香圓枳殼柚皮苷的提取及其對亞硝酸鹽的清除作用

，　

(陜西理工大學生物科學與工程學院,陜西漢中 723000)

枳殼(FructusAurantii)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)、代代花(C.a.var.amara)、香圓(Citruswilsonii)及其枸櫞(Poncirustrifoliata)的干燥幼果與未成熟果實[1]。香圓枳殼始載于《神農本草經》,其性苦、辛、酸、溫,具有理氣寬中、行滯消脹的功效[2],主治胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內停、胃下垂、脫肛、子官脫垂等病癥,為歷版《中國藥典》所收載[3],也是國家衛生部所頒布的可用于保健食品的原料[4]?，F代研究表明,香圓枳殼的主要成分為黃酮類物質、生物堿以及揮發油類[5-6]。其中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷是香圓枳殼中的的主要黃酮類物質,黃酮類化合物具有清除自由基、抗氧化、抑菌抗炎、抗過敏等多種生物活性[7-8],因而在功能保健食品開發中應用廣泛[9]。然而關于香圓枳殼柚皮苷的研究報道很少,尤其缺乏復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷及其清除亞硝酸鹽的研究[10-13]。因此,采用復合酶法從香圓枳殼中提取柚皮苷并研究其亞硝酸鹽的清除作用,不僅可充分利用當地的香圓資源,增加香圓產業的附加值,而且可為香圓枳殼柚皮苷的工業化開發提供理論支持。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

枳殼香圓的干燥幼果,50 ℃干燥,粉碎備用,購于漢中中藥材批發市場;柚皮苷標準品中國藥品生物制品鑒定所;果膠酶(4000 U/mg)、纖維素酶(10000 U/mg)和氏璧生物技術有限公司;乙醇、甲醇、HCl、NaOH、硫酸、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺等均為分析純。

ZN-02粉粹機北京興時利和科技有限公司;TU-1221紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器公司;QCD6150數控超聲清洗器天津恒瑞機電設備有限公司;TDL-40B離心機上海安亭科學儀器廠;AL204電子天平梅特勒-托利多儀器上海有限公司;DHF-9055A電熱鼓風干燥箱上海一恒科技有限公司;RE5298旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠。

1.2　實驗方法

1.2.1復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷工藝流程

1.2.2單因素實驗精密稱取5.00 g原料,加入一定質量的果膠酶和纖維素酶(質量比1∶1)的復合酶,在一定pH,溫度45 ℃條件下超聲處理,提取液離心(3000 r/min,20 min)后取上清液,進行測定,計算柚皮苷得率。分別考察pH(超聲時間30 min,超聲功率300 W,加酶量120 μg/g條件下,pH分別為3、4、5、6、7、8);超聲時間(pH6,超聲功率300 W,加酶量120 μg/g條件下,超聲時間分別為20、25、30、35、40、45 min);超聲功率(pH6,超聲時間30 min,加酶量120 μg/g條件下,超聲功率分別為100、150、200、250、300、350 W);加酶量(pH6,超聲時間30 min,超聲功率300 W條件下,加酶量分別為80、100、120、140、160、180 μg/g)等因素對香圓枳殼柚皮苷提取效果的影響。

1.2.3響應面實驗在單因素實驗基礎上,根據Box-Benhnken的實驗設計原理,選取pH、超聲時間、超聲功率和加酶量為考察對象,以柚皮苷得率為響應值,設計四因素三水平的響應面分析。研究各因素對香圓枳殼柚皮苷提取效果的影響,實驗因素與水平設計見表1。

表1　響應面分析因素與水平Table 1　Factors and levels of response surface analysis

1.2.4柚皮苷標準曲線的制作準確稱取柚皮苷標準品10.00 mg,甲醇充分溶解并定容至100 mL,再分別準確吸取上述貯備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,由于柚皮苷在Al(NO3)3溶液中能形成黃色絡合物,在最大吸收峰波長420 nm處測吸光度,可得吸光度A與柚皮苷濃度C(μg/mL)的標準曲線方程:Y=0.013X+0.0657,R2=0.9983,X為標準品的濃度,Y為吸光度。

