短梗霉篩選鑒定及溶氧對其發酵的影響

劉 濱,于海峰

(1.齊魯工業大學食品科學與工程學院,山東濟南 250353;2.中國科學院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室,北京100190)

短梗霉(Aureobasidiumspp.)是一種形態特征受環境影響顯著的生活史復雜的腐生真菌。其分布范圍非常廣泛,通常分布于土壤、植物、木材、混凝土、墻壁的表面[1]。在鹽堿地[2]、沿海水域、南極洲水域的海洋沉積物[3]及紅樹林沼澤[4]中也都發現有短梗霉的存在。短梗霉歸屬于半知菌門(Deuteromycotina)、叢梗孢目(Moniliates)、短梗霉菌屬(Aureodacidium)。短梗霉屬被劃分為三個種:出芽短梗霉(A.pullulans)、A.leucospermi和A.proteae。

短梗霉的發酵產物主要有聚蘋果酸[5](Poly malic acid,PMLA)及蘋果酸[67]、普魯蘭多糖[89]、黑色素[10]、重油[1112]等。其中,聚蘋果酸是以蘋果酸為唯一單體聚合而成的新型生物可降解聚酯型聚合物[13],可作為新型藥物載體與微膠囊材料、生物醫學材料、食品包裝材料等,其單體物蘋果酸酸味清爽持久,作為酸味劑和風味增強劑廣泛應用于高檔飲料、調味品、糖果等食品中;在食品保藏方面,蘋果酸還具有抗菌性及保鮮性,常用于果蔬及其制品的保鮮防腐,延長食品的貯存期與貨架期;此外,蘋果酸在生物煉制工程中是重要的四碳化合物[14]。

目前文獻中大多以出芽短梗霉(A.pullulans)作為研究對象,對于短梗霉屬中的其他種報道較少,因此,為擴大短梗霉屬研究范圍及為短梗霉合成聚蘋果酸的代謝提供新菌種,本文通過分離篩選獲得兩株短梗霉菌株,其中ipe3為以聚蘋果酸為主要發酵產物的出芽短梗霉,ipe5為以蘋果酸為主要發酵產物的短梗霉,ipe5發酵產生蘋果酸具有時間短,生產效率高的特點。文獻中關于短梗霉發酵產酸的條件大都采用溫度25 ℃、pH6.0條件。但發酵過程中對溶氧的控制存在較大的差異,從10%到90%不等[1517]。Cao[18]等、Xia等[19]均報道了出芽短梗霉(A.pullulans)在70%溶氧條件下聚蘋果酸產量達到最大值。由此為依據,本文對比短梗霉在高溶氧(70%)與低溶氧(10%)條件下聚蘋果酸及蘋果酸產量的差別,以期為短梗霉溶氧調控發酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

篩菌樣品 實驗所用的樣本取自中科院過程所周邊的新鮮樹葉、落葉、土壤及腐殖葉;馬鈴薯 購自北京超市發連鎖股份有限公司;蘋果酸標準品 純度>99%,美國SigmaAldrich公司;瓊脂 分析純,北京化學試劑公司;胰蛋白胨 分析純,Oxoid公司;亞甲基藍 分析純,天津市津科精細化工研究所;葡萄糖、甘露醇、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、檸檬酸、氯化鉀、碳酸鈣 均為分析純,西隴科學股份有限公司;硫酸 分析純,北京化工廠。

真菌基因組提取試劑盒、PCR膠回收試劑盒 北京三博遠志生物技術有限公司；高速冷凍離心機 德國sigma公司;生物傳感分析儀SBA40C 山東省科學院生物研究所;高效液相色譜儀(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)LC20A 日本島津公司;色譜柱Aminex?HPX87H 美國BioRad公司;發酵罐BioFio?110 美國NBS公司;Perkin Elmer GeneAmp 9600 PCR儀 ABI公司;ABI 3730核酸分析儀 ABI公司;電泳儀 北京市六一儀器廠;LDZX75KBS蒸汽式滅菌鍋 上海申安醫療器械廠;FA2004電子天平 梅特勒托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的制備 富集培養基:甘露醇10%,NaNO30.1%,KH2PO40.05%,MgSO4·7H2O 0.02%,檸檬酸0.2%。

