豬血紅蛋白超聲提取工藝響應面優化及超聲對其結構的影響

馬素敏,何立超,李成梁,孫 媛,靳國鋒,*,馬美湖

(1.華中農業大學食品科技學院,湖北武漢 430070;2.武漢設計工程學院食品與生物科技學院,湖北武漢 430205)

動物血液是畜禽屠宰加工的主要副產物,動物血液營養全面,其含有豐富的必需氨基酸以及具有高生物利用率的血紅素鐵,同時血液中的蛋白質與乳、豆類中蛋白質相比,一般不會引起過敏反應[1]。動物血液主要由紅細胞(占全血體積的20%～40%)和懸浮狀液體血漿(60%～80%)組成。全血中蛋白質含量為17%～18%,水分含量為75%～82%,紅細胞中血紅蛋白含量約占總血液總蛋白質含量的70%[2]。

到目前為止,人們對血紅蛋白的開發利用主要是將其制成增色劑[35]、鐵增強劑、脂肪替代品、動物飼料及寵物食物[6],運用于食品加工和營養強化、飼料工業等領域。近些年也有研究將血紅蛋白進行水解制備成具有補鐵、抗菌、抗氧化、血管緊張素轉移酶抑制等功能活性的配料[6]。同時,血紅蛋白也是合成具有抗腫瘤、抗炎作用的血卟啉等卟啉類化合物的重要原料——氯化血紅素的前體物質[7]。此外,也有研究報道血紅蛋白可作為合成高分子絮凝劑替代品,用于污水處理等分離純化產業[8]。因此,動物血紅蛋白的開發利用具有非常廣闊的應用前景。

血紅蛋白產品的開發,其提取工藝是關鍵,在獲得較高血紅蛋白提取率的基礎上,掌握工藝處理對血紅蛋白結構產生的影響(如卟啉環結構是否完整,血紅素是否從蛋白疏水空穴游離),這樣才能方便其進一步開發利用。血紅蛋白的提取工藝主要分為物理法、化學法、機械法,物理方法又分為反復凍融法和超聲波法,化學方法主要有添加表面活性劑法以及自溶法,機械法可以分為膠體磨法、高壓均質法以及勻漿機法等[910]。其中超聲波法具有破碎效率高,時間短,無有機試劑殘留、防止剪切黏度升高等優點[11],是近年來研究應用比較多的一種方法。但是,超聲處理也有其潛在的缺點:提高了處理液溫度,并且其強烈的剪切力可能破壞蛋白質結構,導致酶活性喪失,功能特性的改變,蛋白聚集等[12]。有研究報道[13],超聲波處理不會引起一些具有高水平β結構和低水平α結構的蛋白質(如超氧化物歧化酶、富組親動蛋白等)的二級結構發生顯著變化,但是會引起一些具有高α螺旋含量蛋白質(如肌紅蛋白、牛血清白蛋白)的二級結構發生變化。

目前關于超聲破碎豬紅細胞提取血紅蛋白的研究多集中在其工藝的優化上,超聲條件對于提取得到的血紅蛋白結構以及其中血紅素卟啉環結構的影響研究幾乎沒有。本研究利用響應面方法優化超聲提取血紅蛋白工藝,并在此基礎上應用光譜學等手段研究了超聲波提取工藝對血紅蛋白及其卟啉環結構的影響,為后續研究血紅素等卟啉類化合物的結構性質以及開發相關卟啉類產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬血 華中農業大學農貿生鮮超市;標準血紅蛋白 日本東京化成工業株式會社;檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉 均為分析純;Triton X100 國藥集團化學試劑有限公司。

VCX750型超聲細胞粉碎儀 美國SONICS公司;Nanodrop 2000C型紫外可見分光光度計 美國熱電公司;Nexus 470傅里葉變換紅外光譜儀 美國梅特勤公司;JASCOJ810型圓二色譜儀 日本JASCOJ公司;InVia型共焦顯微拉曼光譜儀 英國RENISHAW公司;Sigma330N型冷凍離心機 德國Sigma公司;ALPHA14型真空冷凍干燥機 德國Christ公司

