不同食用油對番茄紅素抗氧化活性的影響

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(中國農業大學食品科學與營養工程學院,國家果蔬加工工程技術研究中心,北京 100083)

番茄紅素(lycopene)是類胡蘿卜素的一種,在番茄、胡蘿卜、木瓜和西瓜等果蔬中大量存在?？扇苡诒?、正己烷、氯仿等有機溶劑,不溶于水,對光、熱、氧敏感[1-3]。作為成熟番茄中一種最主要的色素,由于沒有β-紫羅酮環結構,在過去只是被當作一種沒有生物活性的植物色素[4-5],很長時間都沒有得到重用。

活性氧被認為是引起癌癥、心腦血管疾病以及其他慢性病的重要因素[6-7]。在生物體中,活性氧的水平由一個復雜的氧化防御系統網調控,這個防御系統可以使生物分子受到的氧化損傷最小化[8]。人體正常狀態下活性氧的產生和清除處于一個平衡狀態,但當機體出現病變時,防御系統會瓦解,活性氧引起的氧化脅迫會導致人體內糖類、脂質、DNA和蛋白質等大分子的損傷,破壞其正常功能,并引起一系列如癌癥、衰老以及心血管等疾病的發生[9-11]。

近年來,越來越多的實驗和研究表明,番茄紅素作為存在于人體血清和其他組織中主要的類胡蘿卜素,其抗氧化活性要優于其他類胡蘿卜素色素,猝滅單線態氧速率常數是維生素E的100倍,是β-胡蘿卜素的2倍多[12-16]。因為能夠保護細胞內脂質、蛋白質和DNA免受自由基氧化損傷[17],番茄紅素已經被很多國家開發成為保健食品,我國市場上也有多種品牌的番茄紅素軟膠囊。各種番茄紅素軟膠囊的主要成分都是番茄紅素和其載體介質食用油,而使用的食用油品種并不統一,包括大豆油、玉米油、小麥胚芽油、菜籽油和亞麻籽油等,其中大豆油使用最多,幾乎占據了80%的市場。關于番茄紅素的研究日益增多,主要集中在番茄紅素的提取和保健功能方面,包括抗氧化、保護神經系等,尚未有針對不同食用油對番茄紅素保健功能影響方面的實驗。研究不同食用油對番茄紅素保健功能的影響,可以更好的指導生產和消費,因此本文研究了不同食用油對番茄紅素抗氧化活性的影響。

本文將番茄紅素分別加載于亞麻籽油、大豆油、葵花籽油、玉米油、花生油介質中,測定該類復合物對羥基自由基、DPPH、ABTS和超氧陰離子自由基的清除作用及在β-胡蘿卜素亞油酸自氧化體系中的抗氧化能力,從而研究這幾種油對番茄紅素抗氧化活性的影響。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

番茄紅素油樹脂5.33%(其他成分為提取油脂-紅花油),晨光生物科技集團股份有限公司;亞麻籽油、花生油、大豆油、葵花籽油、玉米油均購于北京物美超市;丙酮(99.5%)、氯化銅(99.0%);碳酸氫鈉(99.5%)、過硫酸鉀(99.5%)、甲醇(99.5%)、吐溫-20(97%、99.5%)國藥集團化學試劑有限公司;鄰菲羅啉(99%)、DPPH(99%)、ABTS(98%)、鄰苯三酚(99%)、β-胡蘿卜素(99%)上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氯仿(99%)、亞油酸(60.0%～74.0%)、雙氧水(H2O2,30%)、碳酸鈉(99.8%)、無水乙醇(99.7%)、鹽酸(36.0%～38.0%)北京化學試劑有限公司;Tris-HCl緩沖液(99.9%)索萊寶生物科技有限公司。

IKA C-MAGHS7型磁力攪拌器梅特勒-托利多公司;T6型紫外可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;RE-52A真空旋轉蒸發器上海亞榮生化儀器廠;KQ-500DE型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1復合物的制備配制番茄紅素為4.3%的復合物,分別稱取不同種類的食用油(玉米油、葵花籽油、花生油、大豆油、亞麻籽油)9.48 g于50 mL離心管中,再加入番茄紅素油樹脂37.52 g,漩渦振蕩至混合均勻。用錫箔紙包裹后,置于-4 ℃冰箱中備用。

