葡聚糖-大豆分離蛋白耦聯接枝工藝優化及接枝產物理化特性研究

,,,

(華中農業大學食品科技學院,環境食品學教育部重點實驗室,湖北武漢 430070)

大豆分離蛋白(soy protein isolate,SPI)是以大豆粕為原料分離提取的一種含高蛋白、低膽固醇的植物蛋白質[1]。SPI營養資源豐富,具有乳化性、凝膠性、起泡性等良好的功能性質,作為功能性食品添加劑被廣泛應用[2]。但單一的SPI無法兼具良好的溶解性、乳化穩定性、熱穩定性,且具有抗原性、過敏源性等缺陷,因此致力于SPI改性,對其功能性和新用途進行開發是國內外學者研究的熱點[3-4]。

多糖耦聯接枝蛋白改性是基于美拉德(Maillard)反應的一種綠色的蛋白改性方法。改性后,蛋白的功能特性顯著提高,抗原性降低,抗氧化性、抑菌性等增高[5]。作為中性多糖的葡聚糖(DEX)具有良好的水溶性、安全穩定性及良好的生理功能[6]。布冠好等[7]研究了葡聚糖-SPI對大豆蛋白抗原性的影響,得到糖基化產物中β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的抗原性分別降低了36.90%和18.12%。葡聚糖與蛋白耦聯后,可在水中組裝為兩親性接枝共聚物,潘曉云等[8]人制備得到酪蛋白-葡聚糖共價結合物的天然高分子膠束,該膠束可包埋芘、β-胡蘿卜素等疏水化合物。因此,糖接枝蛋白的研究為開發新型食品添加劑提供了一條新的途徑。

目前傳統的糖接枝工藝存在接枝效率低、反應時間長、褐變程度大等問題,且干熱法由于對溫度、濕度要求嚴格等不適于大規模生產[9],故尋找條件溫和、高接枝度、低褐變程度的工藝是急需解決的熱點問題。已有學者研究過濕法糖基化改性,但葡聚糖接枝蛋白工藝研究甚少。因此本研究以SPI為研究對象,以葡聚糖對其進行糖接枝改性,分析了相關因素對SPI-葡聚糖接枝度(degree of grafting,DG)和褐變度(A420 nm)的影響,利用Box-Behnken實驗設計和響應面分析,確定最佳工藝條件,從而為糖接枝蛋白的實際生產提供技術依據。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

大豆分離蛋白蛋白含量≥95%;葡聚糖分子量50 kDa,上海源葉生物科技有限公司;鄰苯二甲醛(OPA)、β-巰基乙醇分析純,美國Sigma公司;十二烷基硫酸鈉(SDS)、氫氧化鈉、鹽酸、硼砂、甲醇、四硼酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍等均為分析純。

DK-98-IIA恒溫數顯水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司;PB-10 pH計德國Sartorius;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器鄭州長城科工貿有限公司;CR21GIII低溫高速離心機日本日立公司;UV-1800 UV-Vis分光光度計日本島津;AvantiJ-E超速冷凍離心機美國Beckman;S-433 氨基酸分析儀德國Sykam;Direct8超純水系統美國Millipore;PowerPacTM通用電泳儀美國伯樂公司。

1.2　實驗方法

1.2.1SPI-葡聚糖接枝物的制備將葡聚糖與SPI按照不同物質的量之比,以去離子水配制成蛋白質量濃度為1.4%的混合液;以0.1 mol/L HCl/NaOH調節,使混合液pH為7.0,用磁力攪拌器低速攪拌2 h;將混合液放入恒溫水浴搖床中初步溫浴,調節溫度為50 ℃、溫浴30 min;置于恒溫水浴鍋中,在一定反應溫度下接枝反應一定時間后,冰浴5 min,結束反應即得到葡聚糖-大豆蛋白接枝物。分別以SPI、恒溫加熱SPI、SPI與葡聚糖物理混合物為對照,進行相關指標的對比檢測。

