCGGATTACGATAG)3′,引物由上海生工公司合成。然后通過限制性酶切位點Nde Ⅰ和Hind Ⅲ,將PCR產物及pET30a質粒進行雙酶切,將 CHAP基因插入到表達載體pET30a中,再用T4 DNA連接酶連接得到重組質粒[9]。

1.2.2 pET30aCHAP表達菌的構建及表達 將含有CHAP基因的質粒轉化到 BL21(DE3)感受態細胞中,涂布于添加卡那霉素抗性(卡那霉素50 μg/mL)的LB平板,37 ℃過夜培養,次日獲得轉化子克隆。取4個單克隆并提取質粒,質粒經PCR鑒定(引物P1、P2)及DNA測序篩選pET30aCHAP重組表達載體。

1.2.3 重組內溶素初步誘導表達 挑取含有pET30aCHAP重組表達載體的單菌落至5 mL的LB肉湯培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中,同時以pET30空載體轉化的大腸桿菌作對照。37 ℃,150 r/min培養過夜后以1∶100的比例加入到100 mL的LB肉湯培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中,培養6 h后OD600 nm達到0.4左右,再加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,同時以未加IPTG誘導的pET30aCHAP重組表達載體菌液作為對照,于16 ℃,150 r/min繼續培養5 h,取出1 mL菌液。將取出的菌液12000 r/min離心2 min,棄掉上清液,用45 μL的4×上樣緩沖液復溶菌體,煮沸7 min進行SDSPAGE電泳。未加IPTG誘導的菌液作為第二組對照。

1.2.4 表達形式的確定 將于37 ℃,150 r/min培養過夜后以1∶100的比例加入100 mL的LB肉湯培養基(含50 μg/mL卡那霉素),培養6 h后OD600 nm達到0.4左右后,再于16 ℃,150 r/min,加入IPTG(0.5 mmol/L)誘導5 h的得到的菌液,分別12000 r/min,2 min離心,收集菌體。將離心所得菌體用pH為8的緩沖液(50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl)復融,利用超聲破碎儀在300 W，工作5 s，休息5 s條件下進行超聲破碎20 min,破碎好的菌液于12000 r/min,30 min離心,沉淀和上清進行SDS-PAGE電泳觀察。其中沉淀于8 mol/L Urea,50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl的緩沖液溶解,溶解時可進行適度超聲使其溶解完全。

1.2.5 IPTG誘導濃度的確定 使用不同濃度的IPTG進行誘導表達(0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、5 mmol/L),分別于37 ℃,150 r/min培養誘導5 h,將菌液12000 r/min離心2 min,棄掉上清液,用45 μL的4×上樣緩沖液復溶菌體,煮沸7 min進行SDSPAGE電泳。

1.2.6 誘導溫度的確定 使用濃度為0.5 mmol/L的IPTG對重組表達載體進行誘導表達,培養溫度分別設定為16,25和37 ℃繼續培養5 h,將菌液12000 r/min離心2 min,棄掉上清液,用45 μL 的4×上樣緩沖液復溶菌體,煮沸7 min進行SDS-PAGE電泳。

1.2.7 誘導時間的確定 使用濃度為0.5 mmol/L的IPTG對重組表達載體在16 ℃進行誘導表達,分別在1、2、3、4、5、6、7、8 h后取出1 mL菌液至無菌EP管中,至4 ℃冰箱保存。將菌液12000 r/min離心2 min,棄掉上清液,用45 μL的4×上樣緩沖液復溶菌體,煮沸7 min進行SDSPAGE電泳。

1.2.8 包涵體的制備 挑取含有pET30aCHAP重組表達載體的單菌落至5 mL的LB肉湯培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中,于37 ℃,150 r/min培養過夜后以1∶100的比例加入2 L的LB肉湯培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中,培養6 h后OD600 nm達到0.4左右,再加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,于16 ℃,150 r/min繼續培養7 h,離心,去上清,沉淀即為包涵體,保存于80 ℃備用。

