海藻糖類抗凍保水劑對凍藏南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)品質的影響

白 冬,鄭 煒,梁 佳,俞群娣,黃 菊,謝 超

(浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316000)

南美白對蝦(Litopenaeusvannamei)肉質鮮美,營養豐富,富含氨基酸、多肽、多不飽和脂肪酸等多種營養成分。但是,由于其體內含有大量的自溶酶和非蛋白質氮,因此在捕撈和貯藏的過程中容易受到微生物的污染,極易腐爛,這也導致其死后變質速度快,質構特性改變嚴重,產生明顯的異味[12]。不僅如此,在貯藏過程中蝦中的蛋白質,如肌原纖維蛋白,肌質蛋白和結締組織蛋白的改性也會直接影響加工貯藏過程中蝦的嫩度,保水能力以及風味等品質[3]。

冷凍貯藏作為一種長期保存蝦類產品最常用的方法,可以抑制微生物的生長,降低酶的活性。但在冷凍貯藏的過程中,產品的質量得不到有效保證[4]。另外,產品凍融的過程中也有可能發生蛋白質變性,脂質氧化,保水能力下降等不良變化,對產品的營養品質產生了負面影響,降低了消費者對蝦的可接受性[5]。

焦磷酸鹽是目前水產品中常用的添加劑,能夠顯著的改善產品的功能特性,對水產品質量的提高發揮了積極地作用,例如提高新鮮食物的保水性,減少冷凍產品的融化損失,保持產品質構特征,減緩氧化酸敗等[67]。但許多國家對磷酸鹽作為防腐劑的使用有嚴格的規定[8],在蝦仁的處理過程中,焦磷酸鹽的添加仍存在著一些問題,某些不法商販為自己利益,在蝦類產品的加工過程中過度添加焦磷酸鹽,出現半透明粘稠的膠體物質,以假冒真,從而引發消費欺詐問題[9]。因此，在保證產品品質的同時并杜絕此類問題的發生,研究新的添加劑用以替代焦磷酸鹽成為蝦類產品開發的一個重要課題[1011]。

研究發現海藻酸鈉寡糖在某些植物細胞中能夠促進生長活性的增強[12],能夠有效地促進氧化自由基的清除[13],并且能與魚肌原纖維蛋白共軛提高其溶解度[14]。雖然海藻糖、海藻酸鈉及其寡糖的優點及其應用得到了食品領域的廣泛關注,但在蝦類保鮮領域卻少有研究。因此,本文通過對上述糖類的抗凍效果及其對冷凍南美白對蝦仁質量影響的研究,開發出一種能夠有效提高冷凍蝦類產品質量的抗凍保鮮劑,為水產品冷凍保鮮提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活南美白對蝦 體長9～10 cm,由舟山越洋食品有限公司提供,將鮮活蝦體置于裝有冰塊的保溫箱內,30 min內運回實驗室;海藻糖(C12H22O11)、海藻酸鈉([C6H7NaO6]n,32～200 kDa)、海藻酸鈉寡糖([C6H7NaO6]n,n=2～4,440～800 Da) 北京國藥化學試劑有限公司;焦磷酸鈉 純度>99%,食品級,青島博智匯力生物科技有限公司;順丁烯二酸、牛血清蛋白、三氯乙酸、亞硫酸氫鈉及米吐爾等其他試劑 均為分析純。

CR10型便攜式色差儀 日本柯尼卡美能達公司;DHS20A鹵素水分測定儀 上海菁海儀器有限公司;HD3A型水分活度測定儀 無錫市華科儀器儀表有限公司;均質機 德國IKAStaufen。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原料處理 經前期預實驗發現0.5%與1.0%磷酸鹽類對蝦仁有較好的抗凍保水效果,因此研究中使用的溶液如下:蒸餾水(陰性對照);0.5%和1.0%(w/v)焦磷酸鈉(陽性對照);0.5%和1.0%(w/v)海藻糖;0.5%和1.0%(w/v)海藻酸鈉;0.5%和1.0%(w/v)海藻酸鈉寡糖。將去頭、去殼和去腸的蝦立即浸入提前制備好的溶液(0 ℃)中,浸泡30 min,使冷凍保護物質擴散到蝦的表面上。

