中華鱘軟骨Ⅱ型膠原蛋白的結構分析

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(1.青島海洋生物醫藥研究院,山東青島 266000; 2.中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266000)

鱘魚的人工養殖業已經在許多國家先后興起,我國鱘魚年產量超過2.5萬噸,已經成為鱘魚養殖第一大國[1]。鱘魚軟骨具有豐富的營養價值,獨特的醫藥和保健價值,素有“鯊魚翅、鱘魚骨,食之明目壯陽,延年益壽”的說法[2]。鱘魚體格大,軟骨在鱘魚體內所占比例約5.7%,除了部分骨化的魚鰭和頭部的一塊真骨外,其它部分的骨骼均為軟骨[3]。軟骨中的主要成分是纖維狀的Ⅱ型膠原蛋白、大分子量的蛋白聚糖和酸性多糖[4],能夠起到保護組織的作用,軟骨的大多數生理特征是依賴于完整的Ⅱ型膠原蛋白網絡。前人研究表明,Ⅱ型膠原蛋白能夠促進軟骨細胞的分化,增進骨骼的健康,特別對類風濕性關節炎有明顯的防治功效,因此其在治療骨關節疾病方面有著重要的作用[5-6]。目前報道對Ⅱ型膠原蛋白的提取多集中于動物的關節軟骨,由于其資源量有限,且很難從成熟的動物關節中分離出來,因此很難得到純度較高的Ⅱ型膠原蛋白。對鱘魚膠原蛋白的研究多集中于魚皮I型膠原蛋白的研究[7-9],對軟骨中Ⅱ型膠原蛋白的研究較少,且實驗原料為史氏鱘軟骨[10]?，F如今的加工過程中鱘魚軟骨多被廢棄或者用于軟骨中硫酸軟骨素的提取,而其中Ⅱ型膠原蛋白未被充分開發利用。本實驗以一種可食用的中華鱘軟骨為研究對象,研究其中Ⅱ型膠原蛋白的結構性質,為開發可食用中華鱘軟骨為原料的天然生物保健品提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

鱘魚軟骨由浙江海力生集團有限公司提供,為一種可食用的中華鱘軟骨;氫氧化鈉(0.1 mol/L)、氫氧化鈉(6 mol/L)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(0.5 mol/L)、冰醋酸(0.5 mol/L)、冰醋酸(0.1 mol/L)、氯化鈉(2.6 mol/L)、鹽酸(6 mol/L)、甲醇(45%)、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍R-250(0.1%)國藥集團;濃縮膠(4%)、分離膠(8%)索萊寶公司;溴化鉀光譜純,Sigma公司;胃蛋白酶(≥400 U/mg)Sigma公司。

ST16R高速冷凍離心機美國Thermo Fisher公司;FD-1A-50冷凍干燥機上海比朗儀器設備有限公司;DYY-6C蛋白電泳儀北京六一儀器廠;L-8900氨基酸自動分析儀日本Hitachi公司;Cary4000紫外分光光度計美國Agilent公司;Nicolet iS5傅里葉紅外變換光譜儀美國Thermo Fisher公司;DSC-200PC差示掃描量熱儀德國Bavaria公司;J-815圓二色譜儀日本Jasco公司;JSM-7500掃描電鏡日本JEOL公司。