1.2.5柚皮苷得率的測定精密稱取5.00 g原料,按照方法“1.2.1”進行香圓枳殼柚皮苷的提取,制的柚皮苷的提取液并定容,按照方法“1.2.4”于420 nm處測其吸光度,根據柚皮苷標準曲線計算柚皮苷濃度,并按下式計算香圓枳殼柚皮苷的得率:

得率(%)=(C×N×V/W×100)×100

式中,C為樣液中柚皮苷濃度,μg/mL;N為提取液的稀釋倍數,50;V為粗提液體積,mL;W為香圓枳殼粉質量,g[17-19]。

1.2.6柚皮苷對亞硝酸鹽的清除作用參照劉鋼等[20]方法進行修改。比色管中分別加入2 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉標準溶液、一定量的香圓枳殼柚皮苷提取液,混合均勻,之后加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液混勻,靜置5 min,加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液,混勻后靜置15 min,加蒸餾水定容至50 mL,測定538 nm波長處吸光度(A樣品),同時以蒸餾水代替亞硝酸標準溶液作為空白對照實驗測定吸光度(A樣空),以蒸餾水代替香圓枳殼柚皮苷提取液的空白對照測定吸光度(A對照)。以茶多酚為陽性對照。亞硝酸鹽清除率按下式計算:

1.3　數據處理

實驗數據均為三次實驗數據的平均值,利用Design Expert V 8.0.6進行響應面實驗數據分析,建立數學模型。

2　結果與分析

2.1　復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷工藝優化

2.1.1不同pH對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響由圖1可以看出,在實驗范圍內,香圓枳殼柚皮苷得率隨著pH增大先升高,到達最高點后呈緩慢下降趨勢,在pH為6時,香圓枳殼柚皮苷提取效果較好,這是因為此時酸堿性環境最適合復合酶作用于原料,如果pH繼續上升,則酶的空間結構就會受到影響,導致其活性下降[21]。

圖1　不同pH對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.1　Effect of different pH on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.2不同超聲時間對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響由圖2可以看出,隨著超聲處理時間的增加,香圓枳殼柚皮苷得率會逐漸提高。在超聲時間為35 min時,枳殼柚皮苷得率達到最高水平,如果大于35 min時,枳殼柚皮苷得率會開始下降,這可能是因為在較長超聲波時間作用下,枳殼柚皮苷會分解[18]。因此,超聲波時間為35 min時,枳殼柚皮苷提取效果較好。

圖2　不同超聲波時間對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.2　Effect of different ultrasonic time on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.3不同超聲功率對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響由圖3可以看出,當超聲波功率上升后,枳殼柚皮苷得率也會相應提高,當超聲波功率達到250 W時,枳殼柚皮苷得率上升到峰值,隨著超聲波功率繼續上升,枳殼柚皮苷得率會大幅減少。這是因為超聲波功率上升后,復合酶活性相應下降,枳殼柚皮苷得率相應下降[22-23]。因此,超聲波功率為250 W時,枳殼柚皮苷提取效果較好。

圖3　不同超聲波功率對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.3　Effect of different ultrasonic power on naringin extraction from Fructus Aurantii

圖4　不同加酶量對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響 Fig.4　Effect of different enzyme dosage on naringin extraction from Fructus Aurantii

2.1.4不同加酶量的提取效果由圖4可以看出,隨著加酶量增長枳殼柚皮苷得率相應增大,當加酶量達到120 μg/g后,加酶量繼續增大,枳殼柚皮苷得率反而有所下降,這主要是因為加酶量已經達到了飽和狀態;如果加酶量繼續增大,枳殼柚皮苷得率波動范圍較小[24]。因此加酶量為120 μg/g時,枳殼柚皮苷提取效果較好。

2.1.5復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷工藝優化實驗分析復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的條件可知,pH、超聲波時間、超聲波功率、加酶量這4個因素都是顯著因素。得率的二次回歸擬合方程如下:

得率(%)=3.20-0.32A-0.19B-0.42C+0.28D+0.14AB+0.22AC-0.38AD+0.14BC-0.36BD-0.17CD-0.64A2-0.44B2-0.56C2-0.23D2?；貧w方程中二次項的系數均為負數,說明回歸方程存在穩定點,即極大值點。

表2　復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷響應面試驗結果Table 2　Response surface experiment results of composite enzyme assisted extraction of naringin from Citrus wilsonii Fructus Aurantii

