凝結芽孢桿菌13002的益生特性

金 迅,劉冬梅,阮 暉

(1.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058;2.華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

益生菌是指能通過改善腸道微生物菌群落平衡而對機體健康有促進作用的微生物制品或其它物質[1]。其益生特性主要包括:無毒、無害,安全無副作用;具有改善機體內菌群平衡的能力;對體內抑制因素、不良環境具有抵抗力;可以分泌消化酶類和抑菌物質;具有較高穩定性和臨床有效性,能用于大量生產[23]。益生菌因其益生特性被廣泛應用于保健、醫藥、食品等眾多行業。

凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)為革蘭氏陽性兼性厭氧菌,菌體呈桿狀,芽孢端生,無鞭毛。最適生長溫度為40～50 ℃,最適生長pH為6.6～7.0,具備諸多益生菌的優點[47]。從工業生產的角度講,凝結芽孢桿菌屬嗜溫菌,能在較高溫度下進行發酵培養,既降低了培養環境為適應菌株正常生長需要降溫帶來的能源和成本損耗,也降低了雜菌污染的可能性。

凝結芽孢桿菌非人體腸道固有微生物。進入人體后,其益生特性主要體現在三個方面:促進機體消化、調節消化道微生態平衡及改善機體免疫功能[89]。凝結芽孢桿菌可通過促進消化酶分泌、自產多種代謝物質、降解高分子化合物等方式促進機體對營養物質的消化吸收。ASOKANS等[10]研究表明凝結芽孢桿菌能在較大的溫度和pH范圍內產生蛋白酶。另外,凝結芽孢桿菌進入腸道之后能通過消耗游離氧,抑制大部分需氧型致病菌的生長,促進腸道微生物菌群平衡[11]。Czaczyk等[12]研究發現凝結芽孢桿菌對鐮刀菌屬病原真菌及麥角固醇類物質的合成具有一定的抑制作用。眾多研究表明,凝結芽孢桿菌能夠增強吞噬細胞分泌和吞噬能力,加快免疫器官的成熟,調控細胞因子分泌,誘導NK細胞表達[13]。

近年來,凝結芽孢桿菌已廣泛應用于水生動物、禽畜類、臨床等多個方面[14]。王彥波等[15]指出凝結芽孢桿菌能夠減緩水體富營養化,增強對病原微生物抗藥性;趙必遷等[16]研究表明凝結芽孢桿菌能顯著增加雞的產蛋率,降低死亡率;La Rosa等[17]則證明凝結芽孢桿菌可用于維持腸道菌群平衡,治療腹瀉,調節血脂血糖。

前期篩選分離得到的一株芽孢桿菌13002,經鑒定為凝結芽孢桿菌;經急性毒理實驗證實安全無毒[18]。在此基礎上,本研究對作為潛在益生菌的凝結芽孢桿菌13002進行了耐高溫、耐膽鹽、耐酸、抗菌活性、耐藥性五方面益生特性的研究,證明其具備實際應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

凝結芽孢桿菌13002(Bacilluscoagulans13002) 由華南理工大學食品科學與工程學院食品質量與安全系從豆瓣醬中篩選并保藏;金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 均由華南理工大學食品科學與工程學院食品質量與安全系保藏;LB培養基、麥芽汁培養基 廣東環凱微生物科技有限公司;瓊脂粉 健陽生物科技有限公司;牛膽鹽 北京索萊寶科技有限公司;胃蛋白酶、青霉素G鈉 百瑞金生物科技有限公司;鹽酸 廣州化學試劑廠;鏈霉素、鹽酸四環素 廣州碩恒生物科技有限公司;實驗所用試劑 均為分析純;生理鹽水、膽鹽溶液、人工胃液、抗生素溶液(青霉素溶液、鏈霉素溶液、四環素溶液) 按文獻方法配制[19]。

JJ200Y型電子天平 美國雙杰兄弟(集團)有限公司;SPX250BZ型生化培養箱、HZQX100型恒溫振蕩培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;SWCJ1F型超凈工作臺 臺蘇凈集團安泰公司;JW3021HR型高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;XW80A型旋渦混合器 上海精科實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種培養 將已活化好的凝結芽孢桿菌13002,按照6%(v/v)接種濃度,接入裝有100 mL LB液體培養基的250 mL錐形瓶中,置于45 ℃、180 r/min搖瓶培養24 h,得培養液。