1.2.2工藝優化設計

1.2.2.1單因素實驗在蛋白質量濃度為1.4%、初步溫浴溫度為50 ℃、時間為30 min條件下(這些條件在預實驗中已經確定),改變參數,研究反應溫度、反應時間、蛋白與糖物料比對糖接枝蛋白接枝度與褐變程度的影響。

在反應溫度為85 ℃、反應時間7.0 h的條件下,物料比(蛋白∶糖)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5,研究物料比對共價接枝物制備的影響。

在物料比(蛋白∶糖)為1∶2,反應時間7.0 h的條件下,反應溫度分別為75、80、85、90、95 ℃,研究反應溫度對共價接枝物制備的影響。

在物料比(蛋白∶糖的比例)為1∶2、反應溫度為85 ℃的條件下,反應時間分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 h,研究反應時間對共價接枝物制備的影響。

1.2.2.2響應面實驗依據單因素實驗結果,進行響應面法Box-Behnken Design實驗設計。以反應溫度、反應時間、蛋白與糖物料比為獨立變量(A、B、C),以接枝度為響應值,實驗因素水平設計見表1。

表1　響應面因素水平編碼表Table 1　Variables and levels in response surface

1.2.3接枝度(DG)的測定樣品中游離氨基的含量通過OPA方法檢測[10-12]。配制OPA試劑:將40 mg OPA溶解于1 mL甲醇溶液中,加入25 mL 0.1 mol/L的四硼酸鈉、2.5 mL十二烷基磺酸鈉(20% SDS)、100 μLβ-巰基乙醇、去離子水,以量筒將最終體積定容為50 mL。將200 μL的樣品溶液(蛋白含量為2 mg/mL)加入到4 mL OPA試劑中渦旋振蕩,35 ℃下反應2 min,在340 nm下檢測吸光值,來計算游離氨基含量。樣品接枝度的計算如式(1)。

式(1)

其中:At代表大豆分離蛋白與多糖共價交聯產物所測得的吸光值;A0代表大豆分離蛋白與多糖物理混合物所測定的吸光值。

1.2.4褐變程度(A420 nm)測定取3.0 mL 樣品液加入1.0 mL 稀釋液(含10%(w/w)SDS及0.05 mol/L 硼砂),以稀釋液作空白,在420 nm下測定吸光值A420 nm[13-15]。

1.2.5聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)以優化工藝制備的接枝物參照LaemmLi[16]法進行SDS-PAGE分析。樣品蛋白濃度為2 mg/mL,上樣量10 μL。分離膠和濃縮膠質量分數分別為12%和3%,分別設定電壓為120 V和80 V進行電泳,以考馬斯亮藍R-250染色。

1.2.6氨基酸分析以優化工藝制備的接枝物進行氨基酸分析,參照LaemmLi[16]的方法并作適當改進。將樣品分別置于消解管中,以6 mol/L HCl溶液水解,抽真空,110 ℃下水解24 h;冷卻、定容、過濾、蒸干后加入0.02 mol/L的HCl 溶液,上樣氨基酸自動分析儀中真空放置30 min,對氨基酸含量進行測定。

1.2.7溶解度的測定以優化工藝制備的接枝物進行蛋白質溶解能力的測量,參考胡昊等[17]的方法并做適當修改?；旌衔镌趽u床中室溫振蕩1 h后,在4 ℃、20000×g下離心20 min。上清液中的蛋白含量通過Lowry法測定[18],樣品溶解度的計算參見式(2)。

式(2)

1.2.8乳化性的測定以優化工藝制備的接枝物進行乳化性的測定,參照Pearce[19]的方法并作適當改進。以0.2 mol/L、pH7.0的磷酸緩沖液配制蛋白濃度為0.5%(w/v)的樣品溶液。取3 mL樣品液與1 mL玉米油,用均質機均質1 min,分別于0、10 min從底部取樣50 μL,以0.3%(w/v)SDS溶液稀釋200倍后,在500 nm處測吸光值。樣品乳化活性(EAI)的計算參見式(3)、乳化穩定性(ESI)的計算參見式(4)。

式(3)

式(4)

