厚皮甜瓜果實對鏈格孢侵染抵抗能力的差異

李 夢,馮作山,張明明,瑪爾哈巴·帕爾哈提,王玉紅,何 洋,白羽嘉

(新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

新疆是我國厚皮甜瓜主產區,由于新疆高溫炎熱,甜瓜采收期集中,采后極易遭受病原菌侵染,爛損較為嚴重,給瓜農帶來巨大經濟損失,限制了新疆甜瓜產業的良性發展[1]。而病原菌是引起采后病害導致果蔬爛損的重要原因[2],其中鏈格孢菌(Alternariaalternata)引起的黑斑病是甜瓜儲藏期間危害性最大的病害之一[34]。

新疆伽師瓜屬晚熟厚皮甜瓜,肉厚質細、香甜清脆、含糖量高、果皮致密無網紋、耐貯運[5]。861甜瓜為中晚熟厚皮甜瓜,肉質松脆、呈橘紅色、果皮富集網紋,貯藏性一般[6]。甜瓜果皮與果肉在結構、組織上有很大的區別。甜瓜果皮組織致密,富含果膠、纖維素和木質素等物質;果肉細脆,富含糖類、VC、胡蘿卜素等營養物質。研究發現鏈格孢侵染水楊酸處理過的伽師瓜和861甜瓜第0～13 d,果實未出現明顯病斑,但在侵染中后期,病斑迅速擴大,861甜瓜病斑大于伽師瓜[7]。伽師瓜和861甜瓜對病原菌侵染的抵抗能力存在差異,推測侵染前期果皮有效阻止了病原菌的侵染,中后期病原菌突破果皮的防御,果肉抵御能力較弱,病原菌在果肉中大量繁殖,病斑直徑迅速擴大。

植物受到外界傷害時,是通過硬化細胞壁,產生抗菌化合物(植物抗毒素)和抗菌蛋白,通過加速細胞死亡,形成壞死病斑,啟動體內一系列復雜的防御體系來抑制病原物的繁殖,進而保護自己[8]。植物抗病性機理主要涉及活性氧的產生、活化苯丙烷代謝途徑、積累病程相關蛋白等[9]。幾丁質酶和β1,3葡聚糖酶在植物抗病過程中存在相關性,具有降解真菌細胞壁的作用[10]。苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸羥化酶、4香豆酸輔酶A連接酶是苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶系[11],其酶活性的提高是植物抗逆性增強的表現[12]。

本研究為了解甜瓜抗病性差異的原因,以伽師瓜和861甜瓜果實為實驗材料,接種鏈格孢菌,測量貯藏期間果皮與果肉病斑大小,分析病程相關蛋白與苯丙烷代謝酶活性變化規律,比較甜瓜與甜瓜組織抵抗病原菌侵染的差異,為甜瓜采后病害的控制研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

伽師瓜(卡拉克塞) 采摘于新疆喀什地區伽師縣,選取可溶性固形物≥14%,單果重(3.5±0.5)kg,無病蟲害、無機械損傷的果實;861甜瓜 采摘于新疆喀什地區伽師縣,選取可溶性固形物≥15%,單果重(3.8±0.5)kg,無病蟲害、無機械損傷的果實;鏈格孢菌(Alternariaalternata) 新疆農業大學食品科學與藥學學院微生物實驗室提供,分離自伽師瓜自然發病的果實,PDA斜面保存；硼砂、硼酸、冰醋酸、無水醋酸鈉、四硼酸鉀、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞硫酸鈉、甘油、氯化鎂、抗壞血酸、EDTA 均為分析純,天津市光復精細化工研究所;3,5二硝基水楊酸、結晶酚、β巰基乙醇、L苯丙氨酸、p香豆酸、輔酶A、二硫蘇糖醇、亮抑酶肽、反式肉桂酸、幾丁質、昆布多糖、蝸牛酶、ATP、PMSF、NADPNa2、G6pNa 生工生物工程(上海)股份有限公司。

FA2104N型電子天平 上海民橋精密科學儀器有限公司;NBCJB型無菌操作臺、MHP250型恒溫培養箱 上海鴻都電子科技有限公司;LDZX50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;TGL16G型高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠;TU1810PC紫外可見分光光度計 北京普析通用公司;FE20型pH計 梅特勒托利多儀器有限公司;XSP2C型顯微鏡 上海蔡康光學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 損傷接種 鏈格孢菌接種于PDA培養基,28 ℃培養7 d,收集孢子。用含有0.01% Tween80的無菌水配制濃度為1×106個/mL孢子懸浮液。甜瓜果實用2%的過氧化氫清洗表面并浸泡30 s進行消毒,用清水沖洗干凈后晾干,7 ℃預冷24 h。在甜瓜果實赤道等距刺孔6個(直徑3.5 mm),深度為5 mm,接種20 μL的孢子懸浮液,對照組接入等量的無菌水。接種后,置于7 ℃、相對濕度85%～90%的冷庫貯藏。