1.2.2 高溫耐受性測定 分別取1 mL培養液移入裝有經45 ℃加熱處理的9 mL生理鹽水試管中,在不同設置溫度下(45、60、70、80 ℃)水浴加熱10 min,冷卻后用稀釋涂布平板法測定活菌總數(CFU/mL),并以未進行水浴加熱(45 ℃)條件下的測定值作為空白對照,計算菌種存活率。

存活率(%)=實驗組活菌總數/對照組活菌總數×100

1.2.3 膽鹽耐受性測定 按照1.2.1中方法制備培養液。根據動物腸道環境和食糜消化規律[21],選取膽鹽濃度0.3%(w/v)的濃度作為耐受點;分別取10 mL培養液移入裝著90 mL牛膽鹽濃度為0.3% LB液體培養基的250 mL錐形瓶中,于45 ℃、180 r/min培養0、4、8、12、24 h,用稀釋涂布平板法測定活菌總數(CFU/mL),并以0 h測定值作為空白對照,計算菌種存活率。

1.2.4 酸耐受性測定 按照1.2.1中方法制備培養液。根據胃液pH特點及食糜在胃部消化規律[20],選取pH2.0作為耐受點;分別取10 mL培養液移入裝著90 mL pH2.0人工胃液的錐形瓶中,于45 ℃、180 r/min培養0、1、2、3、4 h,采用稀釋涂布平板法測定不同耐受時間下樣液所對應活菌總數(CFU/mL),并以0 h測定值作為空白對照,計算菌種存活率。

1.2.5 對有害菌抑制活性測定 按照1.2.1中方法制備培養液。取一定量培養液,于6000 r/min離心15 min,取上清液。選取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌兩種菌作為實驗菌,采用LB液體培養基進行培養,在37 ℃、180 r/min條件下搖瓶培養24 h,制成菌懸液。采用牛津杯法[21]測定凝結芽孢桿菌13002抑菌活性,吸取200 μL不同菌懸液到LB固體培養基上,用無菌玻耙涂布均勻;將培養皿均分為三個扇形區域,在每個區域中心置放一個牛津杯,待放置穩定后分別滴加上述所得上清液200 μL;用保鮮膜包好培養皿,在4 ℃ 冰箱中放置12 h,待菌液充分擴散;再于37 ℃條件培養48 h,觀察抑菌效果并測量抑菌圈直徑。

1.2.6 抗生素耐藥性測定 按照1.2.1中所示的方法和條件培養24 h,得培養液。選取青霉素、鏈霉素、四環素作為實驗指示抗生素,并分別配制成50、50、10 mg/mL。采用試管二倍稀釋法[22]測定凝結芽孢桿菌13002對抗生素的耐藥性,取10支5 mL試管,以0號管作為對照,不添加抗生素,每只試管均添加1 mL培養基,1號管添加進1 mL抗生素溶液,充分混勻后吸取1 mL樣液加入第2只試管中,以此類推,以二倍稀釋到最后一支試管,最后一支試管棄去1 mL樣液,每一支試管充分吹打均勻;再往每支試管中分別添加100 μL菌培養液,于45 ℃、180 r/min條件培養24 h;溶液澄清,不出現渾濁的最低抗生素濃度即為該抗生素對凝結芽孢桿菌13002的MIC值,并采用稀釋涂布平板法進行驗證,活菌總數減少至不再出現的最低抗生素濃度即為MIC值。

1.3 數據處理

實驗過程每組實驗做3組平行。采用Origin 8.0進行數據計算及繪圖。

2 結果與分析

2.1 高溫耐受性

實際研究和生產當中,高溫對益生菌及其制品的活性具有一定不良影響。因此,選取不同的高溫條件,研究了細胞高溫耐受性特性,結果如圖1所示。

圖1 耐受溫度對凝結芽孢桿菌13002存活率的影響Fig.1 Effect of tolerant temperatures on the growth of Bacillus coagulans 13002

由圖1可知,45 ℃凝結芽孢桿菌13002的活菌總數為1.120×108CFU/mL(對照),隨溫度上升,存活率呈現下降趨勢。60 ℃條件下存活率可達到92.9%,至80 ℃條件下存活率仍可達到72.3%。實驗結果說明:凝結芽孢桿菌13002具備較好的高溫耐受性。而徐賢[19]研究表明,凝結芽孢桿菌C8在80 ℃條件下作用10 min,存活率為41.7%,遠低于本研究中的凝結芽孢桿菌存活率;王艷萍等[23]研究表明,一株凝結芽孢桿菌TQ33在60 ℃和80 ℃條件下分別進行10 min濕熱處理,存活率分別達到84.8%和78.9%;可見本研究中凝結芽孢桿菌13002在60 ℃條件下具有更好的耐熱性,但隨溫度上升,耐熱能力下降稍快,但同樣具有良好的抗熱性能。若將該菌株應用于實際生產,則可以抵御高溫處理的影響,在生產過程中保持較好的活性。