在浸泡完成后取出樣品,瀝干1 min后準確稱取單個蝦仁初始重量M1,并在30 ℃的冷凍機中冷凍3 h。隨后,將來自不同組的冷凍樣品裝入聚苯乙烯托盤中,每盤20只樣品并編號,將其放置在聚酰胺聚乙烯袋(20.0 cm×25.0 cm,150 μm)中,所有處理好的樣品在18 ℃下貯藏6周,每個組的樣品在冷凍貯藏期間每隔1周進行相關分析,在分析之前,將冷凍樣品在冰箱(4 ℃)中解凍3 h。每個組樣品平行測定三次。

1.2.2 解凍損失的測定 在解凍后立即測試冷凍蝦的解凍損失,參照文獻[15]的方法,對樣品進行離心。每組隨機選取3只樣品,在4 ℃下以1500×g離心10 min后,準確稱量每個樣品離心后的重量M2,根據冷凍前的初始重量M1,計算冷凍蝦的解凍損失如下:解凍損失(%)=(M1M2)/M1×100。

1.2.3 顏色測定 采用色差儀測定蝦仁的L*、a*、b*值,測定前進行白板校正。以蝦仁第2腹節為測試點,每個處理組取3個樣品(3個重復),取平均值作為最終測試結果[16]。

1.2.4 肌原纖維蛋白含量的測定 依據夏秀芳等的研究[17],使用搗碎機將每個樣品切碎,并在10倍體積的0 ℃緩沖液(Trismaleate 20 mmol/L,KCl 0.05 mol/L,pH=7.0)中利用均質機,在0～4 ℃以10000 r/min均質60 s。將得到的勻漿物在0～4 ℃以10000×g離心15 min,取沉淀,將沉淀物置于相同的緩沖液中再次萃取。反復均質和離心兩次之后,將所得的沉淀物加入到10倍體積的0 ℃緩沖液(Tris-maleate 20 mmol/L,KCl 0.6mol/L pH=7.0)中,再將混合物均質并在4 ℃下以6000×g離心15 min。最后所得上清液即為肌原纖維蛋白溶液,將其在適當稀釋后通過Lowry[18]等方法進行測定,以牛血清白蛋白用作標準液(線性方程為y=0.2308x0.2931,R2=0.9895),重復測定三次。

1.2.5 Ca2+ATP酶活性的測定 根據蒙健宗等[19]方法配制混合溶液,取1.0～2.0 mg/mL樣品肌原纖維蛋白懸浮液,每組樣品中加入預冷的混合底物:0.50 mol/L馬來酸緩沖液,0.10 mol/L CaCl2,20 mmol/L ATP,調節pH=7.0。反應液充分混勻,在30 ℃振蕩溫育5 min,反應完成后取出置于冰浴中,隨后加入1.0 mL冷凍的15%(w/v)三氯乙酸(TCA)終止反應。然后將反應混合物以4000×g離心5 min。

根據上步操作,測定在上清液中釋放的無機磷酸鹽的量。在離心后的上清液中加入鉬磷比色劑,于30 ℃下顯色反應30 min。隨后加入25%(w/v)檸檬酸三鈉終止反應,在波長650 nm處測定OD值,根據標準曲線(線性方程為y=0.6308x0.3219,R2=0.4892)計算得到磷含量。Ca2+ATP酶活性以每毫克蛋白質每分鐘酶促水解ATP生成無機磷酸鹽的含量表示[μmol Pi/(mg·min)][20]。

1.2.6 蘇木精伊紅染色實驗 在室溫下取蝦仁背部肌肉組織于包氏固定液中固定24 h,梯度乙醇脫水,進一步石蠟包埋,切片染色,然后用光學電子顯微鏡觀察肌肉組織結構變化情況。

1.2.7 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 取蝦肉5 g,加入5%的SDS溶液(50 g/L)45 mL,在10000 r/min條件下均質5 min,每均質30 s,停止30 s,以防過熱。均質后的溶液置于85 ℃恒溫水浴中保溫1 h,接著在10000 r/min條件下離心30 min(4 ℃),取上清液備用。

根據Laemmli的方法[21],使用5%濃縮膠和12%分離膠對樣品蛋白上清液和標準蛋白溶液進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)。電泳完成后的凝膠條在甲醇醋酸溶液中用0.1%考馬斯亮藍R250進行染色,染色完成后用乙醇醋酸溶液對其進行脫色。通過將其與標準蛋白質溶液(10～200 kDa)條帶進行比較來確定樣品蛋白的相對量。

