棘孢木霉液體發酵條件優化

宋巧英,朱振元

(食品營養與安全教育部重點實驗室,天津科技大學食品工程與生物技術學院,天津 300457)

木霉對人類的實用價值和商業價值逐漸被發現,主要因其具有抑菌[1]、產抗生素[2]、產纖維素酶[3]、促生[4]和抗重金屬[5]等作用。尤其綠色木霉如棘孢木霉(T.asperellum)、深綠木霉(T.atroviride)、哈茨木霉(T.harzianum)已被人類認識并利用,且商業化木霉已問世[67]。有研究報道綠色木霉具有產纖維素酶的能力[8],其胞外多糖具有誘導癌細胞凋亡的作用[9]。其中棘孢木霉是一類重要的綠色木霉并具有極大的潛力。棘孢木霉可產生不同的細胞壁水解酶如幾丁質酶、外切β1,3葡聚糖酶、N乙酰氨基葡萄糖苷酶等[10],且具有促進植物防御體系,抵抗黒莢果病[11]及降解農作物鉛含量的作用[12]。傳統的棘孢木霉培養方法是固體培養[13],關于棘孢木霉液體發酵條件優化的報道甚少。本實驗以菌絲體干重和孢子數為指標，通過單因素、正交實驗對棘孢木霉液體搖瓶發酵條件進行優化。旨在降低發酵成本,縮短發酵周期,為棘孢木霉的工業化生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棘孢木霉 天津科技大學生物資源與功能食品實驗室在4 ℃冰箱保存;葡萄糖、蛋白胨、MgSO4、KH2PO4、蔗糖、麥芽糖、乳糖、酵母浸粉、牛肉膏、氯化銨、CuSO4、MnCl2、ZnSO4、FeSO4、HCl、NaOH等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;馬鈴薯、黃豆粉、綠豆粉、全麥粉 市售。

DSX280KB24手提式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;202B恒溫培養搖床 天津歐諾儀器股份有限公司。

1.2 培養基

馬鈴薯瓊脂培養基(PDA):去皮馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,瓊脂18 g,蒸餾水1000 mL。

基礎培養基:葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

黃豆粉培養基:黃豆粉0.25%葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

全麥粉培養基:全麥粉 0.25% 葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

綠豆粉培養基:綠豆粉 0.25% 葡萄糖2%,蛋白胨0.25%,MgSO40.15%,KH2PO40.3%,蒸餾水1000 mL。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化 將菌種接種到配制好的PDA斜面培養基中,26 ℃,培養3 d,重復三次即可進行擴大培養[14]。

1.3.2 單因素實驗

1.3.2.1 不同培養基對菌絲體干重和孢子數的影響 分別取黃豆粉培養基、全麥粉培養基和綠豆粉培養基各100 mL于250 mL錐形瓶中,于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。將活化好的菌種配制成4×108個/mL濃度的孢子懸浮液,每100 mL培養基加樣量為2 mL,于26 ℃,160 r/min培養3 d。將錐形瓶取出,搖勻后取1 mL稀釋100倍,用血球計數板計數,最后得出每毫升發酵液中孢子數,為數據處理方便,以孢子數對數值為指標。然后將發酵液搖勻進行抽濾,得到菌絲體,將菌絲體烘干至恒重,稱量菌絲體的質量,計為菌絲體干重。每個處理設三個重復,結果取其平均值,并計算其標準差。

1.3.2.2 黃豆粉量對菌絲體干重和孢子數的影響 根據上述篩選出的黃豆粉培養基來確定黃豆粉最佳量。在基礎培養基中分別配制含有黃豆粉0.1%,0.2%,0.25%,0.3%,0.35%,0.4%,0.5%的培養基,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.3 不同碳源對菌絲體干重和孢子數的影響 當黃豆粉添加量為0.25%,黃豆粉培養基中分別用2%的蔗糖、麥芽糖、乳糖代替葡萄糖,并做對照。按照1.3.2.1的方法測定孢子數和干重。