1.2.2 取樣方法 分別于處理后0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d在病斑周圍5 mm處收集果皮和果肉組織,每次隨機選取9個甜瓜進行取樣,液氮速凍,80 ℃保存。

1.2.3 病斑直徑的測量 在接種鏈格孢菌部位將甜瓜果實縱向剖開,測定甜瓜果皮與果肉過敏反應組織,每次測定6個瓜,計算平均值,即為病斑直徑。

1.2.4 幾丁質酶(CHT)活性的測定 參照曹建康[13]的方法,以每秒每克鮮重樣品中酶分解膠狀幾丁質產生1×10-9mol N乙酰糖胺為一個幾丁質酶活性單位(U),活性以U·s-1·g-1FW表示。

1.2.5β1,3葡聚糖酶(GLU)活性的測定 參照曹建康[13]的方法,以每秒每克鮮重樣品中酶分解昆布多糖產生1×10-9mol葡萄糖為一個β1,3葡聚糖酶活性單位(U),活性以U·s-1·g-1FW表示。

1.2.6 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測定 參照曹建康[13]的方法,以每小時每克鮮重果蔬組織反應吸光度增加0.01時為1個PAL活性單位(U),活性以U·h-1·g-1FW表示。

1.2.7 肉桂酸羥化酶(C4H)活性的測定 參照范存斐方法[12]并修改,粗酶液制備:取10 g冷凍果肉組織和5 g果皮組織,分別加入10 mL和20 mL提取液[50 mmol/L pH8.9 TrisHCl緩沖液,15 mmol/Lβ疏基乙醇,4 mmol/L氯化鎂,5 mmol/L VC,10 μmol/L亮抑酶肽,1 mmol/L PMSF,0.15%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮,10%丙三醇],在冰浴條件下充分研磨后,于4 ℃、12000×g下離心20 min,收集上清液即為C4H粗酶提取液。反應體系:1.6 mL C4H粗酶提取液,4.4 mL緩沖液(2 μmol/L反式肉桂酸,50 mmol/L pH8.9 TrisHCl緩沖液,2 μmol/L NADPNa2,5 μmol/L G6-pNa)。立即在340 nm處比色。參比為不加酶提取液(加入1.6 mL蒸餾水)。以OD值每小時變化0.01為1個酶活性單位(U),酶活性單位為 U·h-1·g-1FW。樣品重復測3次。

1.2.8 4香豆酸輔酶A連接酶(4CL)活性的測定 參照范存斐方法并修改[12],粗酶液制備:取10 g冷凍果肉組織和2 g果皮組織,分別加入10 mL和18 mL 0.2 mol/L TrisHCl緩沖液(含25%丙三醇、0.1 mol/L二硫蘇糖醇、pH8.0)及少量石英砂,然后于4 ℃、12000×g條件離心20 min,收集上清液即為4CL粗酶提取液,并立即用于酶活測定。反應體系:1.8 mL 15 μmol/L Mg2+(硫酸鎂或氯化鎂),0.6 mL 5 μmol/mL p香豆酸,0.6 mL 50 μmol/mL ATP,0.6 mL 1 μmol/mL Co A以及2 mL酶液。40 ℃下反應10 min,在333 nm處測定吸光度值,以每分鐘內OD333變化0.1為1個活性單位(U)。酶活性單位為U·min-1·g-1FW,對照不加香豆酸。樣品重復測3次。

1.3 數據分析與作圖

采用SPSS 19.0軟件對實驗數據進行處理,Duncan’s多重比較進行差異顯著性分析,Origin 8.5軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鏈格孢菌侵染甜瓜果實病斑直徑的變化

甜瓜接種鏈格孢菌,每3 d測定病斑大小(圖1)。鏈格孢菌侵染甜瓜第9 d,果皮與果肉出現病斑,并隨貯藏時間延長呈不斷擴大的趨勢,果肉的病斑直徑大于果皮;從第18 d開始,861甜瓜的病斑擴大速度大于伽師瓜;第30 d,伽師瓜和861甜瓜接種果肉的病斑直徑分別是對應果皮的1.31倍和1.33倍(p<0.01),并且861甜瓜果皮與果肉病斑直徑分別是伽師瓜的1.28倍和1.30倍(p<0.01)。