篩選培養基:葡萄糖12%,NaNO30.1%,KH2PO40.01%,KCl 0.05%,MgSO4·7H2O 0.02%,瓊脂1.5%,亞甲基藍0.002%。

保藏培養基(葡萄糖馬鈴薯培養基):馬鈴薯20%,葡萄糖2%，瓊脂2%。

搖瓶種子培養基:葡萄糖8%,NaNO30.2%,KH2PO40.01%,MgSO4·7H2O 0.02%,KCl 0.05%,胰蛋白胨0.1%,121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基:葡萄糖15%,NaNO30.2%,KH2PO40.01%,MgSO4·7H2O 0.02%,KCl 0.05%,胰蛋白胨1.5%。胰蛋白胨與其他成分分開滅菌,接種前再混在一起。搖瓶發酵培養基中加3% CaCO3。

1.2.2 菌株的篩選

1.2.2.1 富集 稱取10 g樣本置于富集培養基中進行富集培養,培養條件:25 ℃,120 r/min,培養48 h[20]。

1.2.2.2 初篩 用微量移液槍吸取100 μL富集培養液,梯度稀釋6倍后,涂布于含有亞甲基藍的篩選培養基上,25 ℃恒溫培養箱中倒置培養4 d,選取菌落周圍有透明圈,菌落呈黑色的菌株進行劃線培養分離純化。

1.2.2.3 復篩 挑取一環菌株接種于100 mL種子培養基中,25 ℃、120 r/min振蕩培養2 d。待種子液培養完成后,按10%接種量接入發酵培養基中25 ℃、120 r/min振蕩培養4 d(與上罐發酵時間一致),發酵結束后檢測發酵液中聚蘋果酸含量。

1.2.3 斜面種子培養方法 取一環經復篩后確定產生聚蘋果酸的純化菌株,劃線于已滅菌的保藏培養基斜面上,25 ℃培養5 d至斜面均勻布滿菌體,收集后保藏于4 ℃冰箱。

1.2.4 搖瓶種子培養方法 用接種環均勻挑取大小一致的斜面種子接種于100 mL種子培養基中,25 ℃,120 r/min振蕩培養2 d。每次實驗搖瓶種子做四個平行,上發酵罐前選取兩瓶種子液充分混合,接入發酵罐后測定發酵初始(0 h)菌體濃度,保證初始菌體濃度為0.5 g/L。

1.2.5 2.7 L發酵培養方法 將200 mL搖瓶種子轉接于121 ℃滅菌20 min的2.7 L發酵罐內,發酵培養基裝液量1.8 L,發酵過程中維持pH恒定為6.0,發酵溫度25 ℃,初始通氣量3 L/min,發酵過程中維持溶氧恒定為70%和10%。

溶氧電極的校正[18]:101.325 kPa,25 ℃下,將在飽和亞硫酸鈉溶液中穩定值標定為DO電極的零點(DO 0%);接種前,當培養基溫度為25 ℃,pH為6.0時,將通氣量調整為5,轉速1000 r/min時標定為培養基中的最大DO 100%。在發酵過程中,溶氧的測定值為在標定零點和飽和濃度的相對值。

1.2.6 菌種鑒定 用真菌基因組提取試劑盒提取基因組,選取ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGC GG ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC為通用引物,進行18S rDNA的PCR擴增。

35 μL反應體系:DNA模板2 μL,10 μmol/L ITS1 1 μL,10 μmol/L ITS4 1 μL,Taq 0.5 μL,10×buffer 3.5 μL,dd H2O 26.3 μL,空白對照不加入DNA模板。

PCR擴增條件:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個循環;最后72 ℃延伸5 min。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物,用PCR膠回收試劑盒純化,純化產物經北京三博遠志生物技術有限公司測序。測序結果在GenBank中進行比對,選取近似菌種序列,用MEGA6軟件構建系統發育樹。

1.2.7 菌體濃度的測定 發酵過程中每隔12 h取樣,6 mL發酵液在10000 r/min下離心10 min,上清液用于其他成分的測定,沉淀物分別用6 mL超純水洗滌三次,90 ℃下烘干至恒重,稱量計算菌體濃度。