表3　回歸方程各項的方差Table 3　Variance of regression equation

注：* 差異顯著,p<0.05,**差異極顯著,p<0.01。

圖5　pH和超聲波時間相互作用對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.5　Effect of pH and ultrasonic time on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖7　pH和加酶量相互作用對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.7　Effect of pH and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖8　超聲波時間和超聲波功率相互作用對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.8　Effect of ultrasonic time and ultrasonic power on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖9　超聲波時間和加酶量相互作用對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.9　Effect of ultrasonic time and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

圖10　超聲波功率和加酶量相互作用對香圓枳殼柚皮苷提取效果影響Fig.10　Effect of ultrasonic power and enzyme dosage on extraction of naringin from Fructus Aurantii

響應曲面傾斜度大小表示相關因素的交互影響大小，圖5～圖10表示A、B、C、D四個因素之間的交互作用對香圓枳殼柚皮苷得率的影響。由圖5～圖10及p值分析可以看出，pH和超聲波時間、pH和超聲波功率、pH和加酶量、超聲波時間和超聲波功率、超聲波時間和加酶量、超聲波功率和加酶量對香圓枳殼柚皮苷得率的兩兩交互作用明顯，與方差分析結果一致。得到復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的最佳條件為pH5.32，超聲波時間32.27 min，超聲波功率230.16 W，加酶量134.31 μg/g，在此工藝條件下，軟件程序對香圓枳殼柚皮苷得率的預測值為3.81%。

2.1.6驗證實驗對模型進行驗證，考慮實驗的可操作性，將復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的最佳提取條件調整為：pH5.3，超聲波時間32 min，超聲波功率230 W，復合酶添加量134 μg/g，在此工藝條件下，進行5次平行驗證試驗，結果表明，香圓枳殼柚皮苷的得率為3.75%，RSD為1.16%(n=5)，表明響應面建立的復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷數學模型對香圓枳殼柚皮苷提取穩定可靠，能指導實際生產應用。

圖11　香圓枳殼柚皮苷對亞硝酸鹽清除率影響Fig.11　Effect of naringin from Fructus Aurantii on clearance to nitrite

2.2　香圓枳殼柚皮苷對亞硝酸鹽的清除作用

由圖11可知,隨著香圓枳殼柚皮苷和茶多酚濃度增大,香圓枳殼柚皮苷和茶多酚對亞硝酸鹽清除能力均逐漸增強,當香圓枳殼柚皮苷濃度小于或等于1 mg/mL時,其清除亞硝酸鹽的能力小于茶多酚,當香圓枳殼柚皮苷濃度大于1 mg/mL時,其清除亞硝酸鹽的能力增強得較快,對亞硝酸鹽的清除率大于茶多酚,當香圓枳殼柚皮苷濃度達到3 mg/mL,其對亞硝酸鹽的清除率可達到91.1%。

3　結論

為充分利用香圓枳殼資源,本實驗以香圓枳殼為原料,采用果膠酶和纖維素酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷,對其最佳提取工藝進行探討,響應面優化香圓枳殼柚皮苷提取實驗模型和實際情況擬合度比較好,復合酶輔助提取香圓枳殼柚皮苷的最佳工藝條件為pH5.3,超聲時間32 min,超聲功率230 W,加酶量134 μg/g。在此工藝條件下,香圓枳殼柚皮苷實際得率為3.75%。

香圓枳殼柚皮苷對亞硝酸鹽的清除實驗表明:隨著濃度增大,香圓枳殼柚皮苷對亞硝酸鹽清除能力逐漸增強,當香圓枳殼柚皮苷濃度達到3 mg/mL,其對亞硝酸鹽的清除率可達到91.1%。本實驗結果可為香圓枳殼的綜合開發利用提供新的思路,為開發亞硝酸鹽天然清除劑提供理論支持。

[1]楊華,鄧義德,胡高云. 高效液相色譜法同時測定不同產地香圓枳殼藥材中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、異柚皮苷的含量[J].中國藥業,2012,21(22):33-35.

[2]羅容,楊志剛,張貴君. 高效液相色譜法對枳實提取物中黃酮類藥效組分的定量分析[J]. 遼寧中醫藥大學學報,2012,14(10):98-100.

