麥芽品種DNA指紋圖譜構建的研究

張志軍,岳 杰,尹 花,余俊紅,董建軍,周月南

(啤酒生物發酵工程國家重點實驗室,青島啤酒股份有限公司,山東青島 266100)

啤酒是以麥芽、酒花、水為主要原料,經酵母發酵釀制而成的飽含二氧化碳的低酒精度酒。麥芽作為啤酒的主要原料,是大麥經浸麥、發芽、干燥和焙焦等工藝制得的,麥芽的質量直接決定啤酒的品質。不同麥芽品種彼此間釀造特性不同,如浸出率、糖化力、粘度等,釀造工藝必須根據麥芽品種的特點進行相應調整。因此麥芽品種鑒定是評價麥芽質量的重要指標,也是啤酒企業在商業麥芽采購中極為關注的評價指標。

目前大麥品種鑒定技術既有傳統的形態鑒別方法、田間小區種植鑒定,也有蛋白質電泳鑒別方法和DNA分子標記法。田間小區種植鑒定被認為是鑒定品種真實性和測定品種純度最為可靠、準確的方法,但該法鑒定周期長，氣候、土壤等條件要求高[1]。Draper[2]認為大麥種子醇溶蛋白SDSPAGE電泳圖譜可作為品種的生化“指紋”,用于大麥品種真實性和純度的鑒定。林艷等[3]開發了啤酒大麥種子醇溶蛋白SDSPAGE電泳方法,利用GelPro軟件對電泳圖譜進行條帶分析和比較,建立了每個品種的蛋白質“指紋”,組成加拿大啤酒大麥品種標準圖譜庫,但SDSPAGE法存在分辨率低、鑒定結果不夠準確的問題[4]。游麗華等[5]利用蛋白質組學技術建立澳大利亞啤酒大麥醇溶蛋白標準圖譜,成功鑒定出7個特異蛋白點和34個共同蛋白點,基于蛋白質點構成了3種澳大利亞啤酒大麥的蛋白標志物庫。Scobie等[6]從大麥中提取儲藏蛋白,利用MALDI-TOF質譜分析大麥蛋白質圖譜,可對西澳種植的大麥品種進行快速鑒定。然而大麥經發芽、干燥后外觀特征已發生變化,且醇溶蛋白在蛋白酶的作用下分解,因此麥芽品種鑒定已不適用于傳統的大麥形態鑒別法和SDSPAGE蛋白質電泳鑒定法。浸出率、糖化力、庫爾巴哈值等現有麥芽指標均是反映麥芽混合狀態的平均值,無法體現麥芽到底是單品種構成還是多品種混合組成的具體特征。

隨著DNA分子標記技術的開發和利用,DNA指紋圖譜逐漸成為鑒定種子真實性的重要方法。DNA指紋圖譜法主要依靠AFLP、RAPD、SSR和SNP等類型的DNA分子標記來構建不同品種的指紋圖譜,然后利用具有多態性的標記進行種子真實性檢測。Xue等[7]利用DNAAFLP技術對27種國產及進口大麥品種進行鑒定。Pattemore等[8]基于MALDI-TOF質譜分析從澳麥品種的45個遺傳位點中選出33個信息位點得到唯一的SNPs條形碼,可高效區分澳大利亞的35個啤麥和飼料大麥品種。麥芽中富含多糖、多酚、氨基酸等物質,與大麥相比麥芽DNA的分離純化難度更大。更為關鍵的是麥芽經84～86 ℃高溫焙焦2～3 h后DNA鏈容易斷裂和降解[9],進而影響PCR的擴增效果。

簡單序列重復(simple sequence repeat,SSR),又稱微衛星,是一類由1～5個核苷酸為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯重復序列[10]。微衛星在植物基因組中非常豐富,同一類微衛星可分布于整個基因組的不同位置上。每個座位上重復單位的數目乃至重復單位的序列都有可能不同,因而造成了每個座位上的多態性,這種多態性的信息量是比較高的。由于每個微衛星DNA兩端的序列多是相對保守的單拷貝序列,因而可根據其兩端的序列設計一對特異引物,通過PCR擴增獲得簡單序列重復的多態性。作為第二代分子標記技術,微衛星標記能更好的鑒定物種,已經廣泛的應用在植物物種多樣性和品種鑒定上,包括大麥[1116]、小麥[1720]等。谷方紅等[9]從46對SSR引物中篩選到5個多態性較豐富的引物,可區分實驗的8個大麥及麥芽品種。Lin[21]等利用SSR分子標記進行大麥品種鑒定,基于4對SSR引物建立17種大麥品種的等位基因檢索系統。Southworth[22]基于毛細管電泳構建6對SSR熒光引物反應體系,可區分大多數已注冊的英國大麥品種。Amani等[23]利用11個SSR標記對31個北非六棱大麥品種的遺傳多樣性進行分析。

