海蛾魚提取物抗氧化及抗疲勞作用

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(1.漳州職業技術學院食品與生物工程系,福建漳州 363000; 2.福州大學藥物生物技術與工程學院,福建福州 350108)

海蛾魚屬于海蛾魚科動物(Pegasuslaternarius)[1]。廣泛分布于熱帶及溫帶海洋水域,我國主要產于福建及兩廣沿海。海蛾魚具有化痰止咳、壯陽補骨、宣肺透疹、燥濕止瀉、消癭散結等多種藥用功能,民間多用于治療淋巴結核、甲狀腺腫瘤、小兒氣管炎、麻疹后腹瀉、咳嗽等疾病[2],是一種極具開發潛力、食藥兩用的海洋動物,具有良好的應用前景。近年來對海蛾魚的現代藥理研究主要有抗血栓[3]、抗炎[4]、提高免疫力[4]、抗腫瘤[5]、提高應激能力[6]、保護心血管[3,7-8]、修復和改善記憶損傷[9]及對離體神經細胞[10]的保護作用。但有關海蛾魚提取物抗疲勞、體外抗氧化等方面的研究尚未見報道。

機體代謝過程中產生的活性氧(Reactive oygen species,ROS)和自由基,會使細胞和機體處于氧化應激狀態(Oxidative stress),這是導致許多疾病的重要因素。如果長期處于氧化壓力狀態,機體會面臨諸多慢性炎性疾病的風險,例如動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎、肥胖、高血壓、肌肉萎縮等疾病[11]?；瘜W合成抗氧化劑,如丁基羥基茴香醚(butyl hydroxy anisd,BHA)、二丁基羥基甲苯(butylated hydroxytoluene,BHT)、特丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone,TBHQ)等,雖然有較好的抗氧化性能,但大多具有相當的毒副作用,在人體中并無應用,只作為工業抗氧化防腐劑使用,由于化學合成抗氧化劑不能忽視的毒副作用,天然抗氧化劑的研究開發越來越受到人們的重視,而海洋來源天然抗氧化劑的開發也日益獲得廣泛關注,如滸苔、紫菜、棲菜提取物抗氧化作用以及魷魚蛋白肽抗氧化活性表現都比較好[12-15]。

隨著現代生活節奏不斷加快,疲勞越來越成為一種常見的癥狀,令人身心憔悴、痛苦不堪。疲勞同時也是其他許多慢性疾病的伴隨癥狀,如高血壓、糖尿病和慢性心衰等疾病。疲勞的發生會對機體產生不同程度的損傷,帶來諸多負面效應。因此,機體需采取必要的措施來預防可能會出現的疲勞癥狀,或當疲勞癥狀出現時縮短恢復時間就顯得非常重要,以最大程度降低機體損傷。機體的自我調節作用是一種常見而有效的抗疲勞措施,但通?；謴蜁r間較長。目前運用營養補充劑或滋補藥物來預防疲勞或加快疲勞恢復的研究日益受關注[16]。

本文以海蛾魚全實體為材料,分別用乙醇和水進行提取,得到乙醇提取物和水提物。通過DPPH自由基清除能力、鐵還原法(FRAP)法、β-胡蘿卜素-亞油酸體系法評價這兩種提取物的抗氧化活性,以及通過小鼠實驗進行抗疲勞作用研究。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

新鮮海蛾魚購自福建省東山島;實驗ICR小鼠雄性,體重18～22 g,購自上海斯萊克實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK HU 2012-0002;BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、β-胡蘿卜素和TPTZ(三吡啶三吖嗪)均為分析純,購自Sigma公司;糖原測定試劑盒、血乳酸測定試劑盒、葡萄糖測定試劑盒、尿素氮測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;其他試劑均為分析純。