1.2.9 包涵體的變性 取上述制備的4 g包涵體用40 mL超聲破碎液緩沖液(pH=8,50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L Imidazole)重懸,將菌液放入冰水混合物中,靜止5 min,使菌液保持較低的溫度。清洗探頭,進行超聲破碎,超5 s停10 s,超聲20 min,觀察到菌液已經破碎成均勻的溶液。去雜質包涵體用洗滌液(1 mol/L Urea、50 mmol/L Tris(pH=8.0)、150 mmol/L NaCl、1% Triton X100[10]、5 mmol/L EDTA、2 mmol/L DTT)洗滌,每次充分混勻后,10000 r/min離心10 min左右,重復3次。然后用純水洗滌一次。以50 mmol/L Tris(pH8.0),150 mmol/L NaCl,8 mol/L Urea緩沖液溶解包涵體,輕度的超聲,直到沉淀徹底溶解。

1.2.10 目的蛋白的純化 首先進行重組蛋白純化的小試實驗,以確定最優洗脫條件。將4 mL Ni2+SepharoseTM6 Fast Flow填料加入柱子中,以1 mL/min的流速分別用超純水和結合緩沖液(8 mol/L Urea,50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L咪唑,pH8)洗柱子直至基線,加入5 mL粗酶液,依次用含有50、100、200、300、400、500 mmol/L咪唑的結合緩沖液洗脫蛋白至OD280 nm平穩,進行電泳檢測,純化過程使用的試管及緩沖液均經過4 ℃預冷。將純化后的重組蛋白置于80 ℃保存。

1.2.11 包涵體的復性 將純化得到的上清裝入已經預處理好的透析袋中(截留分子量為3.5 kDa),將蛋白按照體積比為1/20透析至300 mL的復性緩沖液[50 mmol/L Tris(pH8.0),150 mmol/L NaCl,4 mmol/L GSH,0.4 mmol/L GSSG,2 mmol/L EDTA[11],0.4 mol/L LArginine[12],10% Glycerol]中復性,時間為24 h,溫度為4 ℃。

把裝有CHAP蛋白的透析袋取出,將其按照體積比為1/20透析至300 mL的儲存緩沖液50 mmol/L Tris,150 mmol/L NaCl,10% Glycerol(pH8.0)中,時間為8 h,每2 h換液一次,溫度為4 ℃。

透析復性結束后,將蛋白取出離心:13000 r/min,15 min,溫度為4 ℃,離心結束后留上清,并用濾頭抽濾(直徑為0.22 μm)后分裝,并將其凍存至80 ℃,等待檢測。

1.2.12 酶活測定 通微孔板分光光度計檢測450 nm處光密度的降低來測定裂解活性。將副溶血弧菌vp17802培養過夜直到OD450 nm達到0.8左右。細胞在9000 r/min離心15 min,用50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl(pH8.0),洗滌一次,并重新懸浮在相同的緩沖液中以將OD450 nm調節至1.0左右。在96孔板中先加入100 μL細菌復融液,再加入100 μL重組蛋白Lys qdvp001 CHAP,透析液作為陰性對照,分別在1、2、3、4、5、10、15、20、25、30 min測定其吸光值,每組3個平行。

2 結果與分析

2.1 轉化后的大腸桿菌菌落PCR結果

取其中轉化后的大腸桿菌菌落進行菌落PCR,顯示有明亮條帶的為陽性克隆,不顯示條帶的菌落為假陽性菌落,測序結果發現陽性克隆與目的基因序列為100%一致,可以確定目的基因成功導入。

圖1 轉化后菌落PCR檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis of transfered E.coil注:M:marker；脈道1,2,3,4:pET30aCHAP PCR產物。

2.2 重組內溶素初步誘導表達

可以從圖2看出,pET30空載體和重組菌表達的蛋白分子量極為相似,經過蛋白質譜鑒定,確定pET30空載體和重組菌表達蛋白的氨基酸序列不一致,根據PCR擴增目的基因的條帶分子大小以及測序結果確定了目的基因成功導入到大腸桿菌中。其次未加IPTG誘導的菌液幾乎沒有目的蛋白的表達(圖2,泳道2)。