1.2　實驗方法

1.2.1膠原蛋白的提取參考Qiufang Liang等[7]、Phanat等[4]和宋瑞瑞等[8]的方法,中華鱘軟骨中膠原蛋白的提取操作均在4 ℃條件下進行。將中華鱘軟骨用冰水沖洗,去除其表面的雜質及非軟骨組織,切塊后冰凍絞碎稱重。按照軟骨的重量加入10倍體積預冷的0.1 mol/L NaOH處理48 h,每6 h換一次液,用來去除中華鱘軟骨中的非膠原成分,后用冰水沖洗至中性。加入10倍體積預冷的pH7.4的0.5 mol/L EDTA處理48 h,每8 h換一次液,用來去除中華鱘軟骨中的礦物質,后用預冷的純水清洗沉淀3次。將沉淀混懸于15倍體積,含有0.1 g/100 mL胃蛋白酶的0.5 mol/L冰醋酸中,攪拌48 h。將提取液于4 ℃,10000 r/min離心30 min,得到的上清液迅速用6 mol/L NaOH調節pH至7.5滅酶,置于4 ℃暫存;沉淀重懸于15倍體積,含有0.1 g/100 mL胃蛋白酶的0.5 mol/L冰醋酸中,攪拌48 h進行二次提取,重復上述步驟,合并兩次的上清液。緩慢向合并的上清液中加入磨細的NaCl粉末鹽析,至NaCl的終濃度為2.6 mol/L,期間需不斷攪拌,待NaCl全部溶解后靜置過夜。將鹽析液于4 ℃,10000 r/min離心30 min,離心后沉淀用少量0.5 mol/L冰醋酸溶解,用25倍體積的0.1 mol/L冰醋酸透析12 h,再用25倍體積的去離子水透析48 h,將透析后的溶液在-50 ℃,真空度20 Pa壓力下冷凍干燥得到中華鱘軟骨PSCⅡ。

1.2.2SDS-PAGE電泳將PSCⅡ配制成1 mg/mL溶液,進行SDS-PAGE電泳。濃縮膠濃度4%(pH6.8),分離膠濃度8%(pH8.8),采用直流恒壓電源,電壓100 V,電泳時間2.5 h,染色1 h后脫色。

染色液:0.1%考馬斯亮藍R-250-甲醇-冰醋酸(9∶9∶2,v/v/v);脫色液:冰醋酸-甲醇-水(1∶1∶8)。

1.2.3氨基酸組成分析稱取PSCⅡ樣品10 mg,用6 mol/L鹽酸在110 ℃下水解24 h,水解液脫酸后用磷酸緩沖液(pH2.2)定容,使用氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成，測定方法參照國標GB/T 5009.124-2003。

1.2.4紫外吸收光譜分析取少量PSCⅡ樣品溶解于0.5 mol/L乙酸溶液中,配制成濃度為1 mg/mL的溶液,以0.5 mol/L乙酸作為空白對照,用紫外分光光度計在200～400 nm范圍內進行紫外掃描。

1.2.5傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)將適量的PSCⅡ樣品與光譜純KBr放在瑪瑙研缽中混勻并研磨成粉狀。取適量研磨后樣品至壓片機中壓片,將樣品置于樣品室。用傅里葉變換紅外光譜儀對樣品在400～4000 cm-1區間掃描,分辨率設置為2 cm-1。

1.2.6熱穩定溫度分析(DSC)將PSCⅡ樣品溶解在0.05 mol/L的酸溶液中,得到最終濃度為25 mg/mL的樣品溶液,在4 ℃條件下放置48 h使其充分溶解,取3.5～5.5 mg 放入鋁制坩堝中,以空坩堝為空白,采用差示掃描量熱儀,加熱溫度范圍為25～140 ℃,加熱速率5 ℃ min-1,測定膠原蛋白最大熱轉變溫度(The maximum transition temperature,Tmax)。

1.2.7圓二色譜分析(CD)取適量PSCⅡ溶于0.5 mol/L醋酸中,配成0.25 mg/mL的膠原蛋白溶液。充分溶解后,以10000 r/min,4 ℃冷凍離心20 min,取上清,采用圓二色譜儀于10 ℃進行光譜掃描,比色皿光程為1 mm,掃描波長范圍為190～300 nm,空白對照為0.5 mol/L的醋酸溶液。

1.2.8掃描電鏡分析(SEM)將冷凍干燥的PSCⅡ樣品真空噴金,取樣品的自然斷面為觀察面。將加速電壓設為3.0 kV,使用掃描電鏡(SEM)對樣品顯微結構進行觀察。