47600型小鼠疲勞轉棒儀意大利UGO Basile公司;UV-1800紫外可見分光光度計日本島津公司;SHB-Ⅲ循環水式真空泵鄭州長城科工貿公司;YRE-202A真空旋轉蒸發器日本EYELA公司;THZ-103B 恒溫培養搖床上海一恒科學儀器有限公司;Scientz-12N立式冷凍干燥寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1海蛾提取物的制備新鮮海蛾魚洗凈,冷凍干燥后,粉碎至約50目。用95%乙醇按料液比1∶20 g/mL于35 ℃搖床200 r/min提取3次,每次2 h,過濾收集提取液,合并濾液,減壓濃縮至膏狀,轉移至培養皿中,35 ℃減壓真空干燥過夜,即得海蛾乙醇提取物,-20 ℃冷凍保存;經乙醇提取后的海蛾魚濾渣,用水按同樣的方法制備,即得海蛾水提取物,-20 ℃冷凍保存。

1.2.2抗氧化實驗

在70-80年代，十隊的公購糧一直保持不變。其中公糧為7415斤，這是生產隊必須無償上交的。購糧為14431斤[注]華楊大隊：《廣西壯族自治區農村人民公社一九七五年收益分配統計表》，高縣檔案館藏，71/1/75/53。 ，價格為9.5元100斤。公購糧共需21846斤。1975年糧食總產為129727斤，由于豐收，多交了2000斤雙超糧。據老農們介紹，上交的公購糧數額是按照土改時各隊分得田畝的等級來計算。在上表中，公購糧每年占總糧的比分別是：24.0%，18.3%，22.0%，平均占兩成左右。這對于一個山區生產隊而言無疑是巨大的數額。

1.2.2.1DPPH自由基清除實驗采用Souza等[17]的方法,略有改動,簡述如下:2 mL DPPH自由基甲醇或水溶液(1 mmol/L)與5 mL提取物溶液(含量變化范圍:0.125～8 mg/mL)混合,振蕩搖勻,室溫避光放置30 min。用2 mL蒸餾水代替樣品作為陰性對照,相同方法處理;以BHT為陽性對照,于517 nm波長測定吸光值。結果用相對于陰性對照的DPPH自由基清除率(%)來表示,計算公式如下:

式中,A0表示樣品與溶劑混合液的吸光度;Ai表示DPPH自由基與樣品反應后的吸光度;Aj表示DPPH自由基與溶劑混合后的吸光度。實驗重復三次求平均值。

1.2.2.2β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化實驗采用Shon等[18]的方法,略做修改簡述如下:將1 mgβ-胡蘿卜素溶解于5 mL氯仿中,隨后加入100 μL亞油酸和1 mL Tween 80,混合物室溫振蕩混合10 min。隨后,40 ℃減壓旋蒸去除氯仿,再加入100 mL氧飽和蒸餾水,劇烈搖晃1 min,形成乳化物(β-胡蘿卜素-亞油酸乳化物)。96孔微孔板,每孔加入50 μL樣品溶液和200 μL以上乳化液,搖床80 r/min混勻1 min,50 ℃孵育反應。在酶標儀上于470 nm波長處測定，初始反應的吸光值以及反應120 min后的吸光值，分別記為A0和A120,ΔA=A0-A120,ΔA越大表明β-胡蘿卜素氧化程度越高,褪色越多。計算樣品對體系β-胡蘿卜素褪色的抑制率,公式如下:

式中,ΔA0表示不加樣品抑制時的褪色情況;ΔAi表示加了某種樣品產生抑制作用時的褪色情況。

1.2.2.3鐵還原抗氧化能力實驗(FRAP)采用Benzie和Strain的方法[19],簡述如下:首先配制FRAP工作液,取2.5 mL 10 mmol/L的三吡啶三吖嗪(TPTZ,用40 mmol/L HCl配制)、2.5 mL 20 mmol/L的FeCl3和25 mL 0.3 mol/L的醋酸緩沖液(pH3.6)混合均勻,即得FRAP工作液。

測定方法:取0.3 mL濃度為1.0 mg/mL的不同樣品,加入2.7 mL預熱至37 ℃的FRAP工作液,搖勻后放置10 min,于593 nm處測定吸光值,用空白溶劑作參比對照測定。根據反應后的吸光值,從FeSO4標準曲線上求得對應FeSO4濃度值(μmol/L),根據受試樣品所配制的濃度,換算成對應的當量“μmol(FeSO4)/g(樣品)”值,簡寫為“μmol/g”,定義為FRAP值。此值越大,表明抗氧化能力越強。

