超聲波輔助提取石榴根皮總黃酮及其抑制亞硝化反應活性

王占一,畢海丹,王玉海,鄭丹丹,戴 博,李卓瓦

(1.棗莊學院生命科學學院,山東棗莊 277160;2.空軍總醫院藥學部,北京 100142)

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬木本植物,資源分布極其廣泛,我國南北各省均有栽培[1]。石榴的藥用和食用部位主要為其果實部分,而自然淘汰的老根或作為石榴盆景淘汰的老樁經常作為廢物被丟棄,造成資源浪費。梁代陶弘景在《本草經集注》中記載,石榴根皮具有殺蟲、澀腸、止帶等功效,是古代一種常用的中藥材。近年來,大量研究證明黃酮類成分廣泛存在于木本植物的根皮中,目前,研究較多的為菠蘿蜜[2]、白簕[3]、梓樹[4]等,而石榴根皮中是否含有黃酮類成分,國內外鮮有文獻報道。羅麗等[56]研究發現,采用超聲波輔助提取植物藥材中的活性成分,具有條件溫和、環境友好、可操作性強等諸多優點,使提取過程能夠在相對較短時間內完成,有效避免了活性成分被氧化而喪失其功效,并提高了提取效率。但是,采用超聲波輔助提取石榴根皮中黃酮類成分的研究,國內還未見文獻報道。

癌癥是當前威脅人類生活的最大殺手,根據世界衛生組織統計,全世界每年約有500萬人被癌癥奪取生命。在眾多致癌物中,亞硝胺是最令人關注的一類化學致癌物,因此,抑制亞硝化反應的研究直接關系人體健康[7]。從防癌抗癌角度考慮,可以采取清除亞硝胺的合成前體亞硝酸鹽、阻斷亞硝胺的合成反應來達到防癌目的[89]。天然植物中的黃酮類物質對亞硝化反應具有較強的抑制作用,國內學者在這方面研究較多,例如,葉敏等[10]測定了響鈴草總黃酮體外清除亞硝酸鹽能力和阻斷亞硝胺合成能力;王曉波等[11]測定了雞骨草總黃酮體外抑制亞硝化反應活性,均取得了較好的陽性結果。因此,本研究以石榴根皮為材料,采用超聲波輔助提取材料中總黃酮,并測定純化后的產物對亞硝酸鹽的清除能力和對亞硝胺合成的阻斷能力,為石榴根皮總黃酮的工業化生產,促進石榴資源的充分開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴根皮 采自山東嶧城“萬畝石榴園”核心產區,經棗莊學院閆志佩教授鑒定為正品石榴根皮,在恒溫鼓風干燥箱中60 ℃干燥后,粉碎并過40目篩,備用;蘆丁對照品 純度>98%,批號:100080-201202,中國食品藥品檢定研究院提供;無水乙醇、碳酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、鹽酸、亞硝酸鹽、檸檬酸、磷酸氫二鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸苯乙二胺、a萘胺、二甲胺 均為分析純,天津市東麗區天大化學試劑廠;蒸餾水 棗莊學院生物學省級教學示范中心提供。

HNCQY型低溫超聲波萃取儀 上海汗諾儀器有限公司;MP502B型電子分析天平 上海精密科學儀器有限公司;756型紫外可見分光光度計 上海光學儀器一廠;FW135型多功能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;RE2000A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;RV5型真空泵 英國Edwards公司;HHS2型電熱恒溫水浴鍋 金壇市大地自動化儀器廠;DGH9240型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘆丁標準曲線的制定 參照文獻[12]的方法,略有改動。精密稱取蘆丁對照品12.5 mg置于小燒杯中,用75%乙醇溶解并轉移定容至25 mL容量瓶中,即得500 μg/mL的蘆丁對照品溶液。分別移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于10 mL具塞比色管中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,加入4% NaOH溶液5 mL,混勻,用75%乙醇定容至10 mL后靜置20 min,在510 nm 波長處測定吸光度(A值),并以A值為縱坐標,蘆丁系列濃度為橫坐標,得回歸方程A=0.6254C+0.0116(r=0. 9995),質量濃度在0～60 μg/mL范圍內與A值之間線性關系良好。

