鴿肉酶解液水解工藝優化及其體外抗氧化性研究

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(金陵科技學院食品科學系,江蘇南京 210038)

鴿肉不僅具有豐富的營養價值,而且對人體有良好的保健功能。鴿肉中含有較多的支鏈氨基酸和精氨酸,可促進體內蛋白質的合成,加快創傷愈合[1]。肉鴿養殖業曾是農民增收致富的好途徑,但經過近十幾年肉鴿養殖的發展,我國的肉鴿養殖業進入了瓶頸時期,其中一個主要的問題是肉鴿深加工程度及其技術含量不夠,難以創造更高的產品價值,也難以具備較高的抵抗養殖市場風險的能力。目前,肉鴿的銷售以農貿市場肉鴿胴體和酒店的餐飲菜肴為主,而少量的深加工也僅是以肉鴿軟包裝罐頭為主[2]。消費者食用肉鴿一方面是因為可以享受傳統菜肴風味,另一個是肉鴿還提供了一定的保健功能。但傳統的加工產品攜帶不便,以肉鴿為原料酶解獲得的氨基酸液中氨基酸種類豐富,必需氨基酸占總氨基酸的比例達到42%[3],并且藥用氨基酸含量高,以鴿肉水解液進行后續氨基酸口服液加工可以大大提高產品附加值,延伸肉鴿養殖產業鏈。

采用酶解技術進行肉制品深加工的報道很多,但應用在鴿肉加工方面的研究較少,曾哲霖等人利用風味蛋白酶催化水解鴿肉制備了鴿肉寡肽,寡肽濃度為0.056 g/mL[4]。周劍忠等人以乳鴿脯肉為原料,選擇復合蛋白酶(Protamex)和復合風味酶(Flavourzyme)進行了鴿肉水解液的制備,單一酶解液水解度為25%左右[5]。關于水解液抗氧化活性報道主要集中在水產原料水解液的抗氧化活性研究,如劉姝等人對太平洋牡蠣水解液的抗氧化活性進行了研究[6],龔志強等人對金槍魚碎肉水解液抗氧化活性進行了研究[7]。此外,陳盛楠等人還對花生粕酶解液的抗氧化性進行了研究[8]。雖然關于水解液抗氧化活性的研究不少,但關于鴿肉水解液的抗氧化活性研究的報道尚未查見。本研究采用酶解技術進行無公害乳鴿肉精深加工技術的研究,以水解度為指標,從堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶中篩選出對鴿肉蛋白水解效果較好的蛋白酶,通過單因素實驗和正交實驗進行水解工藝的優化,確定水解鴿肉的最佳工藝條件,并對水解液進行了體外抗氧化性能的研究。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

乳鴿肉(胸脯肉)南京東溝鴿業有限公司提供;木瓜蛋白酶、風味蛋白酶、堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶購自南京都萊生物技術有限公司;其他試劑均為市售,分析純。

A-88組織搗碎機常州金南儀器制造有限公司;FA1204B電子天平上海精科天美科學儀器有限公司;SPX-150BSH-Ⅱ培養箱上海新苗醫療器械制造有限公司;MX-9渦旋振蕩器大龍興創實驗儀器(北京)有限公司;DHG-9073BS-Ⅲ干燥箱上海新苗醫療器械制造有限公司;H2050臺式高速冷凍離心機湖南湘儀離心機儀器有限公司;K9840凱氏定氮裝置濟南海能儀器股份有限公司;PHS-3C酸度計上海儀電科學儀器股份有限公司;85-1磁力攪拌器常州潤華電器有限公司;Alpha-1860紫外可見分光光度計上海譜元儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1鴿肉酶解液制備參考文獻[9]并進行適當修改。鴿肉洗凈→按比例加水(水面剛好沒過鴿肉)→勻漿→調節pH→加入蛋白酶→保溫酶解→90 ℃滅酶10 min→離心(4000 r/min,4 ℃,15 min)→取上清得到鴿肉酶解液。

1.2.2鴿肉酶解單一酶的選擇采用堿性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶四種蛋白酶分別對原料鴿脯肉進行水解,加酶量均為600 U/g原料,分別在pH7.0,55 ℃、pH7.5,60 ℃、pH7.0,65 ℃、pH7.0,55 ℃條件下保溫酶解 2 h,以水解度為指標,比較不同蛋白酶對鴿肉的水解效果,從中選擇水解效果佳的單一蛋白酶。

1.2.3鴿肉酶解液水解工藝優化

1.2.3.1單因素實驗采用1.2.1方法水解得到鴿肉酶解液。水解條件為:固定水解時間為2 h,加酶量為600 U/g原料,考察不同反應溫度(45、50、55、60、65 ℃)對水解度的影響;固定水解時間為2 h,水解溫度為55 ℃,考察不同加酶量(400、500、600、700、800 U/g原料)對水解度的影響;固定加酶量為600 U/g,水解溫度為55 ℃,考察不同水解時間(2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h)對水解度的影響,上述各實驗均重復三次,考察各因素變量對水解度的影響。