繪制FeSO4標準曲線:準確稱量6.08 mg FeSO4溶于適量水中,加入18 mol/L濃硫酸0.25 mL,再加水定容至50 mL,并放入一小鐵釘,作為貯液(濃度800 μmol/L),將此貯液稀釋成25、50、100、200、400、800 μmol/L系列標準液濃度,各取0.3 mL按以上FRAP方法處理,測定吸光值,繪制標準曲線。所得標準曲線為y=0.0012x+0.00958(R2=0.9999),其中y為所測得的吸光度,x為標準液濃度(μmol/L)。

1.2.3小鼠抗疲勞實驗

1.2.3.1給藥方案先進行樣品毒性預實驗,結果表明小鼠單次經口給予5000 mg/kg,未見明顯毒性反應。乙醇提取物用0.1% CMC(羧甲基纖維素鈉)分散;水提物用水溶解。小鼠隨機分組,每組10只,灌胃給藥(1次/d),持續一周后,進行抗疲勞實驗。組別設置如下所示:

陰性對照組:灌胃生理鹽水,每日一次;海蛾醇提物組:設置兩個濃度組100、400 mg/kg,每日灌胃一次;海蛾水提物組:設置兩個濃度組100、400 mg/kg,每日灌胃一次。

1.2.3.2小鼠轉棒實驗小鼠篩選:分組之前,動物放置于轉棒上,將轉速設定為15 r/min,選取協調能力較好、停留時間超過20 s的動物。訓練:分組之后,持續灌胃給藥一周,第4 d開始進行訓練,每次訓練10 min,每天一次,共3 d。測試:最后一次灌胃給藥后1 h,進行正式測試。將轉速調為15 r/min,觀察和記錄動物在轉棒上的停留時間,如果時間延長,表明具有抗疲勞作用。

1.2.3.3小鼠負重強迫游泳實驗此實驗分組及給藥同1.2.3.1,將小鼠放于深28 cm、溫度25 ℃的游泳池中,每只小鼠尾部負重為10%體重,記錄動物自游泳開始至力竭下沉10 s 內不再露水面的持續時間。如果游泳持續時間延長,表明具有抗疲勞作用。

1.2.3.4抗疲勞血清生化指標測定1.2.3.3負重游泳的小鼠在強迫游泳后,眼眶取血,于4 ℃ 2500 r/min離心10 min,取上清液血清,-80 ℃保存以備測定;另解剖小鼠,取肝臟及大腿肌肉,-80 ℃保存以備糖原測定。尿素氮、乳酸、血糖及糖原含量測定均按照試劑盒說明書操作。

1.3　數據處理

采用Origin軟件單因素方差分析,p<0.05表明差異有顯著性,p<0.01表明差異極為顯著。結果用X±S表示。

2　結果與討論

2.1　海蛾提取物體外抗氧化實驗

2.1.1DPPH自由基清除能力DPPH自由基作為一種較穩定的自由基供體,廣泛用于天然抗氧化劑自由基清除能力的評估?；衔飳PPH自由基的清除能力主要取決于其對未成對電子的配對能力。自由基清除實驗結果如圖1所示。幾種受試物相比較,陽性對照品BHT具有最強的DPPH自由基清除能力,在2、4、8 mg/mL濃度時清除率均超過92%,在最低濃度0.125 mg/mL時清除率也超過32%,其IC50約為0.39 mg/mL;其次是海蛾魚醇提物,其DPPH自由基清除能力呈現明顯的濃度依賴性,8 mg/mL濃度時清除率為89.3%,0.125 mg/mL時為6.69%,其IC50約為1.22 mg/mL;清除能力最差的為海蛾魚水提物組,最高濃度時僅為33.04%。由此可見,海蛾魚醇提物具有一定的DPPH自由基清除能力,但弱于陽性對照品BHT,而海蛾魚水提物則明顯低于醇提物。

圖1　海蛾提取物對DPPH自由基的清除率Fig.1　Effects of Pegasus laternarius extracts on the percentage of DPPH· clearance