1.2.2 石榴根皮中總黃酮的制備與含量測定 精確稱取干燥后石榴根皮粉末5 g,按照規定的料液比加入設定體積分數的乙醇溶液,置于低溫超聲波萃取儀中,設定超聲功率,提取至設定的反應時間。反應結束后,3000 r/min離心30 min,分離所得上清液,回收乙醇溶劑,干膏至于小燒杯中,用75%乙醇溶解并定容至100 mL,作為樣品溶液。取樣品溶液適量用D101大孔吸附樹脂靜態吸附,抽濾,用75%乙醇洗脫后,抽濾,濾液減壓蒸干后得到石榴根皮總黃酮固形物,稱重,備用。

準確稱取精制后的石榴根皮總黃酮固形物2.0 mg,至于小燒杯中,用75%乙醇定容至100 mL,作為樣品溶液,按照“1.2.1”項下實驗方法測定A值,計算樣品中總黃酮得率及純度,并用于抑制亞硝化反應活性研究。

式(1)

式(2)

1.2.3 石榴根皮總黃酮提取工藝實驗

1.2.3.1 單因素實驗 單因素實驗中,固定條件為:料液比1∶20 g/mL、超聲功率250 W、超聲時間35 min,考察乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)對石榴根皮總黃酮得率的影響;固定條件為:乙醇體積分數60%、超聲功率250 W、超聲時間35 min,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對石榴根皮總黃酮得率的影響;固定條件為:乙醇體積分數60%、料液比1∶20 g/mL、超聲時間35 min,考察超聲功率(150、200、250、300、350 W)對石榴根皮總黃酮得率的影響;固定條件為:乙醇體積分數60%、料液比1∶20 g/mL、超聲功率250 W,考察超聲時間(25、30、35、40、45 min)對石榴根皮總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 BoxBehnken實驗設計 在單因素實驗基礎上,采用BoxBehnken實驗設計原理,以石榴根皮總黃酮得率(Y)為響應值,選取單因素實驗中的4個因素,建立四因素三水平的響應面優化實驗。每組實驗平行3次,取平均值。因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Level and factors of response surface experimental design

1.2.4 石榴根皮總黃酮抑制亞硝化反應

1.2.4.1 石榴根皮總黃酮對亞硝酸鹽清除率的測定 參照文獻[10]的方法,略有改動。分別吸取1.2.2項下樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于12支25 mL具塞比色管中,依次加入50 μg/mL的NaNO2溶液1.0 mL,pH3.0的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液(15.254 g檸檬酸、5.836 g磷酸氫二鈉定容至1000 mL)10.0 mL,于37 ℃水浴鍋中保溫1 h,取出后加入質量分數0.4%的對氨基苯磺酸2.0 mL,搖勻后靜置5 min,再加入質量分數0.2%的鹽酸萘乙二胺1.0 mL,用蒸餾水稀釋至刻度,搖勻后靜置15 min。以VC作對照,用分光光度計在確定最大吸收波長λmax=540 nm處測定吸光度,并按照下式計算亞硝酸鹽清除率:

式(3)

式中:A0為未加樣品溶液時NaNO2溶液的吸光度(以試劑作空白對照);A為加入樣品溶液時NaNO2溶液的吸光度。

1.2.4.2 石榴根皮總黃酮對亞硝胺合成阻斷率的測定 參照文獻[13]的方法,略有改動。分別吸取1.2.2項下樣品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL于12支25 mL比色管中,依次加入pH3.0的檸檬酸磷酸氫二鈉緩沖液10.0 mL,69.5 μg/mL的NaNO2溶液1.0 mL,45.08 μg/mL的二甲胺溶液1.0 mL,用蒸餾水稀釋至刻度,于37 ℃水浴鍋中保溫1 h。準確吸取1.0 mL加入到7 cm2的培養皿中,再加入質量分數0.5%的Na2CO3溶液0.5 mL,于紫外分析儀(λ=254 nm)上輻照15 min。取出后依次加入質量分數1%的對氨基苯磺酸1.5 mL,質量分數0.1%的α萘胺1.5 mL,蒸餾水0.5 mL,搖勻后靜置15 min。以VC作對照,用分光光度計在確定最大吸收波長λmax=525 nm處測定吸光度,并按照下式計算對亞硝胺合成的阻斷率:

式(4)