2　結果與分析

2.1　中華鱘軟骨PSCⅡ的SDS-PAGE電泳分析

將PSCⅡ經SDS-PAGE電泳分析后,電泳圖譜如圖1。圖中可見,PSCⅡ樣品由兩種亞基組成(α和β),未見其他明顯雜帶,說明提取的PSCⅡ純度較高。在約110 kDa附近有單一的α1亞基,在200 kDa左右有一條二聚體β亞基。PSCⅡ的分子亞基結構與之前報道的Ⅱ型膠原蛋白結構一致[5-9],因此可判斷中華鱘軟骨中的膠原蛋白為Ⅱ型膠原蛋白。

圖1　PSCⅡ的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.1　SDS-PAGE result of PSCⅡ

2.2　中華鱘軟骨PSCⅡ的氨基酸分析

中華鱘軟骨PSCⅡ的氨基酸組成如表1所示,在PSCⅡ中甘氨酸的含量最高,約占總氨基酸殘基數的1/3,富含丙氨酸和脯氨酸殘基,酪氨酸、半胱氨酸和組氨酸的含量較低,是典型的膠原蛋白特征。

2.3　中華鱘軟骨PSCⅡ紫外吸收光譜分析

中華鱘軟骨PSCⅡ紫外吸收光譜圖如圖2所示。

表1　中華鱘軟骨PSCⅡ的氨基酸組成Table 1　Amino acid composition of PSCⅡ from sturgeon cartilage

圖2　中華鱘軟骨PSCⅡ紫外吸收光譜圖Fig.2　The UV spectrum of type Ⅱ collagen from sturgeon cartilage

注：氨基酸含量以每1000個總氨基酸殘基中的殘基數表示。

由圖2可見,PSCⅡ在229 nm處出現最大吸收峰,與藍鯊軟骨Ⅱ型膠原蛋白226 nm處出現最大吸收峰[8]和魷魚軟骨Ⅱ型膠原蛋白224.5 nm處出現最大吸收峰[6]相近,此吸收峰與多肽鏈的氨基酸組成和螺旋程度有關,具有膠原三螺旋結構的典型紫外吸收圖譜特點。由于PSCⅡ中芳香族氨基酸含量較少,因此在280 nm處無明顯的吸光值[9],因此可判定提取的PSCⅡ有較高的純度。

2.4　中華鱘軟骨PSCⅡ傅里葉變換紅外光譜分析

中華鱘軟骨PSCⅡ的傅里葉變換紅外光譜分析結果如圖3所示,光譜掃描范圍為4000～650 cm-1。根據Muyonga報道[12],酰胺A帶的N-H伸縮振動吸收峰通常出現在3400～3450 cm-1,由圖3可見,鱘魚軟骨PSCⅡ的酰胺A帶出現在3435.42 cm-1。2945.35 cm-1處為酰胺B的紅外吸收譜帶,其主要是由手性的CH2伸縮震動引起的。酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ與酰胺Ⅲ和膠原蛋白的分子序列及三螺旋結構有關[13],1665.69 cm-1為酰胺I帶的振動峰,其與C=O伸縮振動作用相關,吸收峰最強,是蛋白質二級結構變化的敏感區域[14-15]。1557.29 cm-1為酰胺Ⅱ帶的吸收峰,由N-H彎曲振動和C-N伸縮振動產生[16],為β-折疊和無規則卷曲疊加產生的吸收帶。1200～1360 cm-1譜帶歸屬酰胺Ⅲ帶,是由蛋白酰胺鍵的C-N伸縮振動和N-H變形,以及甘氨酸中CH2基團和脯氨酸側鏈的搖擺振動共同產生[13,17]。酰胺Ⅲ帶的吸收峰和1454 cm-1處吸收峰的比值約為1,說明提取的PSCⅡ具有完整的三螺旋結構[7]。1200～1400 cm-1為N-H的伸縮振動峰和COO-的對稱收縮振動峰,這是其他蛋白質沒有的紅外光譜特征,可能是由于Ⅱ型膠原蛋白的甘氨酸和羥脯氨酸及脯氨酸的含量較高,使得膠原蛋白在1200～1400 cm-1光譜范圍內具有其他蛋白質所沒有的紅外光譜特征[5]。

