嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌雙重熒光PCR快速檢測方法的建立

黃建飛,劉小青,劉 斌,陳澤峰,蘭全學,陳 晶

(深圳市計量質量檢測研究院,食品檢測所，廣東深圳 518131)

阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)是一種革蘭氏陰性、依靠周生鞭毛運動、無芽孢兼性厭氧菌[1],曾用名為產黃色素陰溝腸桿菌(Enterobacteraloacae),1980年更名為阪崎腸桿菌[2],2008年Iversen等[3]將阪崎腸桿菌定義為腸桿菌的一個新屬克羅諾桿菌屬(Cronobactergen.nov)。該菌可導致新生嬰兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥。雖然發病率較低,但感染該菌的新生兒病死亡率高達40%～80%[4]。嬰幼兒食品中由阪崎腸桿菌污染所引起的嬰兒感染已經引起全球的廣泛關注,阪崎腸桿菌具有較強的繁殖能力,嬰兒配方食品中極微量的污染(<3 CFU/100 g)就可能大量繁殖[5]。因此需要建立嬰幼兒食品中阪崎腸桿菌的快速、靈敏和特異的檢測方法。

目前,食品中阪崎腸桿菌的檢測方法主要采用食品安全國家標準GB4789.402010 《食品微生物學檢驗 阪崎腸桿菌檢驗》,該方法以生化鑒定為主,檢測周期長,而且檢測結果受檢測人員的主觀因素影響,特異性和靈敏度均不高。PCR技術為阪崎腸桿菌的檢測提供了一種快速的方法,出入境檢驗檢疫行業標準SN/T18702016《出口食品中食源性致病菌檢測方法實時熒光PCR法》和SN/T 1632.3-2013《出口奶粉中阪崎腸肝菌(克羅諾桿菌屬)檢驗方法 熒光PCR方法》規定了阪崎腸桿菌(克羅諾桿菌屬)的單重熒光PCR檢測方法。單重熒光PCR檢測方法容易產生假陽性和假陰性問題,特異性多重熒光PCR檢測體系可以大大降低假陽性和假陰性機率。孟雙等[6]采用阪崎腸桿菌的16S rRNA與23S rRNA之間的內部轉錄間隔區(ITS)以及ompA基因作為檢測的靶標,建立了阪崎腸桿菌高靈敏、高特異的實時熒光雙重PCR快速檢測體系。Hu等[7]采用cgcA和內參基因建立雙重熒光PCR體系檢測阪崎腸桿菌。王金鳳等[8]以阪崎腸桿菌ompA為靶基因,以BHK21細胞的Nmi基因為擴增內標,建立阪崎腸桿菌實時熒光PCR快速檢測體系。Kaclikova等[9]采用阪崎腸桿菌基因MMS、Mfla1165和內參pUC19 DNA建立三重熒光PCR檢測體系。

目前國內外針對阪崎腸桿菌的熒光PCR檢測方法常見的靶基因主要有16S rRNA[10]、ITS序列[11]、ompA基因[12]、MMS基因[13]、cgcA[7]和ropB[14]等。本研究采用雙重熒光PCR體系,同時擴增阪崎腸桿菌的MMS和ompA基因,建立阪崎腸桿菌高靈敏、高特異性的實時雙重熒光PCR快速檢測體系。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

15株阪崎腸桿菌和24株非阪崎腸桿菌作為參照菌株見表1,所有菌株采用營養肉湯培養基37 ℃培養;實驗中所用引物見表2,引物和探針序列 均由上海生工技術公司合成;培養基營養肉湯、緩沖蛋白胨水(BPW) 北京路橋技術有限責任公司;Premix ExTaq聚合酶 Takara公司;嬰幼兒奶粉 市售。

表1 實驗菌株及特異性結果Table 1 Bacterial species used and RTPCR analysis

表2 實驗中常用引物Table 2 Primers used in this study

Agilent Mx3005P熒光PCR儀 Agilent公司;330K離心機 德國Sigma公司;SHP250生化培養箱 上海精宏。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取 采用水煮法提取細菌全基因組DNA。取過夜培養的營養肉湯菌液1.5 mL于無菌EP管中,13000 r/min常溫下離心30 s,棄去上清,將菌體懸浮于200 μL無菌水中,100 ℃水浴加熱15 min,13000 r/min常溫下離心30 s,取上清即可作為模板[15]。