[3]施學驕,張杰紅,樊丹青. 枳實、香圓枳殼揮發油化學成分及抑菌活性的比較研究[J]. 中藥與臨床,2012,3(2):25-29.

[4]謝仁峰,文雙娥,李洋. 柚皮苷抗炎鎮痛作用的實驗研究[J]. 湖南師范大學學報：醫學版,2011,8(4):5-8.

[5]施學驕,劉友平. 不同產地枳實、香圓枳殼中檸檬苦素含量比較研究[J]. 中國食品添加劑,2011(5):126-129.

[6]王雯,李俊,李榮. 橙皮苷對非酒精性脂肪肝大鼠COX-2表達及活性的影響[J]. 安徽醫科大學學報,2011,46(9):897-901.

[7]Zongtao Lin,Hong Wang,Ying Xu. Identification of antioxidants in Fructus aurantii and its quality evaluation using a new on-line combination of analytical techniques[J]. Food Chemistry,2012,134(2):31-39.

[8]Jinhee Kim,Guddadarangavvanahally K Jayaprakasha,Mariappan Muthuchamy,et al. Structure-function relationships of citrus limonoids on p38 MAP kinase activity in human aortic smooth muscle cells[J]. European Journal of Pharmacology,2011,670(1):56-62.

[9]彭磊,張茜,李榮. 橙皮苷衍生物抗炎活性的篩選研究[J].安徽醫科大學學報,2011,46(1):36-39.

[10]李佩艷,韓四海,羅登林,等. 牡丹葉黃酮的酶法提取條件優化及其對亞硝酸鹽的清除作用[J]. 食品科學,2016,37(6):77-81.

[11]滕濤,李娟,陸靜,等. 提取條件對橘皮醇提物在模擬胃液中清除亞硝酸鹽能力的影響[J]. 食品科技,2016,41(2):

255-259.

[12]王瑩. 有機茶山海棠葉主要活性成分測定及模擬胃酸條件下清除亞硝酸鹽的效果[J]. 食品科學,2011,32(17):105-108.

[13]賈長虹,常麗新,李月,等. 月季葉黃酮對自由基和亞硝酸鹽的清除作用研究[J]. 食品工業科技,2010,31(9):104-106.

[14]曹淵,徐彥芹,夏之寧. 超聲復合酶法提取天冬多糖[J]. 中藥材,2009,32(4):622-625.

[15]趙玉,徐雅琴,崔崇士. 超聲波協同復合酶法提取南瓜多糖最佳條件的研究[J]. 農產品加工(學刊),2009(7):13-15.

[16]于宏偉,谷維娜,李娜. 柚皮苷的提取方法及其應用研究進展[J]. 湖北農業科學,2011,50(8):1516-1518.

[17]劉偉,單楊,李高陽. 柑桔類果實中柚皮苷含量的測定[J]. 食品與機械,2008(6):102-106.

[18]劉英,但俊峰,吳丹. 柚皮中柚皮苷的超聲波輔助提取條件研究[J]. 西北農林科技大學學報：自然科學版,2008(4):218-222.

[19]許有瑞,聶瓊嶸,顧生玖. 沙田柚幼果中柚皮苷提取工藝研究[J]. 安徽農業科學,2008(18):7525-7525.

[20]劉鋼,賈冬英,趙甲元. 石榴皮多酚提取物對亞硝酸鹽的體外清除作用研究[J]. 中國調味品,2011,36(7):41-44.

[21]徐玉霞,王華斌. 酶法提取海紅果總黃酮工藝及海紅果黃酮粗提物對HeLa細胞的增殖作用[J]. 中國農業大學學報,2013,18(1):119-127.

[22]黃秀香,賴紅芳,羅麗程. 超聲波協同復合酶法提取半邊蓮多糖工藝優選[J]. 中國實驗方劑學雜志,2012,18(5):44-46.

[23]趙玉紅,趙小旭,姜曉青. 超聲波-雙酶法協同提取林蛙皮多糖的工藝優化[J]. 食品工業科技,2012,33(11):230-234.

[24]謝麗源,王富偉,李洪軍. 超聲波復合酶法提取桑黃多糖研究[J]. 食品科學,2010,31(10):81-85.