本研究采用SSR分子標記技術,對21份進口及國產大麥麥芽品種的多樣性進行研究,構建麥芽品種DNA指紋圖譜數據庫,為啤酒企業采購商業麥芽提供可靠的品種鑒定手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

21個啤酒大麥品種 包括5個加拿大大麥、9個澳大利亞大麥、3個法國大麥和4個國產大麥,品種名稱及產地見表1,對上述大麥品種進行微制麥,得到相應的麥芽樣品,微制麥條件,14 ℃浸麥44 h,15 ℃發芽4 d,45～70 ℃干燥5 h,84 ℃焙焦3 h,冷卻后去根處理,4 ℃保存備用。植物DNA提取試劑盒 德國Qiagen公司;Taq DNA聚合酶、dNTPs 美國Thermo Fisher公司;30%(w/v)丙烯酰胺溶液、5×TBE緩沖液、過硫酸銨、四甲基乙二胺、DNA Marker 生工生物工程(上海)股份有限公司;引物 由上海英駿生物技術有限公司合成。

表1 大麥品種名稱列表Table 1 List of barley cultivars used

PCR儀、PAC3000型電泳儀 美國BioRad公司;離心機 德國Sigma公司;高通量組織研磨儀 北京托摩根公司;紫外分光光度計 美國GE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品DNA的提取 取單粒麥芽樣品于2.0 mL離心管中,加入8 mm鋼珠一顆,高通量組織研磨儀1200 r/min粉碎1 min,利用Qiagen植物DNA試劑盒進行提取。提取的DNA用TE溶解,并用瓊脂糖電泳和紫外分光光度計測定所提DNA的純度與濃度。將各材料DNA濃度稀釋到20 ng/μL作為PCR反應體系的模板,置于20 ℃下保存備用。

1.2.2 SSR引物合成及反應條件 根據相關報道[2425],從大麥7條染色體中選擇105對SSR引物,以8個麥芽品種的DNA為模板,每對引物重復實驗2次,PCR反應體積20 μL,含MgCl22.5 mmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,正向引物、反向引物各0.5 μmol/L,Taq DNA聚合酶1.0單位,1×PCR緩沖液4 μL(不含Mg2+),樣品DNA 20 ng。PCR反應程序為:94 ℃預變性3 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個循環,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.3 產物分離 擴增產物在6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上110 V恒壓電泳分離2 h,最后用硝酸銀法進行染色[26]。

1.3 數據處理

對一個給定的SSR引物,不同的品種會同時存在幾個等位基因,根據等位基因的大小,最小的定為1,然后根據分子量的大小依次定位為2、3、4等[21],擴增片段的分子量大小根據DNA Marker確定。

2 結果與分析

2.1 多態性引物篩選

從21種麥芽中選擇8個來自各國的代表性品種,對7條染色體中選擇的105對SSR引物進行多態性分析,綜合考慮引物鑒別能力、擴增效果及染色體分布情況,選擇多態性高、穩定性好的引物作為初篩引物。根據引物擴增的穩定性及多態性,初篩得到6對帶型清晰、重復性好的SSR多態性引物,詳見表2。

表2 引物名稱及序列信息Table 2 Primer sequences and chromosome locations

2.2 SSR標記多態性分析

利用這6對初篩引物直接對21種麥芽樣品進行位點多態性分析。從聚丙烯酰胺凝膠電泳圖中選擇擴增產物清晰、重復性好的擴增條帶作為等位基因位點用于品種多樣性分析。結果表明,6對引物共檢測出35個等位基因,每對引物的等位基因3～10個不等,平均每個引物產生5.83個等位基因,具有良好的多態性。其中,位點HVM68多態性最豐富,在160～300 bp之間包括10個等位基因,見圖1;位點scssr03907多態性其次,在150～200 bp之間含有8個等位基因;位點scssr07759在180～220 bp之間含有4個等位基因,見圖2;位點scssr10148多態性最低,在180～270 bp僅含有3個等位基因。這些位點等位基因數量豐富,適用于品種的基因分型,有利于麥芽品種之間的指紋識別和品種區分。

圖1 引物HVM68對21種麥芽樣品的擴增結果Fig.1 Amplifications of 21 cultivars using primer HVM68注:1～21:Copeland,Newdale,Flagship,Buloke,港啤,Metcalfe,Hindmarsh,Sloop,Cervoise,甘啤4號,墾啤7號,Gairdner,Vlamingh,,Commander,Kendall,Meredith,Baudin,單二,Hamelin,Sebastian,Prestige。

