母乳揮發性成分固相微萃取-氣質聯用檢測條件的優化及測定

高雅慧,李子杰

(1.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122;2.江南大學生物工程學院,江蘇無錫 214122)

母乳是嬰兒最天然、最安全、最理想的食物來源,被稱為人類的“白色血液”。對嬰兒來說,腸道菌群尚未完全形成,其腸道、呼吸道容易受到感染,母乳對于維持嬰兒的健康具有至關重要的作用[1]。同嬰幼兒配方奶粉相比,母乳喂養嬰兒的病死率顯著降低[24]。母乳喂養除了能促進嬰兒生長和神經系統發育外,對肥胖、高血壓、高血脂、II型糖尿病等疾病均有一定的預防作用[56]。此外,母乳中所特有的活性物質及微生物,對于增強嬰兒免疫力和腸道菌群的建立起著重要作用[712]。

母乳喂養具有人工喂養無法比擬的優點,但相當一部分母親由于工作或身體的原因而不能持續進行母乳喂養,只能選取嬰幼兒配方奶粉作為母乳的最佳替代品。然而,長期喝母乳的嬰兒很難在短期內適應配方奶粉的風味,因此測定母乳所特有的揮發性成分具有重要意義。近年來對母乳的研究主要集中于對母乳中某些特定營養成分的研究,比如脂肪酸、核苷酸、免疫因子等活性物質[1317],對母乳揮發性物質的研究還未見相關報道。

本研究采用頂空固相微萃取氣質聯用法(SPMEGCMS)測定母乳的揮發性物質,通過單因素實驗法對萃取頭的選擇、萃取量、鹽效應、萃取溫度和時間、解析時間進行優化,從而得到母乳揮發性成分SPMEGCMS檢測的較優條件,揭示影響母乳風味的主要揮發性成分,為母乳配方奶風味的改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮母乳 源于產后6個月的28歲母親,放置于母乳保鮮袋中,于4度冰箱保存；NaCl 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

萃取頭:100 μm PA(polyacrylate),100 μm PDMS(polydimethylsiloxane),75 μm CAR/PDMS(carboxenpolydimethylsiloxane),65 μm DVB/PDMS(divinylbenzenpolydimethylsiloxane),50/30 μm CAR/DVB/PDMS(carboxendivinylbenzenpolydimethylsiloxane)涂層的萃取頭 美國Supelco公司;三重四級桿氣質聯用儀(GCMS) TriPlus RSHTrace GC ULTRATSQ Quantum XLS 全自動進樣氣相色譜(三重四級桿)質譜聯用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 萃取頭老化方法 將使用的五種固相萃取頭設置于TriPlus上的Fiber Conditioning Station中老化至沒有雜峰,老化溫度250 ℃,老化時間30 min。

1.2.2 萃取條件 取適量的液體母乳于20 mL的螺口玻璃瓶中,加入適量的NaCl,在TriPlus的Agitator中設置適當的溫度平衡2 min,插入固相萃取頭吸附平衡,最后于GC進樣口解析。本實驗中分別選用了100 μm PA,100 μm PDMS,75 μm CAR/PDMS,65 μm DVB/PDMS,50/30 μm CAR/DVB/PDMS五種萃取頭進行實驗,母乳萃取量為4 mL,NaCl加入量為1.0 g,在45 ℃下恒溫萃取30 min,解析時間5 min,研究不同萃取頭對萃取效果的影響;根據萃取頭的優化結果,選用DVB/PDMS,萃取溫度40 ℃,萃取30 min,解析5 min,母乳的萃取量為1、2、3、4、5、6 mL,研究萃取量對總峰面積及出峰數的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,分別加入0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g NaCl固體,充分混勻至NaCl能夠溶解或飽和,萃取溫度40 ℃,萃取時間30 min,解析時間5 min,研究鹽效應對總峰面積及出峰數的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,分別在40、45、50、55、60、65 ℃萃取30 min,解析5 min,研究萃取溫度對總峰面積及出峰數的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,在60 ℃下分別萃取10、20、30、40、50、60 min,解析5 min,研究萃取時間對總峰面積及出峰數的影響;采用DVB/PDMS,取5 mL母乳于20 mL的頂空瓶中,加入1.5 g NaCl固體,在60 ℃萃取30 min,分別解析1、3、5、7、9、11 min,研究解析時間對總峰面積及出峰數的影響。所有樣品3次平行。