1.2.2 雙重熒光PCR體系的建立 對MMS和ompA引物濃度和探針濃度采用L16(44)正交優化(重復三次實驗),各因素水平參照Hyeon等[16]和Ward等[17]多重熒光PCR反應體系并做出微小調整,各因素的四水平采用1、2、3和4進行編碼,如表3,其中2×Premix Ex Taq 12.5 μL,DNA模板1 μL,加無菌水至25 μL。反應條件:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性20 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s,共40個循環,擴增曲線Ct>35為陰性結果。

表3 正交實驗因素和水平Table 3 Factors and levels of orthogonal tests

1.2.3 雙重熒光PCR體系特異性分析 用水煮法提取39株菌的基因組DNA并以此為模板分別進行雙重熒光PCR擴增,觀察雙重熒光PCR體系的擴增效果,分析雙重熒光PCR體系檢測阪崎腸桿菌的特異性。

1.2.4 靈敏度實驗 將過夜培養的阪崎腸桿菌(ATCC 29544)培養液進行10倍梯度稀釋(10-1～10-8),取每個稀釋的梯度分別進行平板計數和煮沸法提取基因組DNA,采用雙重熒光PCR體系進行阪崎腸桿菌純培養物的靈敏度檢測。

1.2.5 抗干擾能力 取1 mL不同濃度的阪崎腸桿菌菌液(10倍梯度稀釋)分別和1 mL混合菌(24株非阪崎腸桿菌)等體積混合,直接煮沸法提取基因組DNA作為模板進行雙重熒光PCR,觀察該體系的抗干擾能力,同時對不同稀釋梯度的阪崎腸桿菌菌液進行平板計數。

1.2.6 人工污染奶粉的檢測 將過夜培養的阪崎腸桿菌進行10倍稀釋,取1 mL 10-5～10-8四個梯度加入到100 g奶粉中,同時進行平板計數。將上述人工污染的100 g奶粉加入到900 mL BPW培養液中培養24 h進行增菌,取1 mL增菌液收集菌體后采用水煮法提取DNA作為模板進行雙重熒光PCR檢測。

2 結果與分析

2.1 雙重熒光PCR體系建立

L16(44)正交實驗結果見表4,從表中可以看出,各因素水平主要影響MMS擴增效果,擴增曲線最優條件為MMS引物濃度0.6 μmol/L,探針濃度0.2 μmol/L,ompA引物濃度0.2 μmol/L,探針濃度0.2 μmol/L,對應ompA和MMS曲線的Ct值分別為18.51和19.23。

表4 正交實驗結果 Table 4 Results of orthogonal tests

2.2 雙重熒光PCR反應體系特異性

根據雙重熒光PCR體系對15株阪崎腸桿菌和24株非阪崎腸桿菌進行特異性分析,結果顯示15株阪崎腸桿菌的ompA和MMS基因都出現典型的擴增曲線,24株非阪崎腸桿菌ompA和MMS基因都無擴增曲線,結果見表1,說明本研究建立的體系對阪崎腸桿菌檢測具有較高的特異性。

2.3 靈敏度

雙重熒光PCR體系靈敏度檢測結果見圖1,當阪崎腸桿菌濃度為4.3×103CFU/mL時，ompA和MMS擴增曲線的Ct<35,當阪崎腸桿菌濃度為4.3×102CFU/mL時ompA和MMS擴增曲線的Ct>35,結果為陰性,該雙重熒光PCR體系下阪崎腸桿菌的靈敏度為4.3×103CFU/mL。

圖1 雙重熒光PCR檢測阪崎腸桿菌的靈敏度Fig.1 Sensitivity of Enterobacter sakazakii by duplex realtime PCR注:1～6對應的阪崎腸桿菌濃度為4.3×108～4.3×103 CFU/mL,圖中未標出Ct>35的陰性結果,●代表基因MMS擴增曲線,△代表基因ompA擴增曲線。