圖2 引物scssr07759對21種麥芽樣品的擴增結果Fig.2 Amplifications of 21 cultivars using primer scssr07759注:M:DNA Marker,1～21:Metcalfe,Newdale,Kendall,Baudin,Gairdner,Hindmarsh,Buloke,Sloop,Prestige,Meredith,Vlamingh,Sebastian,Commander,Copeland,Hamelin,Flagship,Cervoise,甘啤4號,墾啤7號,單二,港啤。

利用6對SSR引物,可對本研究實驗的21種麥芽中的7個品種進行直接區分,如位點scssr07759的等位基因3可將Sloop與其它品種區分開;位點scssr03907的等位基因可直接區分Baudin、Prestige和甘啤4號;位點Bmag0120的等位基因5可將Vlamingh和其它品種區分開;位點HVM68可直接區分Meredith、Hamelin、Sebastian和港啤4個品種。

2.3 DNA指紋圖譜的建立

根據SSR擴增產物在聚丙烯酰胺凝膠電泳上的相對位置,對每個引物的等位基因帶型用阿拉伯數字編號,將每個品種指紋圖譜所對應的編碼按特定的引物順序排列起來,就構成了代表各品種身份的特征指紋代碼,如在6對引物下加麥Copeland指紋代碼為351128,澳麥Gairdner的指紋代碼為334845。綜合擴增產物的凝膠電泳圖譜和等位基因編碼,就構成了每個麥芽品種的指紋圖譜庫,以此作為判定麥芽品種真實性的重要依據。本研究利用6對多態性豐富的SSR引物可準確鑒別的21個麥芽品種,各麥芽品種的特征指紋代碼見表3。如檢測某麥芽是否是加麥Metcalfe,可先用6對多態性引物對待測麥芽樣品和對照Metcalfe的DNA進行PCR擴增,聚丙烯酰胺凝膠電泳及硝酸銀染色,利用DNA標準分子量對待測麥芽的帶型進行分析,將帶型所對應的代碼按引物順序排列起來,與指紋數據庫中標準麥芽Metcalfe的指紋代碼和電泳圖譜進行比對,即可直觀的判定出待測樣品是否是Metcalfe,從而實現麥芽品種真實性的判斷。

表3 21種麥芽等位基因分析Table 3 The alleles detected for 21 malt varieties

表4 21種麥芽品種區分的等位基因組合Table 4 An allelebased combination for identification of 21 malt varieties

2.4 麥芽品種的區分

21個麥芽品種中,利用HVM68和scssr07759位點可實現14種麥芽的彼此區分,增加scssr03907位點后可區分品種增加到20種。眾多位點中HVM68多態性最豐富,包括10個等位基因,可將21種麥芽分成10類,如利用等位基因5可將澳麥Commander和Gairdner與其它品種區分開,結合scssr07759位點可完全區分這兩個品種。因此,僅需要4對核心引物(HVM68、scssr07759、scssr03907和Bmac0030)的組合就可以實現21個麥芽品種的區分。研究表明,不同品種麥芽的等位基因的差異不一,同一國家的某些品種較為接近,加麥Metcalfe和Meredith在4個位點上等位基因完全一致,同為國產大麥的單二和港啤在4個位點上等位基因也完全一致。而加麥Metcalfe與澳麥Hindmarsh在兩個多態性最豐富的位點HVM68和scssr07759上也完全一致,分別為7415和7414,需要4個位點組合才能完全區分。但隨著麥芽品種范圍的擴大,6對引物組合的鑒定能力可能會逐漸降低,某些品種間的指紋圖譜可能完全相同,就需要增加引物組合的數量來提高品種間的區分能力。因此引物篩選中得到的其它多態性SSR位點,可作為擴展引物提高方法的準確性,也為識別其它麥芽品種提供了更多選擇。

3 結論

使用核心引物組合法進行麥芽品種DNA指紋圖譜分析,從105對SSR引物中篩選到6對多態性豐富的SSR引物,每對引物的等位基因3～10個不等,平均每個引物產生5.83個等位基因。利用6對多態性豐富的SSR構建21個麥芽品種的指紋數據庫,僅需4對核心引物就可以實現21個麥芽品種的區分,該法檢測成本低,簡單方便。

本課題以麥芽為研究對象,構建國內啤酒企業使用的主要麥芽品種的指紋數據庫,在分子水平上給每個品種一個能準確表明其身份的指紋信息,實現主要麥芽品種的真實性鑒定,為啤酒企業的麥芽采購提供技術支持。

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