2.2 膽鹽耐受性

膽鹽是腸道中參與脂肪消化和吸收的主要成分,濃度主要在0.03%～0.3%范圍內波動,能夠刺激腸道蠕動,抑制非腸道菌群的生長[24]。菌種是否具有耐膽鹽的性質決定了其在動物腸道中的存活率,對宿主健康起促進作用。

由圖2可知,以0.3%的膽鹽作用0 h測得的凝結芽孢桿菌13002活菌總數為對照(1.290×108CFU/mL),隨膽鹽作用時間的延長,活菌總數不斷減少,存活率也呈現下降趨勢,但下降速率不斷減緩。作用4 h時,活菌總數依然在108CFU/mL以上,存活率達到83.7%;作用12 h時,活菌數降低為69.8%。膽鹽作用24 h的活菌總數出現反彈,存活率不降反升,達到81.4%,這可能是因為在培養基營養充足條件下,凝結芽孢桿菌13002開始適應并增殖。

圖2 膽鹽對凝結芽孢桿菌13002存活率的影響Fig.2 Effect of bile on the growth of Bacillus coagulans 13002

結果表明,凝結芽孢桿菌13002具有較好膽鹽耐受性,培養12 h存活率可達70%左右。食糜消化經過動物胃、腸道之后,排出的時間基本上在8～12 h之間[24],這與膽鹽的作用時間相對應,所以實驗中耐受時間24 h時,膽鹽對菌株生長的抑制效果減弱而使活菌總數上升。因此可以推測,在膽鹽環境中,凝結芽孢桿菌只能在一定時間范圍內起作用。郭小華等[25]研究表明,凝結芽抱桿菌在0.3%的膽鹽液中,生長在開始階段受到了抑制,過一段時間凝結芽抱桿菌能夠適應并且在這種環境中增殖生長;本研究當中凝結芽孢桿菌13002在膽鹽環境中的生長趨勢與前人研究相符。而王金果等[26]研究表明,凝結芽孢桿菌N001在0.9%膽鹽條件下作用24 h,存活率達78.3%,在0.3%膽鹽條件下作用24 h,存活率則達到84.3%,可知其膽鹽耐受性略高于本研究當中的凝結芽孢桿菌13002。以上結果與本實驗凝結芽孢桿菌13002存活率情況具有一致性,可推測凝結芽孢桿菌13002在腸道當中存活和增殖具有較大的可能性和可行性。

2.3 酸耐受性

胃分泌的胃酸讓食物在酸性條件下更易分解成小分子而被機體吸收,營造酸性環境能夠抑制細菌生長,同時增加胃蛋白酶活性,幫助消化吸收。正常情況下,胃酸的pH在2.0以下,胃排空時間在2～4 h[27]。菌種是否具有耐酸的性質,決定其是否能在胃中存活更久。根據食糜消化規律,模擬胃環境,配制pH2.0的人工胃酸,研究了不同作用時間對菌種增長的影響,結果如圖3所示。

圖3 酸作用時間對凝結芽孢桿菌13002存活率的影響Fig.3 Effect of different time of acid tolertance on the growth of Bacillus coagulans 13002

由圖3可知,以0 h測得的菌種活菌總數為參照,即為0.950×108CFU/mL,隨耐酸時間的增加,菌種的活菌總數不斷減少,存活率也呈現下降趨勢。耐受時間2 h,活菌總數為0.500×108CFU/mL,存活率為52.6%,到4 h時,存活率依然達40.0%。

結果表明,凝結芽孢桿菌13002具備較好的酸耐受性。在胃排空時間范圍內,菌種存活率能達到40%及以上;隨著時間延長,胃酸抑菌效果可能呈現出減弱的趨勢。王金果等[27]研究表明,凝結芽孢桿菌N001在pH2.0條件下放置6 h,存活率可達48.2%,且隨著pH上升,存活率增加,可知N001具有較好的活性。本研究當中凝結芽孢桿菌13002在相同處理條件下的存活率略低于N001,但也證明該結果與前人研究結果具有一致性。從以上結果可推測在實際應用當中,凝結芽孢桿菌在通過胃部的時候,能夠有足夠的數量,從而保持活性,發揮益生作用。