1.2 實驗方法

1.2.1 ACD抗凝劑的制備 稱取檸檬酸0.48 g,檸檬酸鈉1.32 g,葡萄糖1.47 g,溶于100 mL蒸餾水中,高壓滅菌后備用。20 mL新鮮血液加入3.5 mL ACD抗凝劑。

1.2.2 血紅蛋白的超聲提取工藝 取一定體積新鮮抗凝豬血,1700×g離心10 min后血液分層,收集下層紅細胞,用pH7.4 PBS緩沖液洗滌三次。量取20 mL紅細胞加入不同體積的蒸餾水,在不同超聲時間、超聲振幅、脈沖激發與間歇時間比下破碎紅細胞,破碎過程中采用碎冰降溫。破碎液在10000×g下離心30 min,棄下層細胞碎片收集上清液為血紅蛋白提取液,記錄體積。

1.2.3 血紅蛋白含量測定及計算 采用堿性羥基高鐵血紅素法測定血紅蛋白含量,在Vinaya等[14]的基礎上稍作變化,按照1∶151比例取血紅蛋白提取液200 μL與30 mL堿性試劑Triton X100進行混合。血紅蛋白測定的標準曲線為:y=0.00185x-0.01111,相關系數R2=0.9996。這說明在樣品濃度范圍16～160 mg/mL內,該方程擬合程度高可用于血紅蛋白濃度的測定計算。按照下面公式[15]計算血紅蛋白提取率。

式中,Y為血紅蛋白提取率(%),C1為由標準曲線所求得破碎液中血紅蛋白濃度(mg/mL);V1為20 g紅細胞加水超聲破碎后的破碎液體積(mL);C2為購買豬血的血紅蛋白濃度(mg/mL);V2為20 g紅細胞所來源的豬血體積(mL)。

1.2.4 單因素實驗 采用1.2.2工藝進行超聲破碎紅細胞提取血紅蛋白,固定超聲時間為15 min,間歇與脈沖激發時間比為1∶1,水與紅細胞體積比為3∶1時,研究不同超聲振幅(20%、25%、30%、35%、40%)對血紅蛋白提取率的影響。固定超聲振幅為25%,間歇與脈沖激發時間比為1∶1,水與紅細胞體積比為3∶1,研究不同超聲時間(5、10、15、20、25 min)對血紅蛋白提取率的影響。固定超聲振幅為25%,超聲時間為15 min,水與紅細胞體積比為3∶1,研究不同間歇與脈沖激發時間比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)對血紅蛋白提取率的影響。固定超聲振幅為25%,超聲時間為15 min,間歇與脈沖激發時間比為1∶1,研究不同水與紅細胞體積比(2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1)對血紅蛋白提取率的影響。

1.2.5 響應面實驗設計 通過單因素實驗,篩選出各因素合適的水平,然后采用Designexpert 8.0.6進行響應面設計,基于BoxBehnken進行四因素三水平實驗。實驗因素與水平的編碼表如表1。

表1 響應面實驗因素及水平表Table 1 The factors and levels of the response surface experiment

1.2.6 血紅蛋白結構表征 取一定量在最優超聲工藝條件下制備的血紅蛋白凍干樣品(凍干條件為:40 ℃,0.02 MBar,35 h)與標準血紅蛋白,利用紫外光譜、紅外光譜、圓二色譜、顯微共焦激光拉曼光譜方法研究分析超聲提取工藝對血紅蛋白結構(包括卟啉環)的影響。

1.2.6.1 紫外可見光譜 配制0.1 mg/mL的血紅蛋白樣品和標準品,在200～800 nm下進行紫外可見光譜全掃描,對二者的吸收光譜進行比較。

1.2.6.2 紅外圖譜分析 采用溴化鉀壓片法進行紅外光譜掃描測定。分別稱取血紅蛋白樣品與標準品凍干粉末若干,加入一定量溴化鉀進行研磨,測定條件設置為:掃描范圍為4000～400 cm-1,掃描次數64次,儀器分辨率4 cm-1。

1.2.6.3 圓二色譜 取一定量血紅蛋白樣品和血紅蛋白標準品分別溶于pH7.4的磷酸緩沖液中,配制成濃度為0.05 mg/mL的待測溶液。測定條件:使用0.1 cm的石英比色皿,溫度設置25 ℃,掃描速率為100 nm/min,掃描范圍為190～260 nm。

1.2.6.4 顯微共焦激光拉曼光譜 取血紅蛋白樣品與標準品凍干粉末在室溫下進行拉曼光譜測定。測定條件為:激光波長633 nm,激光分辨率2 cm-1,掃描波數范圍:200～2000 cm-1,激光功率15 mW。