其中:A0和A10分別為0 min和10 min時樣品稀釋液所測得的吸光值;DF為稀釋倍數;c為蛋白濃度(g/mL);Φ為乳狀液中油所占比例(v/v)。

1.2.9數據處理采用Design-Expert V8.0.6對實驗數據進行回歸分析及響應曲面繪制,多項式模型方程擬合由決定系數R2表達,利用F檢驗分析顯著性。

2　結果與分析

2.1　單因素實驗

2.1.1物料比對接枝度、褐變程度的影響物料比對接枝度、褐變程度的影響如圖1。隨SPI與葡聚糖的比例由1∶1增加到1∶5,接枝度呈現先增加后減小的趨勢,在1∶2處得到最大接枝度43.31%,這是因為在一定配比范圍內,隨葡聚糖增加,產生“大分子擁擠效應”,利于糖接枝反應的進行,但葡聚糖濃度繼續增大,體系粘度上升,分子流動性和擴散性變差,蛋白與多糖空間阻礙變大,反應程度降低,接枝度變小[20]。褐變程度變化趨勢與接枝度相同,在1∶2處取得最大褐變值0.043,但體系總體褐變程度極低,可忽略不計,因此選擇反應物料比為1∶2比較好。

圖1　物料比對糖接枝蛋白接枝度、褐變程度的影響Fig.1　Effect of material ratio on degree of grafting and browning degree of SPI-DEX conjugates

2.1.2反應溫度對接枝度與褐變程度的影響隨溫度由75 ℃升至95 ℃,接枝度由27.94%升高至48.81%,后降低至36.76%,呈現先上升后下降的趨勢,并在85 ℃取得峰值(圖2)。提高反應溫度使蛋白結構疏松,增加蛋白分子中的自由氨基與還原糖羰基的熱運動,利于接枝反應的進行。但過高的溫度會導致蛋白的熱變性和凝聚現象,自由氨基減少,導致接枝度下降。褐變程度隨溫度升高,呈現不斷增大的趨勢,95 ℃條件下的褐變程度最高,為0.058。高溫促使體系向美拉德反應的高級階段進行,形成棕色色素,使褐變程度增加,但從褐變值來看,體系總體褐變程度仍然較低。因此,選擇85 ℃為反應溫度較好。

圖2　反應溫度對糖接枝蛋白接枝度、褐變程度的影響Fig.2　Effect of reaction temperature on degree of grafting and browning degree of SPI-DEX conjugates

2.1.3反應時間對接枝度、褐變程度的影響圖3中顯示的是反應時間對接枝度、褐變程度的影響。隨反應時間由4 h 增加到7 h,接枝度由20.56%增至47.68%,在反應7 h取得最大接枝度,因為蛋白分子逐漸展開、解聚,分子內部氨基與多糖反應,接枝度增加;但繼續延長反應時間至9 h,接枝度明顯降低至21.40%,因為隨反應時間延長,蛋白水解,自由氨基含量增多,導致計算出的接枝度減小。褐變指數隨時間的延長不斷增大至0.056,但從褐變指數來看,體系褐變程度仍然很低。因此,選擇7 h為反應時間比較合適。

圖3　反應時間對糖接枝蛋白接枝度、褐變程度的影響Fig.3　Effect of reaction time on degree of grafting and browning degree of SPI-DEX conjugates

2.2　響應面實驗分析

2.2.1方差分析及回歸方程由于所得糖接枝蛋白總體褐變程度很低(Amax≤0.06),為得到高接枝度的最佳優化工藝,故只以接枝度(DG)為響應值,結果見表2。

表3　回歸方程方差分析Table 3　Variance analyses of regression equation

注：“**”表示差異極顯著(p<0.01);“*”表示差異顯著(p<0.05);“-”表示差異不顯著。

根據表2結果,通過Design-Expert軟件分析獲得回歸方程為:糖接枝蛋白接枝度DG(%)=51.77-5.71A-8.26B+4.58C+2.31AB-2.61AC-7.27BC-6.99A2-16.19B2-5.51C2?；貧w方程決定系數為0.959。從方差分析(表3)可看出,模型失擬項p=0.5218>0.05,不顯著,說明響應面分析對實驗擬合性好,實驗誤差小,可分析和預測糖接枝蛋白制備效果。其中,變量A、B、二次項B2均達到極顯著水平,變量C、二次項A2、C2均達到顯著水平,AB、AC交互項不顯著,BC達到極顯著水平。