2.4 對有害菌的抗菌活性

凝結芽孢桿菌能產生乳酸等代謝產物,李剛等[28]研究證明其代謝產物具有抑菌特性。菌種代謝產物是否具有抑菌性質,決定其與有害菌共同生存競爭時是否具有優勢,從而對宿主健康起促進作用。以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌為指示菌株,研究了凝結芽孢桿菌13002的抗菌活性。其中,金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌,兼性厭氧型;大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,兼性厭氧型。結果如表1所示。

表1 凝結芽孢桿菌13002對有害菌的抗菌活性Table 1 The antibacterial activities of Bacillus coagulans 13002 to harmful bacteria

由表1可知,凝結芽孢桿菌13002代謝產物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為13.650 mm,大腸桿菌的為14.367 mm;對大腸桿菌的抑菌能力相對較強,對金黃色葡萄球菌的相對較弱。

結果表明,凝結芽孢桿菌13002對細菌具備一定的抑菌能力,對不同種類的細菌抑菌效果存在差異,但抗菌活性均并不十分明顯。凝結芽孢桿菌13002發酵產L乳酸[18],推測通過代謝產生乳酸抑制有害菌的生長。

余岳等[20]對一株凝結芽孢桿菌芽孢抗逆性進行研究,以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌作為指示菌種,得到金黃色葡萄球菌對應測得的抑菌圈直徑為11 mm,大腸桿菌的為14 mm。該結果與本實驗結果相近,說明凝結芽孢桿菌對大腸桿菌的抑菌能力強于對金黃色葡萄球菌,同時也一定程度證明本實驗具有參考價值。

2.5 對抗生素的耐藥性

根據凝結芽孢桿菌性質及抗生素分類,研究了凝結芽孢桿菌13002對青霉素、鏈霉素、四環素三種抗生素的耐藥性,結果如表2～表4所示。

表2 青霉素對凝結芽孢桿菌13002生長的影響Table 2 Effect of penicilin on the growth of Bacillus coagulans 13002

表3 鏈霉素對凝結芽孢桿菌13002生長的影響Table 3 Effect of streptomycin on the growth of Bacillus coagulans 13002

由表2～表4可知,通過試管二倍稀釋法觀察及稀釋涂布平板法驗證后,隨抗生素濃度下降，溶液先澄清后不斷渾濁。證明凝結芽孢桿菌13002在抗生素濃度較高時，生長受到明顯抑制；之后不斷進行稀釋，抑制作用減弱，到一定程度菌株開始生長。青霉素實驗濃度為0.781 mg/mL時,凝結芽孢桿菌13002不生長,再稀釋二倍則出現了生長現象,則可確定青霉素的MIC濃度。同理可得鏈霉素、四環素MIC濃度分別為0.391和0.039 mg/mL。MIC濃度從高到低排序依次是:青霉素、鏈霉素、四環素。

結果表明,凝結芽孢桿菌13002對不同種類抗生素的敏感程度不同,耐藥效果從高到低排序依次為:青霉素、鏈霉素、四環素。郭慧玲等研究了乳酸桿菌屬對抗生素的耐藥性[29],在此對凝結芽孢桿菌和部分乳酸桿菌對抗生素的耐藥性做初步比較。植物乳桿菌對青霉素、鏈霉素、四環素的MIC范圍分別處于1.25～80、80～1280、40 μg/mL;干酪乳桿菌對青霉素、鏈霉素、四環素的MIC濃度范圍分別在1.25～20、10～1280、0.625～80 μg/mL;則凝結芽孢桿菌13002對青霉素的耐藥性要好于植物乳桿菌和干酪乳桿菌,對四環素的耐藥性與乳酸桿菌相似,乳酸桿菌對鏈霉素的耐藥性,部分好于凝結芽孢桿菌13002,部分較差。

3 結論

本實驗通過對凝結芽孢桿菌13002的研究,可得該菌株具有較好的高溫耐受性,在80 ℃條件下作用10 min,存活率可達到72.3%;菌種具有較好的膽鹽耐受性,培養12 h存活率可達69.8%;菌種具有較好的酸耐受性,pH2.0的胃酸條件下作用4 h,菌種存活率能達到40.0%;菌種對細菌具備一定的抑菌能力,對不同種類的細菌抑菌效果存在差異;菌種對不同種類抗生素的耐藥性不同,作用從高到低排序依次為青霉素、鏈霉素、四環素,對應的MIC值為0.781、0.391、0.039 mg/mL。凝結芽孢桿菌13002具有良好的益生特性,具有很好的開發和研究前景。

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