1.2.2羥自由基清除能力的測定參照涂寶軍等[18]的測定方法并稍加修改。取番茄紅素與食用油的復合物0.25 g,用丙酮溶解,配制成100 μg/mL的溶液,再用丙酮稀釋配成5、10、20、30、40、50 μg/mL的待測液。

反應液的配制:向10 mL容量瓶中依次注入1.5 mmol/L鄰菲羅啉和2.0 mmol/L的氯化銅各0.5 mL、雙氧水(30%)666.7 μL、0.05 mmol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液8 mL,待測樣品0.5 mL,并快速混合均勻,以同體積的丙酮作為空白對照。反應液靜置5 min后,在502 nm處用分光光度計測定上述樣品的吸光度并記錄,每個樣品平行測定3次,取峰值的平均值進行定量,計算清除率。

式(1)

式中:A0-空白對照品在502 nm處的吸光度;A樣-樣品反應后在502 nm處的吸光度;A本底-樣品在502 nm下的吸光度。

1.2.3DPPH自由基清除能力的測定參照涂寶軍等[18]的測定方法并稍加修改。取番茄紅素與食用油的復合物0.25 g,用丙酮溶劑進行溶解,配制成100 μg/mL的溶液,再通過稀釋配成5、10、20、30、40、50 μg/mL的待測液。

DPPH溶液的配制:稱取6.5 mg的DPPH,用無水乙醇配制成65 μmol/L的溶液。

反應液的配制:向10 mL容量瓶中加入8 mL,65 μmol/L的DPPH無水乙醇溶液,2 mL的待測樣品,快速混合均勻,用丙酮作為空白對照。靜置5 min后,在514 nm處用分光光度計測定吸光度并記錄,每個樣品平行測定3次,取峰值的平均值進行定量,計算清除率。

式(2)

式中:A0-空白對照品在514 nm處的吸光度;A樣-樣品反應在502 nm處的吸光度;A本底-樣品在514 nm下的吸光度。

1.2.4ABTS自由基清除能力的測定參照鄧麗君等[19]的測定方法并稍加修改。

ABTS應用液的配制:稱取0.0192 g的ABTS和0.0033 g的過硫酸鉀溶解于10 mL蒸餾水中,配制成3.5 mmol的ABTS溶液,于室溫、避光處放置16～24 h,得到ABTS溶液,用甲醇稀釋至734 nm處的吸光值為0.683的應用液。

在反應容器中,依次加入待測樣品0.2 mL,ABTS自由基應用液1.3 mL,振蕩搖勻,于室溫下避光靜置6 min后,測定溶液在734 nm處的吸光度A1。為排除樣品試劑本身顏色的影響將ABTS自由基應用液換成甲醇溶液,以95%的甲醇溶液為對照,于室溫下測定溶液在734 nm處的吸光度A2。以甲醇溶液代替待測樣品,同樣以95%的甲醇溶液為對照,測定溶液在734 nm處的吸光度A0。

每組測定3次,求取平均值,按下述公式計算樣品的清除率。并繪制清除率與樣品吸光度曲線。

式(3)

式中:A0-含ABTS應用液不含待測樣品的反應體系的吸光值;A1-樣品反應后的吸光值;A2-含待測樣品不含ABTS應用液反應體系的吸光值[20]。

1.2.5超氧陰離子自由基清除能力的測定參照劉國安等[8]的測定方法并加以修改。

取0.5 mL不同濃度樣品,加入4.43 mL pH=8.0的Tris-HCl(50 mmol/L)緩沖液后,加入70 μL鄰苯三酚溶液(10 mmol/L),立刻計時并迅速搖勻,在反應啟動后每隔30 s檢測相應325 nm處的吸光值,至4.5 min為止。對照管用鹽酸代替鄰苯三酚溶液。

式(4)

式中:A0-未加樣品的吸光值;A1-加入樣品的吸光值;A2-未加鄰苯三酚的吸光值。

1.2.6β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系參照Gachkar等[21]的測定方法并加以修改。

β-胡蘿卜素氯仿溶液配制:準確稱取15 mgβ-胡蘿卜素,用氯仿定容至10 mL容量瓶中,配制為濃度為1.5 mg/mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液。

乳化液的配制:稱取40 mg亞油酸和400 mg吐溫-20,放入圓底燒瓶中,再加入0.4 mL的β-胡蘿卜素氯仿溶液,在40 ℃下真空旋轉蒸發5 min,然后向殘余物中加入100 mL蒸餾水不斷攪拌,在40 kHz超聲波中超聲10 min。