表2　響應面實驗設計及結果Table 2　Box-Behnken design and experimental results

2.2.2響應曲面分析與優化響應曲面及等高線見圖4～圖6。蛋白質、多糖都是生物大分子,反應速度與底物濃度、溫度關系比較密切,物料比的主效應比較顯著,而與反應溫度、反應時間的交互作用不顯著,物料比過大或過小均對接枝度有負面影響。反應溫度與反應時間的交互作用達到極顯著水平,隨著反應時間和反應溫度的增加,糖接枝蛋白的接枝度迅速提高,然后趨于穩定,再逐漸減小。三個變量中,反應溫度對響應值的影響最大,物料比次之,反應時間最小。對回歸模型進行分析,得到最大響應值所對應的因素水平分別為:A=1∶1.15,B=82.89 ℃,C=7.33 h,但從儀器的真實狀況與操作的實用性考慮,最優條件確定為:物料比1∶1.2、反應溫度為83 ℃、反應時間為7.3 h,并預測接枝度最高達56.90%。

圖4　Y=f(A,B)響應曲面及等高線 Fig.4　Response surface and contour for Y=f(A,B)

圖5　Y=f(A,C)響應曲面及等高線 Fig.5　Response surface and contour for Y=f(A,C)

圖6　Y=f(B,C)響應曲面及等高線 Fig.6　Response surface and contour for Y=f(B,C)

為驗證回歸模型,在最優工藝下進行3次重復實驗,接枝度分別為55.96%、56.73%、56.45%,平均56.38%±0.23%?；貧w方程的最大預測值與實驗數值接近,說明回歸方程較真實地反映了各因素對響應值的影響。利用響應面分析法優化糖接枝蛋白制備的技術參數,效果較理想。最優工藝制備接枝物的褐變程度A420 nm為0.041。

2.3　接枝物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

圖7為接枝度為52.54%的SPI-DEX與不同對照的電泳圖譜。由圖7可看出,SPI和SPI、DEX物理混合物條帶較為完整,而83 ℃處理7 h的SPI因熱解為多肽,故其亞基條帶(α,β亞基)逐漸消失。與對照相比,高接枝度的糖蛋白樣品圖譜上基本看不到亞基的譜帶,是因為考馬斯亮藍在酸性條件下通常與蛋白質分子上的自由氨基、巰基等活性基團以靜電相交互作用而結合,從而顯藍色譜帶。而蛋白與糖接枝后,自由氨基減少,故減少了染色劑與蛋白分子的結合,從而高接枝度樣品電泳凝膠不顯色,因此證明SPI與DEX以共價鍵結合。其中最末端條帶的存在,可能是因為樣品中含有未能參與接枝反應的游離氨基酸殘基,此電泳結果與Safoura[13]、穆利霞[21]研究結果相同。

圖7　分子量標記的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜Fig.7　SDS-PAGE pattern of molecular weight注:M:標準蛋白;1:SPI;2:83 ℃加熱7 h SPI;3:未反應SPI、DEX物理混合物;4:SPI-DEX接枝物。

2.4　接枝物的氨基酸組分的變化

表4　SPI與SPI-DEX接枝物的氨基酸含量Table 4　Amino acid content analysis of SPI and SPI-DEX conjugates

蛋白與多糖的耦聯接枝反應是基于蛋白的ε-氨基與多糖的還原性末端之間的美拉德反應。如表4可知,SPI與葡聚糖經熱處理后,賴氨酸和精氨酸均發生顯著下降,而賴氨酸和精氨酸是參與接枝反應的主要游離氨基酸,這一結果證明葡聚糖確實與SPI發生了接枝反應。