1.2.8 數據處理 數據處理及作圖采用Origin 8.1、SPSS 13.0統計分析軟件,結果為平均值±標準偏差,采用SNK法分析測驗顯著性水平(p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 解凍損失

對于冷凍蝦類產品而言,解凍損失是其質量水平的重要衡量標準之一,對添加不同抗凍劑的冷凍蝦仁及其對照組的解凍損失進行了測定,結果如表1所示。

表1 不同抗凍劑對樣品解凍損失的影響(%)Table 1 Effect of different cryoprotective saccharides on thawing loss of shrimp during frozen storage(%)

根據表1可知,隨著貯藏時間的延長,水處理樣品的解凍損失顯著升高(p<0.05)。0.5%和1.0%的海藻酸鈉處理的樣品,其解凍損失與水處理對照組之間沒有顯著差異(p>0.05)。相比之下,在凍藏期間,0.5%和1.0%焦磷酸鹽、海藻糖和海藻酸鈉寡糖3種抗凍劑處理的樣品,其解凍損失保持在較低的水平。因此,與陰性對照組相比,這3種抗凍劑處理的樣品顯示出更高(p<0.05)的抗凍效果,3組間的差異無統計學意義(p>0.05)。

陰性對照組的解凍損失明顯增加(5.85%～8.60%),可能歸因于樣品肌肉蛋白質的不可逆性和凍結過程中肌肉纖維的破壞,這是由冰凍貯藏期間形成大冰晶而引起的[22]。冷凍過程中形成的結晶水在解凍過程中沒有被樣品組織再吸收,導致樣品解凍損失較高。通過數據可知,與陰性對照組相比，海藻酸鈉溶液對冷凍蝦的解凍損失沒有顯著差異。一些研究表明,低分子質量的碳水化合物可以提高肌原纖維蛋白的穩定性[2324]。本研究中使用的海藻酸鈉的分子量范圍為32～200 kDa,因此在冷凍過程中很難與水發生相互作用。這表明高分子量的海藻酸鈉對冷凍蝦并無抗凍作用,反而干擾了肌肉蛋白質的三維結構[25]。另外在實驗中發現,原料在添加了海藻酸鈉后變得非常粘稠,這種性質也會降低其在加工上的實用性。焦磷酸鈉處理的樣品在解凍后保持了蝦仁本身的特性,這與Ribeiro發現一致[26],在冷凍過程中,焦磷酸鈉對樣品組織具有抗凍效果。在凍藏過程中,海藻糖處理組顯著降低了凍蝦體液的流失(解凍損失為5.00%～5.44%),且1.0%高濃度處理優于0.5%低濃度處理組。其原因為海藻糖分子在肌肉組織中與蛋白質結合形成晶狀體,從而使得蛋白質分子結構更緊密穩定,在凍藏期間起到保護作用。海藻酸鈉寡糖同樣可顯著降低樣品的解凍損失(5.04%～5.52%),高濃度處理組效果優于低濃度處理組。其原因可能在于海藻膠低聚糖可與肌肉中Ca2+、Mg2+發生螯合作用形成穩定的三維網絡,從而降低了蝦仁在解凍過程中水分的流失。綜上所述,1%的海藻糖與海藻酸鈉寡糖對凍蝦具有更好的抗凍保水性。

2.2 顏色變化

水產品的顏色是十分重要的一個感官指標,直接決定了消費者的購買決策。在0～6周的凍藏期內,不同處理組蝦仁的a*、b*值變化不顯著(p>0.05),表明以上各抗凍劑處理對蝦仁紅綠度和黃藍色光線的吸收和反射無顯著影響。因此僅討論冷凍蝦仁的L*值隨著冷凍時間變化的情況,結果如表2所示。

表2 不同抗凍劑對凍藏蝦仁L*值的影響Table 2 Effect of different antifreeze agents on the L* value of frozen shrimp