其中空白乳化溶液的配制除不添加β-胡蘿卜素外,步驟同上。

檢測:準確量取5 mL的乳化液,加入0.2 mL的不同待測樣品后,馬上于470 nm下測定吸光度值(t=0 min)。然后在60 ℃下水浴120 min,每30 min測定一次吸光度值。

抗氧化能力用 IC50值及動力學反應速率綜合來衡量。其中,根據公式(5)計算各樣品的抗氧化活性值,通過非線性擬合計算得到各物質的 IC50值;依照公式(6)計算反應動力學曲線的響應值(β-胡蘿卜素殘留率)。

式(5)

式中:DRc=ln(ac/bc)/120,表示對照溶液的降解速率;DRs=ln(as/bs)/120表示樣品溶液的降解速率;ac為0 min時的對照溶液吸光度值;bc為120 min時的對照溶液吸光度值;as為0 min時的樣品溶液吸光度值;bs為120 min時的樣品溶液吸光度值。

式(6)

式中:As(t=x)和As(t=0)分別代表樣品在t=x min及t=0 min時的吸光度值。

1.2.7數據處理采用Origin 8.5軟件作圖,SPSS 20軟件進行顯著性差異分析。

2　結果與分析

2.1　羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基是化學性質最活潑的一種活性氧。按1.2.2的實驗方法,得到番茄紅素油樹脂和幾種食用油復合物自由基清除率的結果如圖1,除了質量濃度為10 μg/mL的花生油和大豆油,其他各種油的羥基自由基清除率之間存在極顯著性差異(p<0.01);同種油不同質量濃度樣品之間也存在極顯著性差異(p<0.01)。在一定范圍內,隨著番茄紅素提取物質量濃度的增加,羥基自由基的清除率逐步提高。其中亞麻籽油復合物對羥基自由基的清除效果明顯好于其它的食用油,花生油和大豆油復合物對羥基自由基也有較強的清除能力,在30 μg/mL時清除率顯著增加。此實驗表明不同食用油與番茄紅素復合對羥基自由基的清除能力有顯著差異。

圖1　不同樣品對羥基自由基的清除效果Fig.1　Effect of different samples on hydroxyl radicals scavenging rate注:不同字母表示不同樣品間有極顯著性差異(p<0.01),相同字母表示兩者間沒有顯著性差異(p>0.05),圖4同。

2.2　DPPH自由基清除能力的測定

按1.2.3的實驗方法,得到番茄紅素油樹脂和幾種食用油復合物DPPH自由基清除率的結果如圖2,不同食用油和番茄紅素復合物對DPPH的清除效果有顯著性差異(p<0.05),尤其在質量濃度大于20 μg/mL后,差異性更顯著(p<0.05)。質量濃度在0～40 μg/mL范圍內,對DPPH自由基的清除能力均隨濃度的增大而增大,其中亞麻籽油和番茄紅素復合物的清除能力最強,在40 μg/mL時清除率達到最大值,隨后清除率開始下降,這可能是因為復合物為脂溶性,含量過高不能與反應液良好的混合,降低了對DPPH自由基的清除效果。此外,花生油的DPPH自由基清除率僅次于亞麻籽油而優于其它幾種植物油,其清除率隨著濃度增大呈上升趨勢,在50 μg/mL時,其清除效果要比亞麻籽油的最佳效果(即質量濃度為40 μg/mL時的清除效果)好,但是兩者間沒有顯著差異。大豆油和玉米油的DPPH自由基清除能力沒有顯著差異。

圖2　不同樣品對DPPH自由基的清除效果Fig.2　Effect of different samples on DPPH radicals scavenging rate注：不同字母表示不同樣品間有顯著性差異(p<0.05)，相同字母表示兩者間沒有顯著性差異(p>0.05)，圖3同。

2.3　ABTS自由基清除能力的測定

ABTS法作為物質抗氧化能力的評定方法之一,使用廣泛[22]。按1.2.4的實驗方法,得到番茄紅素油樹脂和幾種食用油復合物ABTS自由基清除能力的結果如圖3所示,不同的油和番茄紅素的復合物對ABTS的清除效果有顯著性差異(p<0.05)。亞麻籽油和番茄紅素的復合物對ABTS自由基清除能力最強,但當質量濃度大于30 μg/mL后,亞麻籽油的自由基清除能力開始下降,再次說明番茄紅素攝入適量,效果更好。此外,隨著濃度的增加葵花籽油的自由基清除能力的增長速度最快,在50 μg/mL時,與亞麻籽油差異最小。對于花生油,在質量濃度小于30 μg/mL時,清除率隨質量濃度增加而顯著增加,大于30 μg/mL后,增幅變緩。