式中:A0為未加樣品溶液時NaNO2溶液的吸光度(以試劑作空白對照);A為加入樣品溶液時NaNO2溶液的吸光度。

1.3 數據分析

BBD實驗設計采用DesignExpert 8.0.5統計分析軟件,數據分析處理采用SPSS 20.0和Microsoft excel 2010軟件。實驗結果均以平均值±標準偏差表示(n=3)。

2 結果與分析

2.1 石榴根皮總黃酮的提取工藝參數優化

2.1.1 單因素實驗結果與分析

2.1.1.1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響 如圖1所示,乙醇體積分數在40%～60%范圍內,隨著乙醇體積分數的增大,總黃酮得率有明顯提高,當乙醇體積分數為60%時,總黃酮得率達到最大值。此后隨著乙醇體積分數的增加,總黃酮得率呈現明顯的下降趨勢。根據“相似者相溶”原理,體積分數為60%的乙醇溶液和材料中總黃酮極性相似,因此,總黃酮得率較高,而提取溶液高于或低于這個極性,總黃酮得率相應降低,因此,確定乙醇體積分數60%左右。

圖1 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1.2 料液比對總黃酮得率的影響 如圖2所示,料液比在1∶10～1∶20 g/mL范圍內,隨著溶劑用量的增大,總黃酮得率有明顯的提高,當料液比為1∶20 g/mL時,總黃酮得率達到2.35%。此后繼續增大料液比對總黃酮得率的影響不大,甚至出現下降趨勢。原因是原料質量一定,增大溶劑用量,會提高總黃酮得率,但是,當料液比例達到一定值后,材料中的總黃酮基本提取完全,故再增加料液比例,總黃酮得率不再提高,基于經濟方面考慮,確定料液比1∶20 g/mL左右為宜。

圖2 料液比對總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of solid/liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1.3 超聲功率對總黃酮得率的影響 如圖2所示,超聲功率在150～250 W范圍內,隨著超聲功率的增大,總黃酮得率有明顯的提高,當超聲功率為250 W時,總黃酮得率達到2.33%。當超聲功率超過250 W后,總黃酮得率隨超聲功率增加變化趨勢并不明顯。原因是超聲功率較低時,空化泡的最大半徑與起始半徑的比值增大,空化強度增大,即聲強愈高,空化效應愈強烈,有利于總黃酮成分的浸出;但是,當超過一定值時,聲強過高,會產生大量無用的氣泡,從而束縛了浸出效率的提高[6],從節約能源角度考慮,確定超聲功率為250 W左右。

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids

2.1.1.4 超聲時間對總黃酮得率的影響 如圖4所示,超聲時間在25～35 min范圍內,隨著超聲時間的增大,總黃酮得率有明顯的提高,當超聲時間35 min時,總黃酮得率達到2.34%。當超聲時間超過35 min后,總黃酮得率隨超聲時間增加變化趨勢并不明顯。原因是黃酮類成分從固相向液相傳遞是一個復雜過程,故而延長提取時間,總黃酮得率升高。但是,提取時間太長,原料與提取溶劑之間的濃度差變小;同時,部分產物被分解而影響了提取效果,從而使得總黃酮得率升高趨勢緩慢。因此,確定超聲時間為35 min左右。

圖4 超聲時間對總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2 BoxBehnken實驗設計回歸模型的建立及方差分析 根據DesignExpert 8.0.5軟件中所提供的實驗方案安排實驗。響應面實驗方案與實驗結果見表2。(n=3)對表2中數據進行回歸擬合,得到各因素與響應值之間的二次回歸方程為:

表2 響應面實驗方案與實驗結果Table 2 Arrangement and corresponding results of BoxBehnken experimental design

Y=2.74+0.14X1+0.23X2+0.069X30.17X4-0.02X1X2+0.25X1X30.15X1X4+0.17X2X3-0.12X2X4+0.29X3X40.48X120.42X220.15X320.25X42

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 Analysis of variance of regression equation