2.5　接枝物的溶解性分析

圖8為SPI和SPI-DEX接枝物的溶解度曲線,由圖8可看出,接枝物的溶解度隨pH增大逐漸上升,到pH為7.0處溶解度為99.85%,比原蛋白提高40.48%不受蛋白等電點的影響;而SPI在接近等電點(pH為4.5)處溶解度急速降低為3.59%,在pH為7.0處為59.43%,受等電點影響明顯。SPI-DEX溶解度均明顯高于SPI,t檢驗表明,與對照差異極顯著(t=7.67,p=0.00013),這可能是因為親水性葡聚糖接枝在蛋白上,受到親水羥基和電位等因素影響,使SPI溶解度提高。

圖8　SPI與SPI-DEX接枝物的溶解度曲線Fig.8　Solubility curve of SPI and SPI-DEX conjugates

2.6　接枝物的乳化性分析

乳化活性與穩定性分別表示蛋白質參與形成乳濁液的能力與保持乳液穩定,在一定時間內未出現分層絮凝的能力。由表5可看出,接枝物的乳化活性與乳化穩定性分別比原蛋白提高69.76%和62.11%。具有較好的乳化性是蛋白質與多糖共價交聯產物顯著的特征。

表5　SPI與SPI-DEX接枝物的乳化性Table 5　Emulsifying property of SPI and SPI-DEX conjugates

3　討論

接枝溫度與時間是影響接枝產物功能特性的關鍵因素,穆利霞等[21]以大豆分離蛋白為原料,與阿拉伯膠混合反應16 h制備接枝改性大豆分離蛋白,所得產物褐變指數為0.7。孫煒煒等[22]以乳清分離蛋白與葡聚糖的混合物在干熱條件下處理7 d,得到接枝度為35.77%、褐變指數為0.517的接枝產物,因接枝反應時間過長,反應向高級階段進行,生成類黑精色素、不飽和的棕色含氮聚合體等復雜產物,使褐變程度增大,產物提純困難。紀崴等[23]在100 ℃條件下制備乳化性優良的大米蛋白-乳糖接枝物,產物褐變程度達1.254,表明兩者反應劇烈。Kim等[24]研究了在100 ℃,初始pH7.8,葡萄糖與甘氨酸、二甘氨酸、三甘氨酸反應所得復合物的特性。研究發現:隨反應時間的延長,所有的美拉德反應產物在240 min時褐變程度達到最大。因此,選擇較低反應溫度、合適反應時間有利于糖與蛋白接枝反應的進行。本研究中,在反應溫度為83 ℃,反應時間為7.3 h的條件下,進行大豆分離蛋白與葡聚糖的接枝反應,條件比較溫和,時間較短,接枝度較高,而褐變指數較低;同時,接枝物的理化特性如:溶解度、乳化性及穩定性均有明顯改善。

4　結論

以接枝度、褐變程度為指標,利用響應面實驗設計對SPI-DEX接枝蛋白制備的工藝參數進行優化。結果表明,SPI-DEX制備的最佳工藝條件為:物料比(蛋白∶糖)1∶1.2,反應溫度83 ℃,反應時間7.3 h,此條件下接枝度為56.38%,與理論值56.90%接近,A420 nm為0.041,褐變程度極低,說明采用響應面法優化糖接枝蛋白的制備工藝參數的效果比較好。

分別以聚丙烯酰胺電泳、氨基酸分析鑒定糖接枝蛋白,證明葡聚糖確實以共價鍵接枝在蛋白上;糖接枝蛋白在pH為7.0處的溶解度為99.85%,與原蛋白相比提高了40.48%;乳化性、乳化穩定性分別比原蛋白提高69.76%和62.11%。

[1]于莉萍,遲玉杰,劉紅玉.糖基化提高大豆分離蛋白凝膠性的工藝條件[J]. 食品與發酵工業,2012,38(3):100-104.

[2]布冠好,張楠,陳復生.大豆蛋白-木糖復合物的抗原性、致敏性及結構特性研究[J]. 現代食品科技,2015,31(11):33-38,91.

[3]徐真真,黃國清,肖軍霞.干熱條件下大豆分離蛋白-木糖美拉德反應研究[J]. 糧油食品科技,2015,23(2):26-30.