根據表2可知,在冷凍貯藏3周后,水處理組、0.5%和1.0%海藻酸鈉溶液處理組的蝦仁樣品,其L*值發生了顯著的下降(p<0.05),色澤由明亮逐漸變暗,可能此時凍藏的蝦仁肌肉肌原纖維蛋白結構破壞程度以及ATPase活性下降程度較大,使得表觀明度發生變化。然而與前述樣品相比,兩種濃度的焦磷酸鈉、海藻糖和海藻酸鈉寡糖溶液處理的樣品，在冷凍貯藏期間L*值的變化不明顯,樣品稍顯暗淡。1.0%焦磷酸鈉、1.0%海藻糖和1.0%海藻酸鈉寡糖處理組之間無顯著差異(p>0.05)。海藻糖和海藻酸鈉寡糖在冷凍過程中提高了蛋白質結構的穩定性,增強了樣品肌肉的持水能力,這顯著減緩了冷凍貯藏過程中形成的大冰晶對樣品組織造成的物理損傷。

2.3 肌原纖維蛋白分析

肌原纖維蛋白對水產品的品質起到重要的作用,其含量直接影響了蛋白的彈性、多汁性、口感等感官指標。凍藏南美白對蝦樣品肌原纖維蛋白的測定結果見圖1。

圖1 不同抗凍劑對凍藏蝦仁肌原纖維蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different antifreeze agents on the myofibrillar protein content of frozen shrimp

從圖1中可以看出,所有處理組中,肌肉中的肌原纖維蛋白含量均隨冷凍貯藏時間增加發生顯著下降(p<0.05)。未進行冷凍的新鮮樣品肌肉初始肌原纖維含量為115.6 mg/g。冷凍貯藏6周后,水處理組和0.5%、1.0%海藻酸鈉處理組樣品的肌原纖維含量分別降至84.6、85.1和84.8 mg/g。相比之下,焦磷酸鹽、海藻糖和海藻酸鈉寡糖處理的樣品含量較高,其肌原纖維含量分別達到92.6～95.9、100.6～104.2、101.0～103.2 mg/g。根據實驗測得的數據發現,與水處理相比,樣品經過1.0%海藻糖與1.0%海藻酸鈉寡糖抗凍劑處理過后,其肌肉中肌原纖維蛋白的流失明顯的減少(p<0.05)。

2.4 Ca2+ATP酶活性

Ca2+ATP酶活性是衡量被測樣本生物活性的一項重要指標,研究中對不同抗凍劑處理過的南美白對蝦仁樣品進行了Ca2+ATP酶活性的測定,結果如圖2所示。

圖2 不同抗凍劑對凍藏蝦仁Ca2+ATP酶活性的影響Fig.2 Effect of different antifreeze agents on the Ca2+ATPase activity of frozen shrimp

通過圖2可知,不同抗凍劑處理過的樣品在凍藏期間,Ca2+ATP酶活性均有所降低。未經冷凍新鮮樣品的初始Ca2+ATP酶活性為0.162 μmol Pi/mg·min,在冷凍貯藏6周后,陰性對照組樣品Ca2+-ATP酶活性顯著下降(p<0.05),降低至0.092 μmol Pi/mg·min,陰性對照組和海藻酸鈉處理組樣品之間無顯著差異(p>0.05),焦磷酸鈉處理組樣品的Ca2+ATP酶活性降低至0.122～0.131 μmol Pi/(mg·min),而海藻糖和海藻酸鈉寡糖處理樣品中的活性分別為0.134～0.141 μmol Pi/(mg·min)和0.135～0.142 μmol Pi/(mg·min),酶活性差異不明顯。但與陰性對照組相比,海藻糖和海藻酸鈉寡糖抗凍劑處理的樣品表現出了較高的Ca2+ATP酶活性(p<0.05)。

2.5 蘇木精伊紅染色實驗

染色實驗通過對樣品的微觀結構進行觀察,能夠更為直觀的評價幾種抗凍劑對冷凍貯藏的南美白對蝦仁的抗凍效果。不同抗凍劑處理的蝦仁樣品肌肉組織縱剖面微觀結構如圖3所示。

圖3 不同抗凍劑對于蒸煮蝦仁肌肉組織結構的影響Fig.3 Effect of different antifreeze agents on the muscular tissue structure of frozen shrimp注:A為未經冷凍處理的新鮮蝦肌肉,B為水處理過的蝦肌肉,C為1.0%焦磷酸鈉處理過的蝦肌肉,D為1.0%海藻酸鈉處理過的蝦肌肉,E為1.0%海藻糖處理過的蝦肌肉,F為1.0%海藻酸鈉寡糖處理過的蝦肌肉。