2.4 抗干擾能力

人工接種混合菌進行抗干擾實驗結果見圖2,結果表明在108CFU/mL其他混合菌存在的條件下,該PCR反應體系對阪崎腸桿菌的檢出限為103CFU/mL,靈敏度未受顯著影響。

圖2 雙重熒光PCR檢測阪崎腸桿菌的抗干擾能力Fig.2 Detection of Enterobacter sakazakii in the presence of mixed bacteriaby duplex realtime PCR注:在其他混合菌濃度為108 CFU/mL下,1～5對應的阪崎腸桿菌濃度為107～103 CFU/mL,●代表基因MMS擴增曲線,△代表基因ompA擴增曲線。

2.5 人工污染奶粉的檢測

取100 g經驗證后無阪崎腸桿菌污染的奶粉,溶于900 mL BPW中,每個瓶中分別加入1 mL含2×103、2×102、20和2 CFU/mL阪崎腸桿菌。結果見圖3，由圖3可知人工污染的奶粉都有典型的擴增曲線,能成功檢測出阪崎腸桿菌,而陰性未接菌樣品擴增后則沒有擴增曲線,奶粉中阪崎腸桿菌的檢出限為2 CFU/100 g。

圖3 雙重熒光PCR檢測奶粉中阪崎腸桿菌的靈敏度Fig.3 Sensitivity of realtime PCR for Enterobacter sakazakii detection in infant formula注:1～4對應的奶粉中阪崎腸桿菌濃度為2×103～2 CFU/100 g,●代表基因MMS擴增曲線,△代表基因ompA擴增曲線。

3 討論

外膜蛋白A是阪崎腸桿菌的主要毒力因子,在其致病過程中發揮了重要作用。Singamsetty等[18]人研究發現未攜帶外膜蛋白A的阪崎腸桿菌對宿主細胞的侵入力和黏附作用比正常菌株低7倍。Dong等[19]人通過ompA建立單重熒光PCR體系進行阪崎腸桿菌檢測,該體系特異性強,靈敏度為2.8×102CFU/mL。人工污染奶粉經過24 h增菌檢出限為1.1 CFU/mL。局部大分子合成操縱子序列是一段比較保守序列,可用于阪崎腸桿菌檢測,Wang等[20]人通過MMS序列建立熒光PCR體系進行阪崎腸桿菌檢測,該體系靈敏度為1.2×103CFU/mL。人工污染奶粉經過24 h增菌檢出限為100CFU/100 g。本實驗針對ompA和MMS基因建立的雙重熒光PCR檢測體系對阪崎腸桿菌純培養物的檢測靈敏度為4.3×103CFU/mL,抗干擾能力優異,在高濃度混合菌(108CFU/mL)的存在下阪崎腸桿菌的檢出限仍為103CFU/mL,靈敏度未受顯著影響。人工污染奶粉樣品的模擬實驗顯示,增菌后雙重熒光PCR反應體系可以檢測阪崎腸桿菌濃度為2 CFU/100 g。

4 結論

本研究建立了食品中阪崎腸桿菌的雙重熒光PCR體系,具有靈敏高、特異性和抗干擾能力強特點,經24 h增菌后能夠檢測出奶粉中較低含量的阪崎腸桿菌,為日常食品樣品中阪崎腸桿菌快速檢測提供有效分析手段。

[1]Healy B,Cooney S,Iversen S,et al. Cronobacter(Enternobactersakazakii):An opportunistic foodborne pathogen[J]. Foodborne Pathogens and Disease,2010,7(4):339350.

[2]Farmer R J J,Asbury M A,Hickman F W,et al.Enterobactersakazakii:A new species of“Enterobacteriaceae”isolated from clinical specimens[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,1980,30(3):569584.