1.3.2.4 葡萄糖添加量對菌絲體干重和孢子數的影響 當葡萄糖為碳源,黃豆粉培養基中的葡萄糖分別設置為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.5 不同氮源對菌絲體干重和孢子數的影響 當葡萄糖添加量為3.0%,在篩選出的黃豆粉培養基中分別用0.25%的酵母浸粉、牛肉膏、氯化銨代替蛋白胨,并做對照。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.6 蛋白胨添加量對菌絲體干重和孢子數的影響 當蛋白胨為氮源,黃豆粉培養基中的蛋白胨添加量分別設置為0.1%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.7 不同微量元素對菌絲體干重和孢子數的影響 當蛋白胨添加量為0.75%,黃豆粉培養基中分別用0.15%的CuSO4、MnCL2、ZnSO4、FeSO4代替MgSO4,并做對照。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.8 Mg2+添加量對菌絲體干重和孢子數的影響 當MgSO4為微量元素,黃豆粉培養基中的Mg2+添加量分別設置為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%,按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.9 光照條件對菌絲體干重和孢子數的影響 當Mg2+添加量為0.15%,黃豆粉培養基分別置于完全光照,完全黑暗,自然光照中培養3 d。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.10 溫度對菌絲體干重和孢子數的影響 當自然光照棘孢木霉生長,黃豆粉培養基分別置于20、25、30、35 ℃中培養3 d。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.11 初始pH對菌絲體干重和孢子數的影響 當適合棘孢木霉生長溫度為25 ℃,用0.1 mol/L的HCl和NaOH調節篩選出的最佳培養基的pH,將上述篩選出的黃豆粉培養基的初始pH分別調整為4、6、7、9、11。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.12 裝瓶量對菌絲體干重和孢子數的影響 當適合棘孢木霉生長的培養基初始pH為7時,黃豆粉培養基按每250 mL錐形瓶裝液量分別為40、60、80、100、120、160 mL進行培養。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.2.13 接種量對菌絲體干重和孢子數的影響 當裝瓶量為100 mL時,黃豆粉培養基接種量分別按0.5×106、1×106、2×106、4×106、8×106、16×106個/mL進行培養。按照1.3.2.1的方法測定干重和孢子數。

1.3.3 正交實驗設計因素水平 由上述實驗可知,接種量、裝瓶量、蛋白胨添加量和葡萄糖添加量對干重和孢子數的影響較為顯著。因此在單因素基礎上將這四個因素作為正交實驗設計因素,正交表見表1。

表1 棘孢木霉發酵因素水平Table 1 Factors and levels affecting the fermentation of Trichoderma asperellum

1.4 數據處理

數據分析采用EXCEL和SAS 9.3軟件進行分析,實驗數據以平均值±標準差表示。組間差異用Duncan檢驗。

2 結果與討論

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同培養基對菌絲體干重和孢子數的影響 由表2可知,棘孢木霉在不同培養基中均能生長,且在黃豆粉培養基中生長最旺:菌絲體干重為8.822 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為7.3281。其次是綠豆粉培養基,而在全麥粉培養基中生長最弱。由于黃豆粉中含有大量的蛋白質和碳水化合物,為棘孢木霉的生長提供額外的碳源和氮源。因此選取黃豆粉培養基為培養基。

表2 不同培養基對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 2 Effects of different media on the number and dry weight of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.2 黃豆粉量對菌絲體干重和孢子數的影響 由表3可知,黃豆粉量的不同對菌絲體干重和孢子數的影響有顯著性差異(p<0.05)。隨著黃豆粉量的增加,菌絲體干重和孢子數呈現先增大后減小的趨勢。其中黃豆粉量為0.25%時,干重和孢子數達到最大,其中干重為12.704 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.6232。因此黃豆粉為0.25%。