2.1.3 兩因素交互效應分析 圖5為兩因素交互作用顯著的響應面與等高線圖,響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可以直觀反映各因素之間的交互作用對石榴根皮總黃酮的影響。等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著[1617]。由圖5a可知,乙醇體積分數的變化曲面比超聲功率的變化曲面陡峭,說明乙醇體積分數比超聲功率對總黃酮得率的影響更顯著一些,與方差分析結果相符。同理,由圖5b和5c可知,兩兩因素交互作用時,料液比和超聲時間均比超聲功率對總黃酮得率的影響顯著,均與方差分析結果相符。圖5所示的等高線均呈明顯的橢圓形,說明乙醇體積分數和超聲功率、料液比和超聲功率及超聲功率與超聲時間之間交互作用均顯著,對總黃酮得率的影響較大。

圖5 各因素交互作用的響應面與等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots

2.1.4 最佳工藝條件的確定及驗證 通過響應面分析得到超聲波輔助提取石榴根皮總黃酮的最佳工藝條件:乙醇體積分數62.8%,料液比1∶21.95 g/mL,超聲功率271.5 W,超聲時間33.75 min,在此條件下預測總黃酮得率為2.84%。實際操作中稍作調整確定的最佳工藝條件為乙醇體積分數63%,料液比1∶22 (g/mL)超聲功率270 W,超聲時間34 min。進行3次平行驗證實驗,測得總黃酮平均得率為2.81%,與理論值非常接近,誤差僅為1.06%。

2.2 石榴根皮總黃酮抑制亞硝化反應實驗結果

應用式(2)計算得出純化后的石榴根皮總黃酮固形物純度約為75%,進而得出1.2.2項下,用于抑制亞硝化反應實驗的樣品溶液中總黃酮真實濃度為15 μg/mL。樣品溶液總黃酮對亞硝酸鹽清除率的測定結果見圖6,對亞硝胺合成阻斷率的測定結果見圖7。

圖6 石榴根皮總黃酮及VC對亞硝酸鹽的清除率Fig.6 The sodium nitrite scavenging rates of total flavonoids from pomegranate root bark and VC

圖7 石榴根皮總黃酮及VC對亞硝胺合成的阻斷率Fig.7 The nitrosamine synthesis inhibiting rates of total flavonoids from pomegranate root bark and VC

由圖7可知,在0.12～3.6 μg/mL范圍內,隨著濃度的增加,石榴根皮總黃酮對亞硝酸胺合成的阻斷率明顯增加,當濃度為3.6 μg/mL時,阻斷率達到71.9%。石榴根皮總黃酮濃度與對亞硝酸胺合成的阻斷率之間存在著正相關關系,擬合方程為y=16.48x+11.35,決定系數R2=0.990。通過擬合方程算出石榴根皮總黃酮對亞硝酸胺合成的阻斷作用的IC50=2.345 μg/mL。同理,VC對亞硝酸鹽清除作用的IC50=1.087 μg/mL,石榴根皮總黃酮對亞硝酸胺合成的阻斷作用低于VC。已有學者研究表明,木蝴蝶總黃酮等酚類成分具有較強清除亞硝酸鹽和抑制亞硝胺合成能力,且清除(抑制)作用與植物酚類化合物的含量密切相關[1921],這與本研究的結果一致。黃酮類化合物是一類多羥基酚類化合物,酚羥基極易發生氧化、縮合、聚合等變化,所以具有較強的抗氧化能力[22]。亞硝酸鹽是一種氧化劑,黃酮類成分能與亞硝酸根通過氧化還原反應而清除亞硝酸鹽,并抑制亞硝胺的合成數量[23]。

3 結論

本文以石榴根皮為研究對象,在單因素實驗基礎上,采用BoxBehnken Design(BBD)實驗設計,以總黃酮得率為考察指標,優選出超聲波提取石榴根皮總黃酮的最佳工藝條件為乙醇體積分數63%,料液比1∶22 g/mL,超聲功率270 W和超聲時間34 min,在此條件下石榴根皮總黃酮得率為2.81%,與模型預測值接近。石榴根皮總黃酮具有較強的清除亞硝酸鹽能力和抑制亞硝胺合成能力,質量濃度為3.6 μg/mL時,對亞硝酸鹽的最大清除率為64.5%,清除作用的IC50=2.408 μg/mL,對亞硝胺合成的最大阻斷率為71.9%,阻斷作用的IC50=2.345 μg/mL,在質量濃度0.12～3.6 μg/mL范圍內,石榴根皮總黃酮與對亞硝酸鹽清除效果和抑制亞硝酸胺合成效果之間均呈一定的正相關關系。

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