圖1 鏈格孢菌侵染甜瓜果實病斑直徑的變化Fig.1 Change in lesion diameter of muskmelon inoculated with A.alternata

2.2 鏈格孢菌侵染對甜瓜果實病程相關蛋白的影響

2.2.1 對甜瓜果實CHT活性的影響 CHT具有降解病原菌細胞壁,抑制抗病原侵染,抑制真菌生長的作用。病原菌的侵染可以增強植物CHT活性[14]。甜瓜接種鏈格孢菌期間,果皮與果肉的CHT活性隨貯藏時間延長均呈先升高后下降的變化趨勢,接種果實的CHT活性顯著高于對照(p<0.05),果皮的CHT活性顯著高于果肉(p<0.05)。鏈格孢菌侵染伽師瓜第21 d和第24 d,接種果皮和果肉的CHT活性分別達到峰值,果皮活性是果肉的2.33倍(p<0.01)(圖2A);鏈格孢菌侵染861甜瓜同樣是在第21 d和第24 d,接種果皮和果肉的CHT活性達到峰值,果皮活性是果肉的3.15倍(p<0.01)(圖2B)。在貯藏期間,伽師瓜接種果皮與果肉的活性峰值分別是861甜瓜的1.29倍和1.74倍,差異極顯著(p<0.01)。

圖2 鏈格孢菌侵染對伽師瓜(A)和861甜瓜(B)CHT活性的影響Fig.2 Effects of A. alternata infection on CHT activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

2.2.2 對甜瓜果實GLU活性的影響 GLU具有破壞病原菌細胞壁,并從病原菌細胞壁中釋放激發子誘導植株產生系統抗性的作用[10]。甜瓜接種鏈格孢菌期間,果皮與果肉的GLU活性隨貯藏時間延長呈先升高后下降的變化趨勢,接種果實的GLU活性均高于對照,果皮的CHT活性顯著高于果肉(p<0.05)。鏈格孢菌侵染伽師瓜第18 d和第21 d,接種果皮和果肉的GLU活性分別達到峰值,果皮活性是果肉的1.85倍(p<0.01)(圖3A);鏈格孢菌侵染861甜瓜第18 d,接種果皮和果肉的GLU活性達到峰值,果皮活性是果肉的2.08倍(p<0.01)(圖3B)。伽師瓜接種果皮與果肉的活性峰值分別是861甜瓜的1.08和1.22倍,無顯著差異。

圖3 鏈格孢菌侵染對伽師瓜(A)和861甜瓜(B)GLU活性的影響Fig.3 Effects of A. alternata infection on GLU activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

2.3 鏈格孢菌侵染對甜瓜果實苯丙烷代謝酶活性的影響

2.3.1 對甜瓜果實PAL活性的影響 PAL是苯丙烷類代謝途徑的關鍵酶和限速酶,參與了多種激發子誘導的抗性,增強了植物對病原物侵染的抵抗能力[15]。甜瓜接種鏈格孢菌期間,果皮與果肉的PAL活性隨貯藏時間延長呈先升高后下降的變化趨勢,接種果實的PAL活性均高于對照,果皮的PAL活性顯著高于果肉(p<0.05)。鏈格孢菌侵染伽師瓜第21 d和第24 d,接種果肉和果皮的PAL活性分別達到峰值,果皮活性是果肉的2.35倍(p<0.01)(圖4A);鏈格孢菌侵染861甜瓜第18 d和第21 d,接種果肉和果皮的PAL活性分別達到峰值,果皮活性是果肉的1.91倍(p<0.01)(圖4B)。伽師瓜接種果皮的活性峰值是861甜瓜的1.48倍(p<0.01),接種果肉的活性峰值是861甜瓜的1.21倍,差異不顯著。

圖4 鏈格孢菌侵染對伽師瓜(A)和861甜瓜(B)PAL活性的影響Fig.4 Effects of A. alternata infection on PAL activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

2.3.2 對甜瓜果實C4H活性的影響 C4H與果實體內咖啡酸和阿魏酸等物質的合成前體p香豆酸的合成密切相關,這些酚酸可直接毒殺病原物,對病原菌的生長繁殖產生抑制[1617]。甜瓜接種鏈格孢菌期間,果皮與果肉的C4H活性隨貯藏時間延長呈先升高后下降的變化趨勢,接種果實的C4H活性顯著高于對照(p<0.05),果皮的C4H活性顯著高于果肉(p<0.05)。鏈格孢菌侵染伽師瓜第24 d,接種果皮與果肉的C4H活性均達到峰值,果皮活性是果肉的1.59倍(p<0.01)(圖5A);鏈格孢菌侵染861甜瓜第21 d,接種果皮與果肉的C4H活性達到峰值,果皮活性是果肉的1.64倍(p<0.01)(圖5B)。伽師瓜接種果皮與果肉的活性峰值分別是861甜瓜的1.34倍和1.38倍,差異極顯著(p<0.01)。