[3]Inversen C,Mullane N,Mccardell B,et al.Cronobactergen. nov.,a new genus to accommodate the biogroups ofEnterobactersakazakii,and proposal ofCronobactersakazakiigen. nov.,comb. nov.,Cronobactermalonaticussp. nov.,Cronobacterturicensissp. nov.,Cronobactermuytjensiisp. nov.,Cronobacterdublinensissp. nov.,Cronobactergenomospecies1,and of three subspecies,Cronobacterdublinensissubsp.dublinensissubsp. nov.,Cronobacterdublinensissubsp.lausannensissubsp. nov. andCronobacterdublinensissubsp.lactaridisubsp. nov[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2008,58(6):14421447.

[4]Bowen A,Braden C R. InvasiveEnterobactersakazakiidisease in infant[J].Emerging Infectious Diseases,2006,12(8):11851189.

[5]FAO,WHO. Jiont FAO/WHO workshop onEnternobactersakazakiiand other microorganisms in powdered infant formula[R]. Geneva:WHO,2004.

[6]孟雙,李娟,王艷,等.阪崎腸桿菌實時熒光雙重TaqMan PCR快速檢測體系的建立[J].中國人獸共患病學報,2011,27(10):857860.

[7]Hu S F,Yu Y F,Li R,et al. Rapid detection ofCronobactersakazakiiby realtime PCR based on the cgcA gene and TaqMan probe with internal amplification control[J]. Canadin Journal of Microbiology,2016,62(3):191200.

[8]王金鳳,王建昌,胡連霞,等. 基于內參系統的阪崎腸桿菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J]. 食品與機械,2016,32(6):6872.

[9]Kaclikova E,Oravcova K. Identification of thermotolerantCronobacterstrains using multiplex realtime polymerase chain reaction[J]. Journal of Food and Nutrition Research,2016,55(3):278281.

[10]Malorny B,Wagner M. Detection ofEnterobactersakazakiistrains by realtime PCR[J]. Journal of Food Protection,2005,68(8):16231627.

[11]Li Y,Cai X N,Zhang X,et al. Real time PCR using Taqman and SYBR Green for detection ofEnterobactersakazakiiin infant formula[J].Journal of Microbiological Methods,2006,65(1):2131.

[12]Kandhai M C,Heuvelink A E,Reij M W,et al. A study into the occurrence ofCronobacterspp. in the Netherlands between 2001 and 2005[J]. Food Control,2010,21(8):11271136.

[13]Seo K H,Brackett R E. Rapid,specific detection ofEnterobactersakazakiiin infant formula using a real time PCR assay[J]. Journal of Food Protection,2005,68(1):5963.

[14]Li Y H,Chen Q M,Jiang H,et al. Novel development of a qPCR assay based in the ropB gene for rapid detection of Cronobacter spp[J].Current Microbiology,2016,72(4):436443.

[15]黎明,阮佳,李永新. 食源性阪崎腸桿菌的雙重PCR檢測方法的研究[J].中國衛生檢驗雜志,2013,23(6):14731476.

[16]Hyeon J Y,Park C,Choi I S,et al. Development of multiplex realtime PCR with internal amplification control for simultaneous detection ofSalmonellaandCronobacterin powdered infant formula[J].International Journal of Food Microbiology,2010,144(1):177181.

[17]Ward L N,Bej A K. Detection ofVibrioparahaemolyticus in shellfish by use of multiplexed realtime PCR with TaqMan fluorescent probes[J].Applied and Environment Microbiology,2006,72(3):20312042

[18]Singamsetty V K,Wang Y,Shimada H,et al. Outer membrane protein a expression inEnterobactersakazakiiis required to induce microtubule condensation in human brain microvascular endothelial cells for invasion[J]. Microbial Pathogenesis,2008,45(3):181191.

[19]Dong X H,Wu Q P,Wu K,et al. Real time PCR targeting ompA gene for detection ofCronobacterspp in powdered infant formula[J].Food Science and Biotechnology,2013,22(2):309313.

[20]Wang X,Zhu C Q,Xu X L,et al. Real time PCR with internal amplication control for the detection ofCronobacterspp.(Enterobactersakazakii)in food samples[J].Food Control,2012,25(1):144149.

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