1.3 數據處理

通過SPSS軟件進行單因素方差分析,每組實驗重復三次。采用origin 8.5軟件繪制實驗折線圖。采用Designexpert 8.0.6進行響應面設計及方差分析,得到響應面設計表及方差分析結果。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 超聲振幅對紅細胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖1可以看出,當其它因素一定時,隨著超聲振幅的增加,血紅蛋白提取率呈現先增加后減少的趨勢,當超聲振幅達到25%時,血紅蛋白提取率達到最高。超聲振幅與輸出超聲功率呈現良好線性關系[11],而超聲空化作用和超聲波功率有關,振幅越大,輸出超聲功率越大,空化作用強度越大,則紅細胞破碎越完全。但振幅太大,空化作用會趨于飽和,同時也容易產生局部過熱使得已溶出的血紅蛋白發生聚集沉淀[16]和導致部分紅細胞變性,從而阻礙了血紅蛋白的釋放[17]。因此,在破碎過程中要注意采取碎冰降溫或者其它降溫方式。

圖1 超聲振幅對血紅蛋白提取率的影響Fig.1 The effects of ultrasonic amplitude on hemoglobin yield

2.1.2 超聲時間對紅細胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖2可以看出,當其它因素一定時,隨著超聲時間的增加,血紅蛋白提取率呈現先增加后減少的趨勢,當超聲時間達到10 min時,血紅蛋白提取率達到最高。也就是說10～25 min之間,血紅蛋白提取率隨著超聲作用時間的延長而降低,這是因為超聲時間越長,超聲波在破碎細胞的同時產生的空化氣泡越多并且釋放的熱量形成的瞬間高溫會對紅細胞產生加熱作用,時間越長,被加熱的紅細胞數目越多,這可能會使部分紅細胞變性[17],從而阻礙了血紅蛋白的釋放,同時長時間的超聲作用會使得已溶出血紅蛋白由于非共價作用聚集沉淀[16],從而使得血紅蛋白提取率降低了。

圖2 超聲時間對血紅蛋白提取率的影響Fig.2 The effects of ultrasonic time on hemoglobin yield

2.1.3 間歇與脈沖激發時間比對紅細胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖3可以看出,隨著間歇時間(s)與脈沖激發時間(s)比值的逐漸增大,血紅蛋白提取率呈現先增加后減少的趨勢。當二者比例為2∶1時,血紅蛋白提取率達到最大。間歇時間與超聲波空化作用和熱效應息息相關,是消除超聲波熱效應的有效手段之一。間歇時間里容易產生氣泡,大大提高了超聲過程中發生空化作用的機率[18],空化產生的極大壓力使得更多的紅細胞更容易破碎,因此血紅蛋白含量會升高。當間歇時間一定時,脈沖激發時間越長即超聲時間越長,血紅蛋白提取率先增加后減少這與前面的結論也是一致的。

圖3 間歇與脈沖激發時間比對血紅蛋白提取率的影響Fig.3 The effects of ratios of quiescent interval to impluse excitation time on hemoglobin yield

2.1.4 水與紅細胞體積比對紅細胞破碎釋放血紅蛋白提取率的影響 從圖4可以看出,當其它因素一定時,隨著水與紅細胞體積比的增加,血紅蛋白提取率呈現上升趨勢,當加水量達到紅細胞體積的4倍后時,血紅蛋白提取率增加緩慢。這是因為加入水后紅細胞細胞膜外的滲透壓降低了從而導致紅細胞吸水脹破,同時超聲波的空化作用也加速了紅細胞的破碎,因而血紅蛋白提取率升高[19]。但是從經濟方面和后續實驗考慮,4倍加水體積后血紅蛋白提取率增加緩慢,且加水量過多使血紅蛋白濃度降低較多,不利于后期酶解實驗的進行,因此初步確定加水量為紅細胞體積的4倍。

圖4 水與紅細胞體積比對血紅蛋白提取率的影響Fig.4 The effects of volume ratios of water to red blood cell on hemoglobin yield

2.2 響應面實驗結果及數據分析

2.2.1 響應面實驗設計方案及結果 在單因素實驗基礎上,采用BBD組合實驗,以血紅蛋白提取率作為響應值,分別考察超聲振幅、超聲時間、間歇與脈沖激發時間比以及水與紅細胞體積比對超聲破碎紅細胞制備血紅蛋白的影響。由Designexpert 8.0.6統計分析軟件設計的響應面分組及實驗結果見表2。