2.3.3 對甜瓜果實4CL活性的影響 4CL是控制苯丙烷主途徑向分支途徑轉折的關鍵酶,在植物與外界環境互作過程中發揮重要作用[15]。甜瓜接種鏈格孢菌期間,果皮與果肉的4CL活性隨貯藏時間延長呈先升高后下降的趨勢,接種果實的4CL活性顯著高于對照(p<0.05),果皮的4CL活性顯著高于果肉(p<0.05)。鏈格孢菌侵染伽師瓜第21 d和第24 d,接種果皮與果肉的4CL活性分別達到峰值,果皮活性是果肉的2.43倍(p<0.01)(圖6A);鏈格孢菌侵染861甜瓜同樣是第21 d和24 d,接種果皮和果肉的4CL活性達到峰值,果皮活性是果肉的1.79倍(p<0.01)(圖6B)。伽師瓜接種組果皮與果肉4CL活性峰值分別是861甜瓜的1.87和1.38倍,差異極顯著(p<0.01)。

圖6 鏈格孢菌侵染對伽師瓜(A)和861甜瓜(B)4CL活性的影響Fig.6 Effects of A. alternata infection on 4CL activity of Jiashi(A)and 861 muskmelon(B)fruit

3 討論

當病原菌入侵時植物能夠非常有效地激活自身產生防御反應,其防御體系是一個多因素相互作用的復雜體系,包括各種防御酶和抗病物質等[1820]。伽師瓜和861甜瓜受到鏈格孢菌侵染后,在貯藏第9 d出現病斑,9～30 d病斑直徑不斷擴大,其中861甜瓜病斑直徑大于伽師瓜,果肉的病斑直徑大于果皮,是由于伽師瓜果皮與果肉中的防御酶和抗病物質含量高于861甜瓜。

鏈格孢菌侵染后,甜瓜CHT、GLU活性均高于對照,并呈先升高后降低的變化趨勢,原因在于鏈格孢菌侵染甜瓜前期,誘導甜瓜CHT和GLU的產生和積累,增高了甜瓜CHT和GLU活性[10];伽師瓜果皮與果肉在抵抗鏈格孢菌侵染高峰時期的酶活性均高于861甜瓜,甜瓜果皮的酶活性均顯著高于果肉,是由于伽師瓜果實中CHT和GLU含量的積累高于861甜瓜且兩種甜瓜果皮中的含量高于果肉;貯藏后期CHT和GLU活性降低,原因是鏈格孢菌侵染突破了甜瓜果皮與果肉的防線。

鏈格孢菌侵染后,甜瓜PAL、C4H、4CL酶活性均高于對照,并呈先升高后降低的變化趨勢,伽師瓜果皮與果肉在抵抗鏈格孢菌侵染高峰時期的酶活性均高于861甜瓜,甜瓜果皮的酶活性均顯著高于果肉,原因在于鏈格孢菌侵染后,激活了甜瓜果實體內苯丙烷代謝,引起PAL、C4H和4CL活性提高[21]。PAL參與多種激發子誘導的抗性,增強植物對病原菌侵染的抵抗能力[15,22];C4H活性的增強有利于果實體內酚酸物質的合成,這些酚酸可直接毒殺病原物,對病原菌的生長繁殖產生抑制[1617];4CL代謝產物的積累具有抵抗病原物侵染、增強果實表皮結構,提高植物抗病性的作用[15]。

病程相關蛋白和苯丙烷代謝酶活性與植物抗病性密切相關,一般認為植物體內酶活性與抗病性呈正相關[2324]。伽師瓜抗病酶活性高于861甜瓜,果皮酶活性高于果肉,說明了伽師瓜抗病性高于861甜瓜,果皮抗病性強于果肉。

4 結論

伽師瓜和861甜瓜接種鏈格孢菌,貯藏期間861甜瓜病斑直徑大于伽師瓜,甜瓜果肉病斑直徑顯著大于果皮。兩種甜瓜果實通過增高CHT和GLU及PAL、C4H、4CL活性來抵御鏈格孢菌的侵染,接種伽師瓜的病程相關蛋白與苯丙烷代謝酶活性峰值均高于861甜瓜,接種甜瓜果皮的酶活性顯著高于果肉。伽師瓜的抗病能力強于861甜瓜,果皮的抗病能力強于果肉。

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