1.2.8 蘋果酸及聚蘋果酸濃度的測定 蘋果酸濃度采用HPLC分析,聚蘋果酸濃度由水解液和上清液中蘋果酸濃度差值獲得。聚蘋果酸水解方法[15]:分別取1 mL上清液與1 mL 2 mol/L硫酸放入水解反應釜中,在90 ℃下反應12 h,反應結束后用2 mL,2 mol/L氫氧化鈉中和反應液,用HPLC測定蘋果酸的含量[21],色譜柱為Aminex?HPX87H,流動相:2.5 mmol/L H2SO4,流速0.6 mL/min,柱溫50 ℃。流動相減去未水解上清液中蘋果酸的含量即為聚蘋果酸的含量。

1.2.9 殘糖濃度的測定 用安裝有葡萄糖氧化酶膜的SBA40C生物傳感儀測定葡萄糖濃度。取經離心后的上清液,將上清液稀釋200倍,測定時首先注射25 μL標準液進行標定,標定結束后用取樣針吸取25 μL待測液進行測定。

1.2.10 發酵性能計算

1.2.10.1 菌體濃度

式(1)

式(1)中:X2指菌體和離心管重量(mg);X1指空離心管重量(mg)。

1.2.10.2 糖酸轉化率

式(2)

式(2)中,Px指糖酸轉化率(g/g),X2指發酵某一時間點時酸濃度(g/L),X1指發酵初始時酸濃度(g/L),G1指發酵初始時培養基中葡萄糖濃度(g/L),G2指發酵某一時間點時培養基中葡萄糖濃度(g/L)。

1.2.10.3 菌體得率

式(3)

式(3)中,Py指菌體得率(g/g),X2指發酵某一時間點時酸濃度(g/L),X1指發酵初始時酸濃度(g/L),B2指發酵某一時間點時菌體濃度(g/L),B1指發酵初始時菌體濃度(g/L)。

1.2.10.4 生產強度

式(4)

式(4)中,PZ指生產強度[g/(L·h)],X2指發酵某一時間點時酸濃度(g/L),X1指發酵初始時酸濃度(g/L),t指發酵時間(h)。

1.2.10.5 葡萄糖消耗速率

式(5)

式(5)中,Pn指葡萄糖消耗速率[g/(L·h)],X1指發酵初始時培養基中葡萄糖濃度(g/L),X2指發酵某一時間點時培養基中葡萄糖濃度(g/L),t指發酵時間(h)。

1.3 數據分析

采用Origin 2017軟件作圖,MEG6軟件構建分子進化樹。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

從新鮮樹葉、落葉、土壤、腐殖葉的樣本中經富集培養基富集培養后,在亞甲基藍(Methylene Blue,MB)篩選培養基上呈現有透明圈的菌落共計18株,選取出現透明圈的菌株進行劃線分離。將經過劃線分離獲得單菌落的菌株進行搖瓶復篩,發現能夠合成聚蘋果酸的菌株共有兩種,并將其分別命名為ipe3、ipe5。

圖1 亞甲基藍培養基初步篩選菌落Fig.1 Primary screening of fungus by MB medium

2.2 分子生物學鑒定

2.2.1 菌株ipe3 18s rDNA基因序列 測序結果如下:

2.2.2 菌株ipe5 18s rDNA基因序列 測序結果如下:

將ipe5的18srDNA序列進行BLAST比對,發現該菌株僅能鑒定到短梗霉屬,與Aureobasidiumiranianum、Aureobasidiumpullulans、Aureobasidiummelanogenum等同源性有 96%。將ipe5的ITS序列提交到GenBank得到登錄號為KY621468。

2.3 基于18S rDNA序列分析的系統發育樹的構建

用MEGA 6構建分子進化樹,采用Neighbor-Joining法的Complete Deletion模式建樹,用Bootstrap進行檢驗,并重復1000次構建系統發育樹，見圖2。