2.1.2β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化能力由于體系中亞油酸氧化產生過氧化氫自由基,使得β-胡蘿卜素漂白褪色,如果體系中同時存在抗氧化劑,則會對抗過氧化氫自由基,對該漂白褪色產生抑制作用。β-胡蘿卜素漂白實驗結果如圖2所示。與DPPH自由基清除實驗結果相類似,BHT同樣具有最強的抑制β-胡蘿卜素褪色能力,其在濃度1、2、4、8 mg/mL時抑制率均超過90%,IC50為0.17 mg/mL;海蛾魚醇提物抑制褪色能力其次,最高8 mg/mL時為82.9%,最低為23.3%,IC50為1.18 mg/mL;而海蛾魚水提物抑制能力最低,最高僅為36.24%。由此可見,海蛾魚醇提物具有一定的抑制β-胡蘿卜素褪色方面抗氧化能力,但弱于陽性對照品BHT。

圖2　海蛾提取物β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化分析Fig.2　Effects of Pegasus laternarius extracts on β-carotene-lineate bleaching assaying

2.1.3鐵還原抗氧化能力(FRAP)FRAP分析反映了抗氧化劑通過電子轉移將氧化態的Fe3+還原為Fe2+復合物的能力,也間接反映了還原機體活性氧的能力。FRAP實驗結果如圖3所示。BHT具有最強的鐵還原抗氧化活性,其FRAP值為2039.48 μmol/g;海蛾魚醇提物其次,FRAP值為383.35 μmol/g;海蛾魚水提物最低為109.93 μmol/g。

表3　樣品對肝糖原、肌糖原、血糖、尿素氮及血乳酸含量的影響(n=10)Table 3　Effect of samples on hepatic glycogen,muscle glycogen,blood glucose,BUN,blood lactate contents(n=10)

圖3　海蛾提取物FRAP值比較Fig.3　Effects of Pegasus laternarius extracts on FRAP

對于幾種體外抗氧化分析方法,海蛾魚醇提取物都顯示了一定的抗氧化作用,優于水提物,而弱于人工合成抗氧化劑BHT。結果表明,海蛾魚醇提物可望作為營養補充劑來緩解機體的氧化應激狀,減少機體面臨某些慢性疾病的風險。但還需進行深入的機理研究。

2.2　小鼠抗疲勞實驗

2.2.1轉棒實驗結果如表1所示。與對照組相比,水提物組對小鼠轉棒的停留時間提高較為明顯,100 mg/kg劑量時,可使停留時間顯著(p<0.05)延長到(40.93±7.12) s,而400 mg/kg劑量時可進一步延長至(61.81±8.57) s,差異極顯著(p<0.01),具有劑量依賴性;但是醇提物100 mg/kg和400 mg/kg劑量與對照組相比并無統計學差異。由此可見,海蛾魚水提物具有一定的抗疲勞作用;而海蛾魚醇提物無明顯抗疲勞作用。

表1　不同樣品對小鼠轉棒停留時間的影響(n=10)Table 1　The influence of different sample on the rotating rod lasting time(n=10)

注：與對照組相比較,*p<0.05,**p<0.01;表2、表3同。

表2　樣品對小鼠負重游泳的影響(n=10)Table 2　The influence of different sample on weight-loaded swimming time(n=10)

2.2.2負重強迫游泳實驗結果如表2所示。與對照組相比較,海蛾魚醇提物在100、400 mg/kg劑量下均未有顯著差異;水提物雖在100 mg/kg劑量下也未見顯著差異,但在400 mg/kg可將游泳持續時間延長至(185.30±35.25) s,差異顯著(p<0.05)?？梢?與轉棒實驗結果相類似,海蛾魚水提物展現出一定的抗疲勞功效,而醇提物在100～400 mg/kg范圍內未見抗疲勞作用。