1.2.3 GCMS參數條件

1.2.3.1 色譜條件 色譜柱:毛細管色譜柱(TR-WAXMS 30 m×0.25 mm×0.25 mm);升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持3 min,以4 ℃/min上升至120 ℃,再以10 ℃/min上升至240 ℃,保持8 min。載氣是高純氦氣,流速是1.0 mL/min;不分流模式,進樣口溫度為250 ℃,傳輸線溫度為240 ℃[18]。

1.2.3.2 質譜條件 電子轟擊(EI)離子源:電子能量70 eV;離子源溫度是240 ℃;燈絲電流50 μA;質量掃描范圍(m/z):33～450 u[18]。

1.2.4 定性定量方法 定性方法:經過軟件檢索,同時結合NIST library的配比度,本實驗僅對相似度大于800(最大值是1000)的鑒定結果進行分析。定量方法:根據峰面積歸一化計算[18]。

2 結果與討論

2.1 萃取頭的優選

不同萃取頭由于其涂層極性的不同,所能吸附的物質種類和極性也不同。極性涂層對酸類和酚類物質等極性物質有較好的吸附性,非極性涂層對非極性物質具有較好的吸附效果,因而不同類型的物質需要選擇合適的萃取頭進行實驗。通過單因素方差分析,不同的萃取頭對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結果如圖1所示,DVB/PDMS所得到物質的總峰面積及出峰數遠遠高于PA、PDMS和CAR/PDMS,比CAR/DVB/PDMS略高?？赡艿脑蚴荄VB/PDMS萃取頭具有兩極性質[19],對多種物質具有好的吸附效果,因此萃取頭的選擇類型為DVB/PDMS。

圖1 萃取頭的種類對萃取效果的影響Fig.1 Effect of extraction fibers on extraction efficiency

2.2 萃取量對萃取效果的影響

本實驗所用的萃取瓶的總容積是20 mL,母乳萃取量的多少會影響萃取揮發性物質的總峰面積及出峰數。如果樣品量太少,萃取頭得不到充分的吸附,萃取的揮發性物質就少;如果樣品量過多,則由于樣品擠壓沒有充分的揮發面積和萃取頭無法過量吸附,導致萃取的揮發性物質在一定萃取量之后趨于平穩或者有所下降。通過單因素方差分析,不同的樣品量對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結果如圖2所示:萃取量的增大引起總峰面積及出峰數也隨之增大;當萃取量達到5 mL時出現最大總峰面積及出峰數,當萃取量達到6 mL時,總峰面積沒有明顯的上升(p>0.05)且出峰數略有下降。因此母乳較優的萃取量為5 mL。

圖2 萃取量對萃取效果的影響Fig.2 Effect of sample volumes on extraction efficiency

2.3 鹽效應對萃取效果的影響

為了提高萃取的靈敏度,通常通過采用鹽析手段來提高基體溶液中的極性有機化合物在吸附涂層中的吸附系數從而達到更高的吸附率,但無機鹽的過量加入會增加基質的黏度,降低物質的擴散速度,產生負效應[20]。通過單因素方差分析,不同NaCl的添加量對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結果如圖3所示:NaCl含量的增多引起總峰面積也相應升高,當NaCl含量達到1.5 g 時總峰面積及出峰數最高,之后趨于平衡,這說明1.5 g NaCl在5 mL的樣品中使揮發性有機物達到最大逸出量,因此在5 mL的母乳中選擇1.5 g NaCl為宜。

圖3 NaCl的添加量對萃取效果的影響Fig.3 Effect of additive amount of sodium chloride on extraction efficiency