1.2.3.2正交實驗在單因素實驗的基礎上,每個因素選取三個水平,建立三因素三水平正交實驗,因素水平表見表1。

表1　正交實驗設計因素水平表Table 1　Factors and their coded levels in orthogonal test

1.2.4總氮含量的測定采用凱氏定氮法[10]。

1.2.5總氨基酸態氮含量的測定采用電位滴定法[11]。

1.2.6水解度的計算公式參見文獻[5]。

1.2.7鴿肉酶解液體外抗氧化能力的測定

1.2.7.1鴿肉酶解液還原能力的測定采用鐵氰化鉀還原法,參考文獻[12]并作適當修改:取鴿肉酶解液或抗壞血酸溶液2 mL,加入0.2 mol/L pH6.6磷酸緩沖溶液2 mL,1%鐵氰化鉀溶液2 mL,在50 ℃水浴中保溫20 min后放置于預先準備好的冰水混合物中急速冷卻,加入10%三氯乙酸2 mL,6000 r/min條件下離心10 min,取上清液4 mL,加水3.2 mL,0.1%氯化鐵溶液0.8 mL,混勻,靜置10 min,在700 nm處測其吸光值。

1.2.7.2鴿肉酶解液對DPPH·清除能力的測定采用文獻方法測定[13]。取超純水3 mL以及0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液3 mL在暗處靜置30 min,用分光光度計在517 nm處測其吸光值,記為A0。將各個濃度的鴿肉酶解液或抗壞血酸溶液替換超純水重復上述操作,測其吸光值,記為A1,DPPH自由基清除率計算公式如下所示。

1.2.7.4鴿肉酶解液對羥自由基(·OH)清除能力的測定采用Fenton體系·OH清除法,參考文獻[15]并做適當改動:取 0.2 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖溶液1 mL,0.52 mg/mL番紅溶液0.2 mL,0.2 mol/L EDTA二鈉溶液0.5 mL,0.2 mol/L FeSO4溶液0.5 mL,不同濃度的樣品溶液(鴿肉酶解液或抗壞血酸溶液)7 mL,最后加入0.3%H2O20.8 mL,混勻,在40 ℃水浴鍋里保溫30 min,測定520 nm處的吸光值,記為A1。用超純水代替雙氧水重復同樣上述操作測定吸光值,記為A2,用超純水代替樣品溶液同樣重復上述操作測定吸光值,記為A0,羥自由基(·OH)清除率公式如下所示。

1.2.8數據分析數據結果以平均值±標準偏差的形式表示,數據分析采用IBM SPSS Statistics 22軟件。

2　結果與分析

2.1　單一蛋白酶的鴿肉水解效果

由圖1可知,風味蛋白酶酶解效果與其它蛋白酶水解效果差異顯著,且水解度最高。因此選出效果較好的風味蛋白酶進行水解效果單因素研究。

圖1　單一蛋白酶對鴿肉的水解效果Fig.1　The hydrolysis efficiency of different single proteinase 注:不同小寫字母表示實驗組間結果具有顯著性差異,p<0.05。

2.2　蛋白酶水解鴿肉工藝的優化

2.2.1蛋白酶水解鴿肉工藝單因素實驗結果風味蛋白酶水解效果的單因素結果如圖2所示。由圖2A可以看出:水解溫度上升,水解度略微提高,溫度超高55 ℃后,水解度開始下降,這是由于溫度高,酶活性受到破壞所致。由圖2B可以得知:隨著加酶量的增加,水解度逐漸上升,達到700 U/g原料后,水解度增加幅度較小,開始趨于平緩,這是由于雖然提高了加酶量,但是底物濃度基本一定,因此水解度在達到最大值后會基本保持不變。由圖2C可知:水解時間達到2.5 h后,水解度略有下降并趨于平緩,這很有可能也是和一定溫度下長時間酶活力下降有關。根據上述結果確定溫度50、55、60 ℃,加酶量600、700、800 U/g原料,水解時間2、2.5、3 h作為下一步工藝優化正交實驗的水平。

圖2　風味蛋白酶水解效果單因素實驗Fig.2　The single facter experiment hydrolysis efficiency of flavor protease

2.2.2蛋白酶水解鴿肉工藝正交實驗結果風味蛋白酶水解效果的正交實驗結果如表2所示。

表2　風味蛋白酶酶解L9(34)正交實驗結果Table 2　The orthogonal experiment result of hydrolysis using flavor protease

圖3　鴿肉酶解液體外抗氧化能力測定結果Fig.3　The antioxidant properties in vitro of hydrolysates from pigeon meat注：A：還原能力；B：DPPH·清除能力清除能力；D：·OH清除能力。

利用IBM SPSS Statistics 22進行F檢驗得知:水解溫度對水解度有影響(p<0.01),水解時間、加酶量對水解度無影響(p>0.05)。根據正交實驗分析的結果,水解度最高的水解工藝組合應為A2B1C2,而正交實驗組合中實際水解度最高的工藝組合為A3B3C2。經t檢驗,A2B1C2組合及A3B3C2兩者差異不顯著(p>0.05)?？紤]節省時間、蛋白酶消耗量等方面的因素,選擇A2B1C2作為最佳工藝組合,即加酶量600 U/g,溫度55 ℃,水解2.5 h,此條件下水解度為28.69%±0.29%。

2.3　鴿肉酶解液體外抗氧化能力的測定

將得到的鴿肉酶解液按比例進行稀釋,對其進行了抗氧化能力的檢測,并與抗壞血酸的抗氧化能力進行對比,結果如圖3。

3　結論

本文研究了幾種蛋白酶對鴿肉蛋白的水解效果,其中風味蛋白酶水解效果最佳,對水解工藝進行了優化,得到最佳水解條件為:水解溫度55 ℃,加酶量600 U/g(原料),pH為7.0,水解2.5 h,水解度為28.69%±0.29%。酶解液體外抗氧化實驗證實鴿肉酶解液具有良好的抗氧化能力。本研究對鴿肉深加工,尤其是鴿肉氨基酸口服液的研發具有重要的參考利用價值。

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