美拉德反應對泥鰍蛋白酶解產物抗氧化性能的強化研究

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(1.浙江海洋大學食品與醫藥學院,浙江舟山 316022; 2.浙江海洋大學經濟與管理學院，浙江舟山 316022； 3.浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室,舟山市疾病預防控制中心，浙江舟山 316021)

泥鰍是我國主要的水產品之一,其蛋白質含量高達17.4%[1-3]。目前對泥鰍的功能性質的研究主要集中在其粘液[4-6]功能因子方面,對蛋白質的研究較少?，F有的研究表明,從泥鰍中提取的蛋白、多糖、氨基酸等,具有提高機體免疫力、抗炎、抗氧化等作用[7-8]。游麗君[9]通過蛋白酶水解泥鰍蛋白,得到了具有較好抗氧化、抗腫瘤效果的肽類物質。但是,僅通過酶法水解得到的抗氧化功能物質穩定性較差,其后續的加工、利用率和推廣都受到了限制?；诖?制備出具有顯著抗氧化功效且性質穩定的酶解產物,對泥鰍蛋白的深度開發尤為重要。

美拉德反應又稱為“非酶棕色化反應”,是羰基化合物(還原糖類)和氨基化合物(氨基酸和蛋白質)間的反應,由法國化學家L C Maillard在1912年提出[10]。由于很多美拉德反應產物(Maillard reaction products,MRPs)能夠使食品增香增色且安全性較高,被廣泛應用于食品加工中。此外,人們還發現美拉德反應產物中的還原酮、類黑精和一系列含硫、氮的揮發性雜環化合物具有很強的抗氧化性,有些甚至能和常用的食品抗氧化劑相媲美[11]。由于化學合成抗氧化劑本身具有一定程度的毒副作用,因此,目前將美拉德反應作為提高某些食品抗氧化功能的手段成為了趨勢和研究熱點[12]。大量研究證明,美拉德反應能有效提高酶解產物的功能活性[13-15],如秦曉輝[17]通過美拉德反應極大地提升了珍珠蚌多肽的抗氧化能力[16];陳貴堂等采用抗氧化肽與果糖美拉德反應提高灰樹花多肽的抗氧化活性;李婷等[18]以黃鯽蛋白抗菌肽(HAHp)為底物,比較了HAHp-葡萄糖、HAHp-蔗糖、HAHp-麥芽糖和HAHp-乳糖的美拉德反應物抑菌活性;喬路等[19]用美拉德反應處理皺紋盤鮑臟器肽,與反應前相比,美拉德反應產物的DPPH自由基清除活性增強百倍,而羥自由基清除活性及還原活性也增強數十倍。然而,用美拉德反應來提高泥鰍肉水解產物的抗氧化活性的研究鮮有報道。因此,本研究利用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶對泥鰍蛋白粉進行酶解,加入單種糖或混合糖與酶解產物(干基)以質量比1∶1進行美拉德反應,美拉德反應產生的香味物質還可掩蓋泥鰍腥味。在此基礎上,本研究以產物對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH·的清除率評價其抗氧化性能,通過正交實驗研究最適的反應pH、溫度和時間。以期獲得對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH·的清除率均較好的泥鰍蛋白酶解產物,為后期篩選酶與糖的種類,混合糖比例等提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

泥鰍粉飼養周期為60 d的市售臺灣扁鰍去頭去皮去骨,冷凍干燥[20-21]制得,舟山市新城區老碶菜場;風味蛋白酶(酶活力≥20 IU/mg)、木瓜蛋白酶(酶活力≥1000 IU/mg)上海金穗生物科技有限公司;無水葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、木糖國藥集團化學試劑有限公司;鄰二氮菲、PBS、硫酸亞鐵、雙氧水、鄰苯三酚、Tris-HCl、DPPH、無水乙醇均為國產分析純。

DS-1型高速組織搗碎機、HWS-12型電熱恒溫水浴鍋賽多利斯科學儀器有限公司;85-2型恒溫磁力攪拌器、A-1502型紫外分光光度計上海精密科學儀器有限公司;PB-10酸度計上?？茖W儀器有限公司;IKAT18基本型漩渦振蕩器德國IKA公司。