表2 響應面實驗方案及結果Table2 The scheme and results of response surface experiment

表3 模型方差分析結果Table 3 Analysis result of model variance

2.2.3 響應面圖分析 通過響應面分析軟件得到的三維曲面圖和二維等高線圖可以很直觀的反映各因素間的交互作用。圖5反應的是對血紅蛋白提取率具有顯著影響的三個交互作用即 AB、AC、AD的三維圖像(a1、b1、c1)以及二維等高線(a2、b2、c2),可以看出b1的曲面最陡峭,b2的二維等高線最接近橢圓形,這說明AC的交互作用即超聲振幅和間歇與脈沖激發時間比的交互作用最強,對血紅蛋白提取率的影響極顯著[21]。

圖5b1所示為AC交互作用的三維曲面圖。當超聲時間和水與紅細胞體積比分別固定在10 min和4∶1時,血紅蛋白提取率達到最大預測值時的超聲振幅為25.79%,間歇與脈沖激發時間比為1.89∶1。在超聲振幅和間歇與脈沖激發時間比的范圍內,當間歇與脈沖激發時間比較低時,血紅蛋白提取率隨著超聲振幅的增加而快速增加,隨著超聲振幅的連續增加,提取率緩慢下降;當間歇與脈沖激發時間比較高時,血紅蛋白提取率隨著超聲振幅的增加而增加緩慢,隨著超聲振幅的進一步增加,提取率快速降低。當超聲振幅較低時,隨著間歇與脈沖激發時間比的增加,血紅蛋白提取率也增加;當超聲振幅較高時,提取率隨著間歇與脈沖激發時間比的增加而減少[22]。其次,超聲振幅的響應曲面比間歇與脈沖激發時間比的響應曲面陡峭,說明超聲振幅對血紅蛋白提取率的影響高于間歇與脈沖激發時間比。這與上述的方差分析結果相符合。

圖5 AB、AC、AD的交互作用對血紅蛋白提取率的響應面圖Fig.5 Response surface plots of variable parameters(AB,AC,AD)on the yield of hemoglobin

2.2.4 驗證實驗 通過響應面優化出最優條件為:超聲振幅26.03%,超聲時間10.14 min,間歇與脈沖激發時間比為1.86∶1,水與紅細胞的體積比為4.27∶1,此時血紅蛋白提取率為92.8136%。根據實際情況,選擇超聲振幅為26%,超聲時間為10.15 min,間歇與脈沖激發時間比為2∶1,水與紅細胞體積比為4.25∶1,在此條件下進行驗證實驗,測得的血紅蛋白提取率為91.4763%,與回歸方程所得的預測值相差1.34%,由此可認為實測值與預測值具有良好的吻合性,該回歸模型與實際情況擬合良好,具有較好的預測性。本文通過響應面優化出的最佳血紅蛋白提取率(91.4763%)與郝玉蘭等[15]的研究結果(92.33%)近似,但最優超聲時間與超聲功率都比之降低,分析原因可能是采用的動物血液品種及來源不同、超聲波裝置及型號不同,故破碎效果不同。

2.3 超聲提取工藝對血紅蛋白結構變化

2.3.1 超聲處理對血紅蛋白結構影響的紫外可見圖譜分析 血紅蛋白的紫外可見吸收光譜中出現的電子帶分別為:280 nm(色氨酸,酪氨酸中苯基)、360 nm(ε帶)、406 nm(Soret帶)、576 nm(Q帶)[23],其中與位于血紅蛋白疏水口袋中的血紅素密切相關的電子條帶為:Soret帶以及Q帶,它們也是卟啉類化合物鑒別的重要特征。Soret帶的強度、位置、形狀與卟啉環聯系緊密,Q帶的位置則反映了血紅素周圍環境的變化[24]。如圖6所示,超聲后血紅蛋白相較于未超聲血紅蛋白而言,Soret帶紅移了近3 nm,且Q帶的位置、形狀也發生了變化,由單峰變化為肩峰。說明血紅蛋白經過超聲處理后其蛋白結構已經發生變化,且血紅蛋白配體血紅素基團在這個過程中也受到擾動,但其結構即卟啉環并未發生斷裂(Soret帶仍存在)。

圖6 超聲處理對血紅蛋白結構影響的紫外圖譜Fig.6 UVVis spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample 注:a:未超聲血紅蛋白;b:超聲后血紅蛋白;圖7～圖9同。