圖2 ipe3、ipe5系統進化樹Fig.2 The tree of phylogenetic evolution of ipe3,ipe5

2.4 ipe3、ipe5發酵性能測定

2.4.1 ipe3、ipe5 70%溶氧發酵 ipe3發酵性能曲線如圖3a及3c所示,在整個發酵周期內碳源充足,菌體生長沒有明顯的穩定期,發酵初始葡萄糖濃度為167 g/L,發酵結束時,培養基中葡萄糖剩余量為18.75 g/L,葡萄糖消耗速率為1.54 g/(L·h),菌體濃度為46.57 g/L。發酵產物聚蘋果酸,其產量、糖酸轉化率、菌體得率、生產強度分別為10.027 g/L、0.0681 g/g、0.2223 g/g、0.104 g/(L·h)。發酵產物蘋果酸,其產量、糖酸轉化率、菌體得率、生產強度分別為5.7 g/L、0.038 g/g、0.13 g/g、0.06 g/(L·h)。Manitchotpisit等[22]從泰國和冰島地區分離篩選出芽短梗霉,結果發現聚蘋果酸的最低產量為4 g/L,最高產量為11 g/L。Ma等[23]從紅樹林沼澤中分離出一株高產聚蘋果酸的短梗霉菌株Aureobasidium sp. P6,該菌株最高可產118.3 g/L的Ca2+PMLA,本文分離得到的出芽短梗霉ipe3聚蘋果酸產量為10.027 g/L,屬于聚蘋果酸低產菌,這為聚蘋果酸合成代謝途徑的研究提供了菌種。

圖3 ipe3(a)、ipe5(b)70%溶氧下發酵性能及蘋果酸含量(c)Fig.3 Fermentation properties of ipe3(a),ipe5(b)and the malic acid content(c)under 70% dissolved oxygen

ipe5的生長曲線如圖3b及3c所示,在整個發酵周期內,菌體生長沒有明顯的穩定期,發酵初始葡萄糖濃度為166 g/L,在發酵48 h時培養基中葡萄糖已消耗完全,葡萄糖消耗速率為3.46 g/(L·h),培養基中蘋果酸產量達到最大值為57.24 g/L,蘋果酸糖酸轉化率、菌體得率、生產強度分別為0.3447 g/g、2.14 g/g、1.19 g/(L·h)。48 h之后發酵產物蘋果酸濃度降低,這是因為L蘋果酸會直接進入TCA循環,作為能源物質和碳源,用于菌體生長及代謝合成。發酵結束時,ipe5聚蘋果酸產量為0.3 g/L,蘋果酸產量為34.86 g/L。

生物法合成蘋果酸主要有三種方式:第一種方式是通過一步發酵法直接利用葡萄糖發酵合成蘋果酸,此方法蘋果酸的生產菌大多是曲霉菌屬[24](Aspergillus)、青霉菌屬[14](Penicillium)、結合酵母屬[24](Zygosaccharomyces)、釀酒酵母[25](Saccharomycescerevisiae)或者以大腸桿菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等微生物應用代謝工程技術構建產生蘋果酸的基因工程菌[26]。第二種方式是利用延胡索酸酶將延胡索酸轉化為蘋果酸,此方法應用了細胞固定化技術,將能夠產生延胡索酸酶的菌如釀酒酵母[27](Saccharomycescerevisiae)、貝酵母[28](Saccharomycesbayanus)等。第三種方式是微生物合成聚蘋果酸,通過將短梗霉的發酵產物聚蘋果酸水解獲得單體蘋果酸。Zhang等[15]分離篩選得到一株高產聚蘋果酸出芽短梗霉菌株ZD3d,經10 L發酵罐發酵后獲得57.2 g/L聚蘋果酸,生產強度為0.35 g/(L·h)。Zou等[29]分離篩選獲得一株出芽短梗霉ZX10菌株,經10 L發酵罐發酵獲得41.2 g/L聚蘋果酸并經水解后獲得47.3 g/L蘋果酸,蘋果酸生產強度為0.49 g/(L·h)。本文發現的短梗霉 ipe5是能夠通過一步發酵法直接合成蘋果酸的短梗霉菌株,且具有發酵時間短,生產強度高的特點,生產強度可達1.19 g/(L·h)。由于蘋果酸是聚蘋果酸合成的前體物質,目前有關短梗霉合成與分泌聚蘋果酸的機制尚未完成清楚,高產蘋果酸低產聚蘋果酸菌株ipe5的發現,為探究短梗霉由蘋果酸合成聚蘋果酸的關鍵途徑提供了菌種支持。