圖3　中華鱘軟骨PSCⅡ的FTIR譜圖Fig.3　The spectrum of type Ⅱ collagen from sturgeon cartilage

2.5　中華鱘軟骨PSCⅡ熱穩定溫度分析

如圖4所示,PSCⅡ存在兩個熱吸收峰。第一個熱吸收峰與膠原蛋白的熱變性溫度有關,PSCⅡ的熱變性溫度為31.5 ℃,低于陸生生物的Ⅱ型膠原蛋白變性溫度(雞44 ℃[7],羊39 ℃[18]),也低于鯊魚Ⅱ型膠原蛋白的變性溫度(藍鯊40.5 ℃[8],斑竹鯊35.98 ℃和黑鰭鯊34.56 ℃[4]);第二個熱吸收峰與多肽鏈的斷裂相關,結果顯示PSC Ⅱ的多肽鏈斷裂溫度為110.7 ℃,低于之前文獻[7]中報道的鱘魚軟骨Ⅱ型膠原蛋白的肽鍵斷裂溫度,這可能與原料軟骨來源于鱘魚的品種不同有關,本實驗采用的鱘魚為中華鱘,而之前文獻中報道的鱘魚為史氏鱘。

圖4　中華鱘軟骨PSCⅡ的DSC曲線圖譜Fig.4　The DSC spectrum of type Ⅱ collagen from sturgeon cartilage

2.6　中華鱘軟骨PSCⅡ的圓二色譜分析

如圖5所示,PSCⅡ在198 nm出現負吸收譜帶,這是Ⅱ型膠原分子構象中無規則卷曲結構的典型特征;在221 nm處出現正吸收譜帶,是左旋聚脯氨酸(P-Ⅱ)構型肽鏈圓二色譜的典型特征[5,8];213 nm處為0,這是膠原蛋白三螺旋結構的典型特征[7]。PSCⅡ主要由β折疊和無規則卷曲組成,其中β折疊占46%,無規則卷曲占54%。

圖5　中華鱘軟骨PSCⅡ的CD圖譜Fig.5　The spectrum of type Ⅱ collagen from sturgeon cartilage

2.7　中華鱘軟骨PSCⅡ的掃描電鏡結果

中華鱘軟骨PSCⅡ的掃描電鏡結果如圖6所示,為不連續的多孔結構,具有多孔狀結構的膠原蛋白可以充當良好的藥物載體,其孔徑的大小與其在制備過程中的含水量有關。

圖6　鱘魚軟骨PSCⅡ的掃描電鏡結果(100×)Fig.6　The scanning electron microscope of type Ⅱ collagen from sturgeon cartilage(100×)

3　結論

本實驗采用胃蛋白酶法輔助提取中華鱘軟骨中的Ⅱ型膠原蛋白,經終濃度2.6 mol/L NaCl鹽析后通過透析、冷凍干燥獲得了較純的PSCⅡ。SDS-PAGE顯示其含有110 kDa和200 kDa兩種亞基,與已報道的Ⅱ型膠原蛋白一致;紫外吸收最大峰出現在229 nm;傅里葉變換紅外光譜分析與圓二色譜分析結果均符合Ⅱ型膠原蛋白的特征。氨基酸分析表明PSCⅡ中甘氨酸的含量最高,約占總氨基酸殘基數的1/3,富含丙氨酸和脯氨酸殘基,酪氨酸、半胱氨酸和組氨酸的含量較低,是典型的膠原蛋白特征。熱穩定分析表明,其熱變性溫度低于陸生動物,略低于深海魚類,這可能是由于其生存的環境及物種間的差異導致的。掃描電鏡顯示PSCⅡ為不規則多孔狀結構,可以作為良好的藥物載體。本文通過對一種可食用的中華鱘軟骨中Ⅱ型膠原蛋白的氨基酸組成及結構分析,為后續其應用提供了一定的理論基礎。

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