通過圖3可以看出,未經冷凍的新鮮樣品(圖3A)的肌纖維(紅)之間緊密連接,纖維間的間隙(空白)較窄小。在6周的冷凍貯藏之后,水處理組樣品(圖3B)肌纖維間的間隙明顯增大,其中部分肌纖維變得松散甚至紊亂,說明肌肉結締組織的機械強度相對較弱,可能是由于冷凍貯藏期間形成的大冰晶對樣品組織造成物理損傷。相比之下,焦磷酸鈉、海藻糖和海藻酸鈉寡糖處理組(圖3C、圖3E、圖3F)樣品的肌纖維間隙明顯更小,肌纖維比水處理組樣品排列更為緊密。海藻酸鈉處理組(圖3D)與水處理組樣品相比,肌肉組織的物理結構產生相似變化,這與前文所述的結論相一致。

2.6 SDSPAGE

對添加不同抗凍劑處理組樣品的蛋白質進行SDSPAGE實驗,得到的電泳圖譜如圖4所示。根據電泳圖譜,約200 kDa的寬帶對應肌球蛋白重鏈(MHC),同時還存在副肌球蛋白(約90 kDa)和肌動蛋白(約40 kDa)。附加條帶對應原肌球蛋白(約37 kDa)和肌球蛋白輕鏈(MLC,約20 kDa)。與抗凍劑處理組樣品(圖4A～圖4D)相比,水處理組樣品(圖4E)中的MHC、副肌球蛋白、肌動蛋白和MLC的強度在冷凍貯藏6周后發生顯著降低。在沒有添加防凍劑處理的樣品中,MHC和MLC條帶開始顯著消失。這可能是由于冷凍貯藏期間蛋白發生變性或水解。另外,內源性蛋白酶(如組織蛋白酶、鈣蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶的氧化作用也促進了蛋白質的降解。海藻酸鈉處理的樣品與焦磷酸鈉、海藻糖和海藻酸鈉寡糖處理的樣品相比,其副肌球蛋白和肌動蛋白條帶的強度具有明顯的降低。

圖4 不同抗凍劑凍藏6周后肌肉蛋白的SDSPAGE分析Fig.4 SDSPAGE analysis of muscle proteins after 6 weeks of frozen antifreeze注:A為1.0%焦磷酸鈉處理過的蝦肌肉,B為1.0%海藻糖處理過的蝦肌肉,C為1.0%海藻酸鈉處理過的蝦肌肉,D為1.0%海藻糖處理過的蝦肌肉,E為水處理過的蝦肌肉,M為標準分子量(20～200 kDa)。

3 結論

0.5%和1.0%焦磷酸鹽、海藻糖和海藻酸鈉寡糖浸泡處理顯著降低了蝦仁解凍損失率，同時還具有保持凍藏蝦仁色澤白色鮮艷的作用。焦磷酸鹽、海藻糖和海藻酸鈉寡糖處理的樣品含量肌原纖維含量較高,冷凍貯藏6周后分別為92.6～95.9、100.6～104.2、101.0～103.2 mg/g。與陰性對照組相比,添加海藻糖和海藻酸鈉寡糖抗凍劑處理的樣品Ca2+ATP酶活性顯著(p<0.05)高于陰性對照組,冷凍貯藏6周后海藻糖和海藻酸鈉寡糖活性分別達到0.134～0.141 μmol Pi/(mg·min)和0.135～0.142 μmol Pi/(mg·min),酶活性下降變化不明顯。海藻糖處理蝦仁肌肉肌纖維結構完整,肌肉間無較大空隙形成,較好地保持了凍藏蝦仁組織完整性。焦磷酸鈉、海藻糖和海藻酸鈉寡糖處理的樣品與海藻酸鈉處理的樣品相比,其副肌球蛋白和肌動蛋白條帶的強度具沒有明顯的降低。由此可見,海藻糖、海藻膠寡糖抗凍保水劑的開發與利用,可作為凍藏水產品復合磷酸鹽保水劑的一種較好替代品,也可為水產品無磷保水劑的開發提供參考方向。

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