[4]Comas D I,Wagner J R,Tomas M C. Creaming stability of oil in water(O/W)emulsions:Influence of pH on soybean protein-lecithin interaction[J]. Food Hydrocolloids,2006,20(7):990-996.

[5]Corzo-Martinez M,Soria A C,Belloque J,et al. Effect of glycation on the gastrointestinal digestibility and immunoreactivity of bovineβ-lactoglobulin[J]. International Dairy Journal,2010,20(11):742-752.

[6]Chen S N,Jiang L Z,Li Y,et al. Ultrasound-assisted enzymatic extraction of dietary fiber from pods[J]. Procedia Engineering,2011,15:5056-5061.

[7]布冠好,朱婷偉,陳復生.糖基化改性對大豆蛋白抗原性及結構特性的影響[J].中國糧油學報,2017,32(1):35-39.

[8]Pan X Y,Mu M F,Hu B,et al. Micellization of casein-graft-dextran copolymer prepared through Maillard reaction[J]. Biopolymers,2006,81(1):29-38.

[9]何曉葉,邰克東,高彥祥,等.美拉德反應制備蛋白質-多糖共價復合物的研究進展[J].食品工業科技,2016,37(6):377-382.

[10]Lydia J Campbell. Influence of sugars on the characteristics of glucono-δ-lactone-induced soy protein isolate gels[J]. Food Hydrocolloids,2009,23:314-326.

[11]Chevalier F,Hobert J M,Popineau Y,et al. Improvement of functional properties ofβ-Lactoglobulin glycated through the Maillard reaction is related to the nature of the sugar[J]. International Dairy Journal,2001(11):145-152.

[12]夏秀芳,洪巖,鄭環宇,等.濕法糖基化改性對大豆分離蛋白溶解性和乳化能力的影響[J]. 中國食品學報,2016,16(1):167-172.

[13]Safoura Pirestani,Ali Nasirpoura,Javad Keramata,et al. Preparation of chemically modified canola protein isolate with gum Arabic by means of Maillard reaction under wet-heating conditions[J]. Carbohydrate Polymers,2017,155:201-207.

[14]賴穎,李青芝,鐘可.糖基化大豆分離蛋白制備工藝優化及對其性質的影響[J]. 大豆科學,2016,37(6):452-458.

[15]袁旦,秦新光,劉剛,等.美拉德反應制備等電點澄清透明的乳清分離蛋白研究[J]. 現代食品科技,2017,36(3):160-166,122.

[16]Laemmli U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4[J]. Nature,1970,227：680-685.

[17]Hu Hao,Fan Xin,Zhou Zhi,et al. Acid-induced gelation behavior of soybean protein isolate with high intensity ultrasonic pre-treatments[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2013,20(1):187-195.

[18]Yin Shouwei,Tang Chuanhe,Wen Qibiao,et al. Properties of cast films from hemp(CannabissativaL.)and soy protein isolates. A comparative study[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry,2007,55(18):7399-7404.

[19]Pearce K N,Kinsella J E. Emulsifying properties of proteins:Evaluation of a turbidimetric technique[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1978,26:716-723.

[20]Zhu D,Damodaran S,Lucey J A. Formation of whey protein isolate(WPI)-dextran conjugates in aqueous solutions[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56(16):7113-7118.

[21]穆利霞,崔春,趙謀明,等.阿拉伯膠-大豆分離蛋白接枝工藝優化及產物理化特性的研究[J]. 農產品加工,2016(8):174-177.

[22]孫煒煒,于淑娟,楊曉泉,等.乳清分離蛋白-葡聚糖接枝物性質的熒光光譜法分析[J]. 光譜學與光譜分析,2011,31(12):3307-3310.

[23]紀崴,麻建國,李玥,等.限制性水解大米蛋白-不同多糖復合產物的制備及功能性質的研究[J]. 食品科學,2010,31(5):30-34.

[24]Kim J S,Lee Y S. Study of Maillard reaction products derived from aqueous model systems with different peptide chain lengths[J]. Food Chemistry,2009,116(4):846-853.