2.2.3海蛾魚提取物對肝糖原、肌糖原、血糖、尿素氮及血乳酸含量的影響糖原是ATP供能的主要來源,是機體重要供能源。肌糖原是最直接的供能源,而肝糖原則是重要的儲能物質。當機體運動時,并不馬上分解肝糖原,而是當肌糖原消耗殆盡血糖不夠時,才動員分解肝糖原來提供能量。故肌/肝糖原含量是衡量機體運動耐力的重要指標。由表3可知,海蛾魚水提物對肝糖原提升效果顯著,100 mg/kg劑量時,肝糖原含量為(14.63±4.11) mg/g,比對照組顯著提高(p<0.05),400 mg/kg劑量時,肝糖原含量為(17.84±4.52) mg/g,極顯著提高(p<0.01),呈一定劑量依賴;而對于肌糖原含量,雖有一定的提升作用,但沒有顯著差異。海蛾魚醇提物對肝糖原和肌糖原都無明顯的提升作用。水提物還具有穩定血糖作用,在400 mg/kg劑量時可使運動后的小鼠血糖提升至(9.24±1.17) mmol/L,與本實驗測定的正常值約為9～9.5 mmol/L相當,顯著(p<0.05)高于對照組血糖值(7.53±1.37) mmol/L,100 mg/kg時雖有提升,但并無顯著性。海蛾醇提物同樣不具備穩定血糖功能,不具有顯著性。

當機體運動達到一定程度時,蛋白質會分解代謝參與供能,使得血液中尿素氮(BUN)含量升高,血尿素氮是衡量機體運動耐受力的重要指標[20]。機體劇烈運動時,由于糖酵解作用產生乳酸,乳酸的累積會使機體產生疲勞感。乳酸產生速度與清除速度是否匹配決定著機體運動時的疲勞程度,故血乳酸也是衡量機體運動耐受力的重要指標[21]。由表3可知,相對于對照組,海蛾魚水提物顯著降低BUN水平,400 mg/kg時可使BUN降至(7.92±0.57) mmol/L,差異顯著(p<0.05),而100 mg/kg時無顯著性差異;海蛾魚水提物也可顯著(p<0.05)降低血乳酸水平,100 mg/kg時為(4.42±0.78) mmol/L,差異顯著(p<0.05),400 mg/kg時為(3.76±0.41) mmol/L,差異極顯著(p<0.01);同樣,海蛾魚醇提物對BUN和血乳酸的影響不具有顯著性。

本研究分別采用海蛾魚實體乙醇提取物和水提物進行抗疲勞研究,這兩種提取物存在一定的極性差異。根據相似相溶原理,極性分子組成的溶質易溶于極性分子組成的溶劑。水提物成分極性較強,其中應含有較多的糖類、蛋白質、肽、氨基酸等物質。近年來,天然來源的這幾類物質抗疲勞方面的研究報道較多[22-25]。BUN含量降低,表明有可能是抑制了蛋白質的分解代謝;血乳酸含量降低,表明可能促進乳酸代謝分解;運動后的血糖提升至正常水平,說明有可能促進糖類代謝,釋放葡萄糖進入血糖,而穩定血糖值。根據本實驗結果可推測其抗疲勞機制可能為,海蛾魚水提物可抑制機體運動時蛋白質的分解代謝,促進乳酸代謝,促進糖類物質分解,穩定血糖。

3　結論

海蛾魚醇提物對DPPH自由基清除IC50為1.22 mg/mL;β-胡蘿卜素-亞油酸體系抗氧化實驗中,醇提物IC50為1.18 mg/mL;鐵還原抗氧化能力實驗中,醇提物FRAP值為383.35 μmol/g,而水提物為109.93 μmol/g。海蛾魚醇提物具有一定的抗氧化活性,水提物不具有明顯的抗氧化活性。海蛾魚水提物可顯著提高小鼠轉棒滯留時間,具有劑量依賴性100 mg/kg為(40.93±6.76) s(p<0.05),400 mg/kg為(61.81±8.57) s(p<0.01);水提物在400 mg/kg劑量(p<0.05)時可顯著延長游泳時間;同時,海蛾魚水提物還可提高肝糖原含量至(17.84±4.52) mg/g(p<0.01),穩定血糖(9.24±1.17) mmol/L(p<0.05),降低BUN含量至(7.92±0.57) mmol/L(p<0.05),降低血乳酸含量至(3.76±0.41) mmol/L(p<0.01)。而海蛾魚醇提物不具有明顯的抗疲勞作用。海蛾魚提取物具有一定的抗疲勞和抗氧化活性;兩種提取物可互補,使得海蛾魚提取物具有開發成相應功能營養補充劑的潛力。

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