表3 黃豆粉量對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 3 Effects of soybean powder on dryweight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.3 不同碳源對菌絲體干重和孢子數的影響 由表4可知不同的碳源對菌絲體干重的影響有極顯著性差異(p<0.01),對孢子數有顯著性差異(p<0.05)。其中葡萄糖作為碳源培養基所得菌絲體干重和孢子數達到最大,干重為9.974 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.7782。由于葡糖糖可以被棘孢木霉直接利用,因此選取葡萄糖為碳源。

表4 不同碳源對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 4 Effects of carbon source on dry weight and spore number of mycelia

2.1.4 葡萄糖添加量對菌絲體干重和孢子數的影響 由表5可知葡萄糖添加量對菌絲體干重的影響有極顯著性差異(p<0.01),對孢子數有顯著性差異(p<0.05)。菌絲體干重和孢子數隨著葡萄糖量的增加呈現先增加后減少的趨勢。其中葡萄糖量為3.0%時菌絲體干重最大,達到16.672 g/L,當葡萄糖量為2%時每毫升發酵液中孢子數達到最大為8.7782。這是由于葡萄糖添加量增多或減少會導致培養基的碳氮比失衡,因此葡萄糖添加量為3.0%。

表5 葡萄糖添加量對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 5 Effects of glucose addition on dry wight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.5 不同氮源對菌絲體干重和孢子數的影響 由表6可知不同氮源對菌絲體干重的影響有顯著性差異(p<0.05),對孢子數有極顯著性差異(p<0.01)。其中蛋白胨作為氮源的培養基所得菌絲體干重和孢子數達到最大值。干重為10.989 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.6127。因此選取蛋白胨為氮源。

表6 不同氮源對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 6 Effects of different nitrogen sources on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.6 蛋白胨添加量對菌絲體干重和孢子數的影響 由表7可知蛋白胨的添加量對菌絲體干重無顯著影響(p>0.05)，而對孢子數有顯著性影響(p<0.05)，菌絲體干重和孢子數隨著蛋白胨量的增加呈現增加趨勢。當蛋白胨量為1.25%時干重和孢子數最大，其中干重為12.455 g/L，每毫升發酵液中孢子數對數值為8.3010。因此蛋白胨添加量為1.25%。

表7 蛋白胨添加量對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 7 Effects of peptone additive on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.7 不同微量元素對菌絲體干重和孢子數的影響 由表8可知不同微量元素對菌絲體干重的影響有顯著性差異(p<0.05)。其中MgSO4作為微量元素的培養基所得菌絲體干重和孢子數達到最大值,干重為8.709 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.5051。因此選取MgSO4為微量元素。

表8 不同微量元素對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 8 Effects of different trace elements on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.8 Mg2+添加量對菌絲體干重和孢子數的影響 由表9可知Mg2+添加量對菌絲體干重有顯著性影響(p<0.05),對孢子數對數值有極顯著性影響(p<0.01)。菌絲體干重和孢子數隨著Mg2+添加量的增加呈現先增加后減少的趨勢。其中當Mg2+添加量為0.15%時,干重和孢子數對數值達到最大值,干重為9.752 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.1139。所以Mg2+添加量為0.15%。

表9 Mg2+添加量對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 9 Effects of Mg2+ on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.9 光照條件對菌絲體干重和孢子數的影響 由表10可知光照條件對干重和孢子數有極顯著性影響(p<0.01)。其中自然光照條和全光照條件下菌絲體干重和孢子數無差異(p>0.01)。由于自然光照會降低成本,因此選取自然光照條件下進行發酵,干重為13.885 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.3792。

表10 光照條件對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 10 Effects of light conditions on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.10 溫度對菌絲體干重和孢子數的影響 由表11可知,溫度對干重和孢子數有極顯著性影響(p<0.01)。其中當溫度為25 ℃時,干重和孢子數對數值達到最大,干重為13.956 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.1968。所以選取發酵溫度為25 ℃。這和李琳實驗結果一致[14]。