圖2 重組菌的初步表達Fig.2 Total fractions of induced of recombinant bacteria注:M:marker；1:pET30質?？蛰d體大腸桿菌菌液(加IPTG誘導),2:未加IPTG誘導的Lysvp001 CHAP基因的重組菌株菌液,3:正常誘導的Lysvp001 CHAP基因的重組菌株菌液,箭頭所指位置為目的蛋白大小位置。

2.3 IPTG誘導濃度的確定

IPTG誘導濃度大小會對表達量的多少產生影響,可以從圖3看出,IPTG濃度太低時蛋白的表達量太低,IPTG為濃度5 mmol/L時,其濃度過高反而會抑制蛋白的表達。當IPTG濃度為0.5、1、1.5、2 mmol/L各個條帶中目的蛋白的表達量沒有明顯的差別,考慮到經濟因素,并且IPTG有細胞毒性,不利于菌體生長[13],所以表達量差別不大時,選取低濃度,因此最終選取IPTG最佳誘導濃度為0.5 mmol/L。

圖3 IPTG濃度對重組蛋白表達量的影響Fig.3 The effects of different IPTG concentration on recombinant bacteria注:M:marker；1～7:IPTG終濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、1.5、2、5 mmol/L,箭頭所指位置為目的蛋白大小位置。

2.4 誘導溫度的確定

誘導溫度會對表達量產生影響,從圖4看出,當誘導溫度為16 ℃和37 ℃各個條帶中目的蛋白的表達量差別不大,但誘導溫度過高會導致當蛋白質合成速度過快,多肽鏈不能正確折疊,導致疏水基因暴露在外等問題,因此當表達量一樣時,選取最后的誘導溫度為16 ℃[14]。

圖4 不同誘導溫度對重組蛋白表達量的影響Fig.4 The effects of different temperature on recombinant bacteria注:M:marker；1:誘導溫度為16 ℃,2:誘導溫度為25 ℃,3:誘導溫度為37 ℃,箭頭所指位置為目的蛋白大小位置。

2.5 誘導時間的確定

誘導時間的多少會對表達量產生影響,從圖5看出,誘導時間越長,目的蛋白的表達量越高,誘導時間為7 h目的蛋白表達量最高,但誘導時間過長,誘導產生的氨基酸反而會抑制目的蛋白的合成[15],從圖可以看出,誘導8 h,目的蛋白的表達量反而減少了。因此最終選取最佳誘導時間為7 h。

圖5 不同誘導時間對重組蛋白表達量的影響Fig.5 The effects of different time on recombinant bacteria注:M:marker；1:誘導時間為1 h,2:誘導時間為2 h,3:誘導時間為3 h,4:誘導時間為4 h,5:誘導時間為5 h,6:誘導時間為6 h,7:誘導時間為7 h,8:誘導時間為8 h,箭頭所指位置為目的蛋白大小位置。

2.6 表達形式的確定

從重組菌的上清和沉淀中目的蛋白含量確定其表達形式,從圖6可以看出,誘導后重組菌的上清中目的蛋白含量較少,但誘導后的沉淀在 10 kDa左右處有大量的目的融合蛋白,這說明該工程菌所表達的融合蛋白多為不可溶的包涵體。目前具有模塊化結構的格蘭氏陰性菌噬菌體內溶素的C段結構域大多是以包涵體形式存在的[16],結合本研究所克隆表達的目的蛋白的分子結構是具有模塊化結構的格蘭氏陰性菌噬菌體內溶素Lys qdvp001的C端CHAP域,可知目的蛋白的表達形式也為不可溶性的包涵體,與目前已知的大多文獻結果一致。

圖6 16 ℃誘導條件下重組蛋白表達形式Fig.6 The expression form of recombinant protein at 16 ℃注:M為蛋白marker；1:超聲破碎后上清液中的細菌總蛋白,2:超聲破碎后的沉淀溶于8 mol/L尿素的沉淀中的細菌總蛋白,箭頭所指位置為目的蛋白大小位置。