2.4 萃取溫度對萃取效果的影響

萃取溫度也會影響總峰面積且具有雙重影響。一方面,隨著溫度的升高,增強被萃取物的揮發性,進而提高分析物在頂空中的分配,減少平衡時間,提高分析速率;另一方面,溫度過高使得萃取頭的固有涂層脫附,降低分析物在涂層與樣品中的分配系數,從而減少萃取頭的吸附量,影響總峰面積。通過單因素方差分析,不同的萃取溫度對萃取效果具有極顯著性差異(p<0.01)。結果如圖4所示:伴隨著溫度的升高,總峰面積和出峰數相繼增大,當溫度升到60 ℃時,總峰面積和出峰數達到最高值隨后下降,因此較優的萃取溫度是60 ℃。

圖4 萃取溫度對萃取效果的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction efficiency

2.5 萃取時間對萃取效果的影響

萃取時間的長短跟樣品的分配系數、揮發物質的擴散速度、萃取頭的種類和膜厚及其吸附能力、樣品的體積等因素有著密切的關系。結果如圖5所示:萃取時間的延長引起總峰面積和出峰數快速增大(p<0.01),30 min時達到最大值,而后有所減小。這表明過長時間的萃取可能造成組分之間的化學反應,不僅影響萃取效果,還對萃取頭有一定的影響。此實驗中,較優的萃取時間為30 min。

圖5 萃取時間對萃取效果的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.6 解析時間對GCMS檢測的影響

解析時間與萃取頭的膜厚、長短及解析的完全程度相關,萃取頭越長或膜厚越厚,其解析時間一般有所增加。若解析不完全則會影響方法的靈敏度,同時也會影響下一個樣品的檢測分析。若解析時間過度則會對萃取頭有一定的損害。通過單因素方差分析,不同的解析時間對GCMS檢測具有極顯著性差異(p<0.01)。結果如圖6所示:解析時間的延長引起總峰面積及出峰數繼而增大,在解析5 min之后峰面積變化不大(p>0.05),因此較優的解析時間選擇為5 min。

圖6 解析時間對GCMS檢測的影響Fig.6 Effect of desorption duration on GCMS detection

2.7 母乳揮發性成分分析

在上面篩選出的較優條件下對母乳揮發性成分進行了測定,揮發性成分及相對含量見表1。分析得到34種揮發性成分,其中烯烴類最多,有14種(總含量為74.97%),其中右旋萜二烯和萜品烯的含量分別占揮發性物質總含量的47.68%和12.44%;酸類有5種(總含量為15.54%)、相對含量較高的有癸酸(6.77%)和辛酸(5.43%);酯類有8種(總含量為4.25%),相對含量較高的是癸酸乙酯(1.13%);芳香烴類有4種(總含量為3.91%),相對含量較高的為二甲苯(2.53%);酮類3種(總含量為1.33%),相對含量較高的為乙偶姻(0.8%)。由此可見右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要揮發性成分,酸類、酯類、芳香烴類和酮類是母乳特殊風味的重要組成部分。

表1 母乳的揮發性成分及其相對含量Table 1 Volatile compounds and relative contents of breast milk

羊奶中含有42種揮發性物質,其中酸類物質最多,有14種,包括10種短鏈脂肪酸,含量較高的是己酸、辛酸和癸酸,占揮發性成分的68%,可能和羊奶特有的膻味有關[18]。除了酸類物質外,還含有6種酯類物質,和羊奶特殊的香氣有關[18]。此外,揮發性物質還包括烷烴、芳香族、醇、醛酮和雜環類化合物,相對含量較高的有丙酮、苯甲醛等[18]。酸牛奶揮發性物質主要有酸類(28%)和酮類(29%),酸類物質對酸牛奶的風味強度影響較大,酮類物質賦予酸牛奶特征性的風味,屬于酮類物質的乙偶姻是酸牛奶中含量最高的揮發性物質(13.4%)[21]。

3 結論

本研究利用單因素實驗分析了影響SPMEGC-MS檢測的6個因素,確定了母乳揮發性成分的檢測條件為DVB/PDMS萃取頭、樣品量 5 mL、添加 1.5 g NaCl、萃取溫度60 ℃、萃取時間30 min、解析時間5 min,在此較優檢測條件下分析得到34種揮發性成分,其中烯烴類14種、酸類5種、酯類8種、芳香烴類4種、酮類3種。右旋萜二烯和萜品烯是母乳中的主要揮發性成分,本研究將為改善配方奶的風味提供一定的理論依據。

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