表11 溫度對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 11 Effects of temperature on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.11 初始pH對菌絲體干重和孢子數的影響 由表12可知,初始pH對菌絲體干重和孢子數有顯著性影響(p<0.05)。其中當pH為7時,菌絲體干重和孢子數達到最大值,干重為8.200 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.6127。由于培養基過酸或過堿都會破壞棘孢木霉酶活性,因此選取初始pH為7。

表12 初始pH對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 12 Effects of initial pH on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.12 裝瓶量對菌絲體干重和孢子數的影響 由表13可知裝瓶量對菌絲體干重和孢子數有顯著性影響(p<0.05)。菌絲體干重和孢子數隨著裝瓶量的增加呈現先增加后減少的趨勢。其中當裝瓶量為100 mL/250 mL時,菌絲體干重和孢子數達到最大,每毫升發酵液中菌絲體干重為13.737 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.8445。因為100 mL/250 mL裝瓶量會使氧氣充足同時營養條件合適,所以選取裝瓶量為100 mL/250 mL。

表13 裝瓶量對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 13 Effects of bottling amount on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.1.13 接種量對菌絲體干重和孢子數的影響 由表14可知接種量對菌絲體干重有極顯著性影響(p<0.01),對孢子數有顯著性影響(p<0.05)。菌絲體干重和孢子數隨著接種量的增加呈現先增加后減少的趨勢。其中當接種量為8×106個/mL時,干重和孢子數達到最大值,干重為15.196 g/L,每毫升發酵液中孢子數對數值為8.7993。所以選取接種量為8×106個/mL。

表14 接種量對菌絲體干重和孢子數的影響(x±SD,n=3)Table 14 Effects of inoculation amount on dry weight and spore number of mycelia(x±SD,n=3)

2.2 正交實驗結果與分析

由表15可以看出,對干重的影響的顯著順序依次為:裝瓶量>葡萄糖添加量>接種量>蛋白胨添加量,四個因素的最佳組合為A2B4C4D4。對孢子數的影響的顯著順序依次為:葡萄糖添加量>接種量>裝瓶量>蛋白胨添加量,四個因素的最佳組合為A2B4C4D4。所以,得到的最佳培養基配方為:黃豆粉0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,接種量8×106個/mL,裝瓶量100 mL/250 mL,蛋白胨添加量1.35%,葡萄糖添加量3.5%,轉速160 r/min,溫度25 ℃,自然光照,pH為7。

表15 正交實驗結果與分析Table 15 Results and analysis of orthogonal test

3 結論

基于棘孢木霉的巨大潛力,對棘孢木霉的液體發酵條件進行優化。通過單因素正交實驗確定液體發酵最優條件為:黃豆粉0.25%,KH2PO40.3%,MgSO40.15%,接種量8×106個/mL,裝瓶量100 mL/250 mL,蛋白胨添加量1.35%,葡萄糖添加量3.5%,轉速160 r/min,溫度25 ℃,自然光照,pH為7。以黃豆粉浸提液為主要培養基是因為黃豆粉來源豐富,營養豐富,價格低廉。在微量元素利用方面,Fe2+和Cu2+會抑制菌絲體和孢子數的增長,這和柯仿鋼[15]等的實驗結果一致。在裝瓶量方面,100 mL/250 mL的裝瓶量為最佳裝瓶量,這是因為氧氣充足,且營養條件合適,適合菌體生長,這和李琳[12]實驗結果一致。雖然武為平[16]等也研究了棘孢木霉產厚垣孢子的液體發酵條件,其產孢量達到5×107個/mL,本研究的產孢量為4.4812×109個/mL,因此本研究的發酵條件優化成效顯著。這對于棘孢木霉的綜合開發和利用具有重要的價值。為棘孢木霉的工業化生產打下理論基礎。

表16 驗證實驗(x±SD,n=3)Table 16 Verify the experiment(x±SD,n=3)

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