2.7 包涵體變性結果

可以從圖7泳道6清楚的得出,含8 mol/L Urea的變性劑可以很好的將沉淀復性,洗滌劑對雜蛋白也有很好的去除作用,但是第2,3次有少量目的蛋白洗脫下來,因此可以適當的減少洗滌沉淀的次數,洗滌次數為一次即可。

圖7 8 mol/L尿素溶解重組蛋白Fig.7 SDS of Urea dissolved recombinant protein注:M:marker；1:重組菌株菌液,2:破碎后的菌液,3:第一次洗滌沉淀后的上清,4:第2次洗滌沉淀后的上清,5:第3次洗滌沉淀后的上清,6:沉淀復性以后的上清,箭頭所指位置為目的蛋白大小位置。

2.8 純化結果

用不同濃度的咪唑緩沖液洗脫蛋白可以確定最佳咪唑濃度,從圖8可以看出,復性后的蛋白過Ni柱可以很好的純化出來,其在50,100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液都能洗脫下來,且在100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液時濃度明顯很高,因此可以確定最佳咪唑洗脫緩沖液為100 mmol/L。

圖8 重組蛋白純化過程電泳圖 Fig.8 SDSPAGE of the purifacation process of recombinant protein注:M:marker；1～4:10 mmol/L咪唑洗脫緩沖液,5～6:50 mmol/L咪唑洗脫緩沖液,7～10:100 mmol/L咪唑洗脫緩沖液,11:200 mmol/L咪唑洗脫緩沖液,12～13:300 mmol/L咪唑洗脫緩沖液,14:400 mmol/L咪唑洗脫緩沖液,15～16:500 mmol/L咪唑洗脫緩沖液。

2.9 復性結果

未加透析促進劑透析,溶液出現沉淀現象,分別取上清和沉淀進行電泳,結果如圖10所示,上清中目的蛋白含量較低,蛋白集中在沉淀中,說明復性促進劑對目的蛋白的復性有著非常重要的作用;添加復性促進劑的SDSPAGE 和 Western Blot的結果顯示,透析結束后,上清液中目的蛋白的含量明顯增加,說明包涵體已由不可溶轉化成可溶的蛋白,最終獲得的可溶性蛋白濃度是標準品濃度0.68 mg/mL,復性回收率為61.7%。

圖9 未加復性劑透析結果Fig.9 SDSPAGE without renaturation accelerator after dialysis 注:M:maker；1:透析后上清,2:透析后沉淀。

圖10 透析后上清液電泳結果Fig.10 SDSPAGE and Western Blot of liquid supernatant after dialysis 注:1:牛血蛋白清,2:重組蛋白,M1:蛋白電泳marker,M2:組氨酸抗體。

2.10 酶活結果

由圖11酶活測定結果顯示,復性之后的獲得的目的蛋白可以使副溶血弧菌vp17802的OD450 nm下降0.5左右,證明其對副溶血弧菌有明顯的抑制作用。

圖11 酶活測定結果Fig.11 The results of enzyme activity

3 結論

本研究成功克隆和表達的工程菌pET30a-CHAP,通過IPTG的誘導表達,確定最佳誘導條件為誘導溫度為16 ℃,IPTG終濃度0.5 mmol/L,誘導時間為7 h,確定了重組菌的表達形式為沒有活性的包涵體。本實驗將表達的pET30aCHAP包涵體蛋白先用洗滌劑洗滌一次,去除雜蛋白,然后用尿素變性劑溶解,Ni2+SepharoseTM6 Fast Flow親和層析柱進行層析將雜蛋白進行純化,再用EDTA,氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽等作為折疊復性促進劑,經過透析得到可溶性的 pET30aCHAP蛋白。此研究為利用內溶素防控副溶血弧菌以及其他革蘭氏陰性細菌提供了制備方法。

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