2.3.2 超聲處理對血紅蛋白結構影響的紅外光譜分析 在紅外光譜中,酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶可以提供蛋白質構象變化的信息。酰胺Ⅰ帶反映的是C=0伸縮振動,常出現于1600～1700 cm-1范圍內,提供蛋白質二級結構信息。酰胺Ⅱ帶是NH彎曲振動及CN伸縮振動的偶合峰,常出現于1500～1600 cm-1[25]。酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶能更敏銳的反應出蛋白質二級結構變化,因此分析酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶變化更有利于分析超聲條件對血紅蛋白結構變化的影響[25]。如圖7所示,與未超聲Hb相比較,超聲后血紅蛋白樣品的酰胺I帶吸收峰位置由1654 cm-1偏移至1656 cm-1,酰胺II帶吸收峰位置由1539 cm-1轉移至1540 cm-1,并且經過超聲處理后兩峰強度都減弱,這表明超聲處理使得血紅蛋白的二級結構發生了變化[26]。

圖7 超聲處理對血紅蛋白結構影響的紅外圖譜Fig.7 FTIR spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample

2.3.3 超聲處理對血紅蛋白結構影響的圓二色譜分析 如圖8所示,以未超聲血紅蛋白作為對照,其在194 nm處有一正峰,在210 nm以及222 nm處各存在一負峰[27],可以發現,超聲處理后的樣品在194 nm處的正峰強度增強,在兩負峰處的強度減弱,并且位于210 nm處峰出現稍微紅移的現象,這表明超聲處理后血紅蛋白α螺旋結構損失。α螺旋比其它二級結構如β折疊等更緊密,它們一起維持蛋白穩定。超聲處理后的血紅蛋白其α螺旋所占比例相較于未超聲血紅蛋白的86.6%降低至60.3%,β折疊則由4.7%上升至26.1%。α螺旋的減少和β折疊的增加會導致血紅素中心暴露[28]。通過上述現象可以得出,超聲破碎紅細胞制備血紅蛋白樣品這一過程對血紅蛋白的結構有一定影響,會引起蛋白結構變化,從而使血紅素暴露出來。

圖8 超聲處理對血紅蛋白結構影響的圓二色譜圖Fig.8 CD spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample

2.3.4 超聲處理對血紅蛋白結構影響的顯微共焦激光拉曼光譜分析 血紅蛋白拉曼光譜因血紅素的拉曼散射截面相對而言較大,因此主要反映的是血紅素的一些振動特征[29]。與血紅素密切相關的一些標志峰多集中在低頻區,而具有蛋白質性質的拉曼譜帶則多集中在高頻區。圖9中,未超聲血紅蛋白拉曼強度約是超聲后血紅蛋白拉曼強度的8陪。未超聲血紅蛋白和超聲后血紅蛋白樣品均在低頻區有兩個較顯著的峰,分別是ν1(670±2) cm-1以及ν2(756±4) cm-1,對應的分別是Fe與配體以及卟啉環的特征峰[30,31],同樣地,在高頻區中的ν4(1453±2) cm-1,ν5(1584±2) cm-1是血紅素鐵與各配位體結合的特征峰,ν31399 cm-1是表征血紅素氧化狀態的特征峰[32]。這些與血紅素卟啉環密切相關的特征峰在超聲處理前后都存在,僅僅拉曼峰強度減弱,這初步說明超聲處理得到的血紅蛋白的卟啉環并未斷裂,這與紫外圖譜分析結果一致。但是由于血紅素四周蛋白結構在超聲作用下發生變化,導致血紅素狀態也發生變化(血紅素中心從疏水性內穴暴露在外,熒光強度大大增強,對拉曼測定造成一定干擾),因此峰強度大大減弱。

圖9 超聲處理對血紅蛋白結構影響的顯微共焦激光拉曼光譜Fig.9 Confocal MicroRaman spectra of the ultrasound treated hemoglobin sample

3 結論

本實驗對超聲波破碎紅細胞提取血紅蛋白的工藝進行優化,最終響應面優化結果為:超聲振幅為26%,超聲時間為10.15 min,間歇與脈沖激發時間比為2∶1,水與紅細胞體積比為4.25∶1,此時血紅蛋白提取率為91.4763%。在此工藝基礎上,研究了超聲處理對提取得到的血紅蛋白結構及其中卟啉環結構的影響,得出該超聲工藝會使血紅蛋白二級結構發生改變,從而會使得疏水空穴中的血紅素暴露出來,但是其中卟啉環結構并未發生斷裂。這為后續進一步研究卟啉環上的取代反應、開發相關卟啉類產品打下了一定基礎。

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