圖3　不同樣品對ABTS的清除效果Fig.3　Effect of different samples on ABTS radicals scavenging rate

2.4　超氧陰離子自由基清除能力的測定

超氧陰離子自由基和羥基自由基同屬于活性氧自由基,性質十分活潑,能夠誘發機體細胞內脂質、蛋白質和DNA發生氧化損傷[23]。按1.2.5的實驗方法,不同的復合物對超氧陰離子自由基的清除效果有極顯著性差異(p<0.01)。番茄紅素油樹脂和幾種食用油復合物超氧陰離子自由基清除能力的結果如圖4所示,對超氧陰離子自由基的清除率隨著質量濃度的增大而增大,清除能力順序為:亞麻籽油>花生油>葵花籽油>大豆油>玉米油。亞麻籽油復合物在40 μg/mL時,清除效果極顯著增加(p<0.01),其它復合物均在30 μg/mL時極顯著增加(p<0.01),因此,在成本最小、效果最好的前提下,亞麻籽油復合物選擇40 μg/mL,而其它復合物選擇30 μg/mL。

圖4　不同樣品對超氧陰離子自由基的清除效果Fig.4　Effect of different samples on superoxide anion radicals scavenging rate

2.5　β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系

β-胡蘿卜素—亞油酸自氧化體系是一種常用的抗氧化活性評價方法,原理是亞油酸在高溫下產生的過氧化氫使β-胡蘿卜素褪色[24],而通過添加抗氧化劑及含有抗氧化物質的天然提取物,則可以使β-胡蘿卜素的褪色反應被抑制[21]。為了保證實驗結果良好的重復性,β-胡蘿卜素-亞油酸系統中的變量越少越好,因此本實驗中唯一的變量是食用油的不同。

2.5.1IC50值法β-胡蘿卜素-亞油酸自氧化體系中不同復合物的抗氧化能力達到50%時的濃度值(IC50)見圖5。從圖5中可知,不同混合物表現出不同的抗氧化活性?；緸閬喡樽延?花生油>大豆油>葵花籽油>玉米油。

圖5　β-胡蘿卜素-亞油酸體系中不同樣品抗氧化能力達到50%的濃度值Fig.5　IC50 values of test samples in β-carotene and linoleic acid system

2.5.2動力學反應速率各樣品中不同反應時間的β-胡蘿卜素殘留率如圖6所示,隨著時間延長,各反應樣品中β-胡蘿卜素殘留率逐漸下降,這與加熱因素導致亞油酸上的活性亞甲基脫氫,引發烷基游離基產生并進一步產生過氧游離基,從而引發亞油酸的自氧化反應,并大量產生游離基,這些游離基能與β-胡蘿卜素反應使之快速褪色有關。同時,亞麻籽油復合物抗氧化能力最強,大豆油和葵花籽油復合物的抗氧化能力較弱,玉米油復合物隨時間延長抗氧化能力逐漸下降,最終β-胡蘿卜素殘留率高于花生油。

圖6　各樣品在40 μg/mL濃度時β-胡蘿卜素殘留率隨時間變化的動力學曲線Fig.6　The dependence of residual rate on time of incubation at a concentration of 40 mg/mL of investigated samples in β-carotene bleaching test

3　結論

綜上所述,與其它食用油相比,亞麻籽油與番茄紅素復合后具有更強的抗氧化能力。這可能是因為亞麻籽油是目前n-3含量最高的已知油脂之一,α-亞麻酸和亞油酸含量高達60%以上,還含有維生素E等,與番茄紅素有抗氧化協同作用。同時花生油中不飽和脂肪酸的含量也較高,所以在很多方面花生油復合物的抗氧化性僅次于亞麻籽油復合物。大豆油復合物對羥基自由基、DPPH自由基和ABTS也有較好的清除效果,這也許是大豆油成為人們首選的原因之一。玉米油與葵花籽油復合物的抗氧化能力大多不及其它食用油,但在某些質量濃度時也有較好的抗氧化性。因此,消費者不能一概而論,應該注意抗氧化能力也受番茄紅素質量濃度的影響。

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