2.4.2 ipe3、ipe5 10%溶氧發酵 ipe3在10%溶氧條件下發酵性能如圖4a及4c所示,通過與70%溶氧條件下發酵性能對比可以發現,10%溶氧條件下菌體濃度為41.34 g/L,較70%溶氧條件降低了11.23%。10%溶氧條件下發酵培養基中初始葡萄糖濃度為165.5 g/L,發酵結束時葡萄糖剩余量為70.25 g/L,葡萄糖消耗速率為0.99 g/(L·h),較70%溶氧條件下葡萄糖消耗速率降低了35.71%。10%溶氧條件下聚蘋果酸產量、糖酸轉化率、菌體得率、生產強度分別為5.85 g/L、0.0614 g/g、0.1319 g/g、0.061 g/(L·h),較70%溶氧條件分別降低了41.66%、9.84%、40.67%、41.35%。10%溶氧條件下蘋果酸產量、糖酸轉化率、菌體得率、生產強度分別為2.13 g/L、0.22 g/g、0.052 g/g、0.022 g/(L·h),較70%溶氧條件下分別降低了62.63%、42.11%、56.67%、62.71%。

圖4 ipe3(a)、ipe5(b)10%溶氧下發酵性能及蘋果酸含量(c)Fig.4 Fermentation properties of ipe3(a),ipe5(b)and the malic acid content(c)under 10% dissolved oxygen

ipe5在10%溶氧條件下發酵性能如圖4b及4c所示,通過與70%溶氧條件下發酵性能對比可以發現,發酵48 h時,10%溶氧條件下菌體濃度為16.08 g/L,較70%溶氧條件降低了43.06%;葡萄糖濃度從最初的166 g/L下降至126 g/L,葡萄糖消耗速率為0.83 g/(L·h),較70%溶氧條件葡萄糖消耗速率降低了76.01%;其蘋果酸產量、糖酸轉化率、菌體得率、生產強度分別為9.7 g/L、0.2205 g/g、0.6194 g/g、0.2021 g/(L·h),較70%溶氧條件分別降低了83.05%、36.03%、71.06%、83.02%。發酵結束時,10%溶氧條件下蘋果酸產量為29.30 g/L,較70%溶氧條件降低了15.95%,ipe5在10%溶氧條件下不積累聚蘋果酸。

由以上結果可以看出ipe3與ipe5在10%溶氧條件下聚蘋果酸及蘋果酸的產量及各種發酵指標較70%溶氧條件下的產量及發酵指標均出現降低的趨勢。因此可以說明低溶氧發酵條件抑制短梗霉發酵產酸。此趨勢與Xia等[19]關于溶氧對A.pullulansZD3d聚蘋果酸產量的影響表現出相同的現象。這可能是由于溶氧降低導致生物體能量代謝降低,葡萄糖利用速率降低,進而影響生物體生長和代謝產物的積累[30]。ATP在細胞內是重要的能量物質,為細胞的合成代謝提供了驅動力,在有氧發酵過程中,溶氧水平將直接影響來源于呼吸鏈反應中產生的ATP含量,在合適的溶氧水平下細胞內ATP的產生與消耗趨于平衡[31]。由于出芽短梗霉發酵的最佳溶氧水平為70%[18],因此低于此溶氧水平,細胞代謝速率降低,葡萄糖消耗速率降低,進而影響胞內整體ATP水平的供應,在ATP供應不足的情況下,短梗霉合成蘋果酸及聚蘋果酸的速率下降。

3 結論

從自然界中分離篩選獲得2株短梗霉菌株,經初篩、復篩、分子生物學鑒定,確定為出芽短梗霉和短梗霉。

利用2.7 L發酵罐對兩株野生菌進行發酵性能測定,發現在高溶氧條件(70%)下,ipe3聚蘋果酸及蘋果酸產量分別為10.027 g/L、5.7 g/L;ipe5聚蘋果酸產量為0.3 g/L,蘋果酸產量最高為57.24 g/L。低溶氧條件(10%)下,ipe3聚蘋果酸及蘋果酸產量分別為5.85 g/L、2.13 g/L,較70%溶氧條件下聚蘋果酸及蘋果酸產量分別降低了41.66%、62.63%;ipe5發酵48 h蘋果酸產量為9.7 g/L,較70%溶氧條件下蘋果酸產量降低了83.05%,發酵結束時蘋果酸產量為29.30 g/L,較70%溶氧條件下蘋果酸產量降低了15.95%。因此ipe5為能夠通過一步發酵法直接大量合成蘋果酸的短梗霉菌株,且具有發酵時間短,生產強度高的特點,生產強度可達1.19 g/(L·h),而低溶氧發酵(10%)造成短梗霉酸產量降低,生產強度下降。

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