1.2　實驗方法

1.2.1泥鰍蛋白酶解物制備泥鰍蛋白粉的酶解工藝:在游麗君[9]的研究基礎上做了適當調整。根據每次實驗條件需要,稱取泥鰍蛋白粉0.100 g若干份,每份加入pH6.9的緩沖液50 mL,渦旋振蕩后靜置。加入木瓜蛋白酶與風味蛋白酶質量比為3∶25混合的復合酶5.5 mg。在55 ℃水浴條件下,酶解4.5 h,隨后升溫至100 ℃滅活,取出冷卻后冷凍干燥。

1.2.2美拉德反應條件的篩選采用1.2.1中制得的泥鰍蛋白酶解物,以酶物質量與糖質量比為1∶1進行美拉德反應,冷卻后以3000 r/min離心20 min,過濾取上層清液,即美拉德反應上清液，一部分-18 ℃保存,一部分用于檢測。

1.2.2.1糖的篩選固定反應條件為加熱溫度50 ℃、加熱時間30 min,反應pH為7,加入糖總質量為1.0 g,考察不同糖種類(無水葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、木糖)對產物自由基清除率的影響;選擇清除效果好的木糖、乳糖、蔗糖進行下一步實驗,固定反應條件不變,考察不同糖組合(木糖和乳糖、木糖和蔗糖、乳糖和蔗糖分別以質量比1∶1混勻)對產物自由基清除率的影響;選擇清除效果好的糖組合(木糖和乳糖)進行下一步實驗,固定反應條件不變,考察不同糖配比(木糖和乳糖以質量比1∶1.5、1∶3、1∶4、1.5∶1、3∶1、4∶1混勻)對產物自由基清除率的影響。

1.2.2.2單因素實驗固定反應條件為加熱溫度50 ℃、加熱時間30 min、加入木糖和乳糖以質量比1∶3混勻的糖1.0 g,考察不同反應pH(2、4、6、7、8、10)對自由基清除率的影響;固定反應條件為加熱時間30 min、反應pH為7、加入木糖和乳糖以質量比1∶3混勻的糖1.0 g,考察不同加熱溫度(40、50、60、70、80、90、100 ℃)對自由基清除率的影響;固定反應條件為加熱溫度50 ℃、反應pH為7、加入木糖和乳糖以質量比1∶3混勻的糖1.0 g,考察不同加熱時間(15、30、45、60、90、120 min)對自由基清除率的影響。

1.2.3正交實驗根據前期單因素實驗的結果,以加熱時間、加熱溫度、反應pH為實驗因子,進行三因素三水平L9(34)的正交優化實驗,以羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH自由基清除率為指標,分別篩選出優化組合。各因素的三水平采用1、2、3進行編碼,如表1。

表1　正交實驗設計因素水平和編碼Table 1　Independent variables and their levels used in the orthogonal design

1.2.4抗氧化性能測定

1.2.4.1羥自由基清除率測定采用鄰二氮菲法[22],取0.75 mmol/L鄰二氮菲1.0 mL,pH7.4的PBS 2.0 mL,蒸餾水1.0 mL,混合均勻,加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵1.0 mL,0.12%雙氧水1.0 mL(新鮮配制),振蕩混勻,記作Ap;以1.0 mL蒸餾水代替1.0 mL的0.12%的雙氧水,其余條件同 Ap處理記作Ab;以1.0 mL美拉德反應上清液代替1.0 mL蒸餾水,其余條件同AP處理記作 As。Ap、Ab、As均在 37 ℃水浴鍋中保溫60 min,然后蒸餾水調零,測定536 nm處吸光度,并按照下面公式計算羥自由基清除率[23-24]:

1.2.4.2超氧陰離子自由基清除率的測定取鄰苯三酚0.1 mL并加入Tris-HCl(pH8.2)緩沖溶液5 mL于試管中,加入美拉德反應上清液0.25 mL,迅速混勻,25 ℃水浴保溫15 min后使用1 cm比色皿,以蒸餾水做空白對照,在320 nm處時測吸光度Ai,并測定本底扣除水解自身的干擾,水解液對超氧陰離子自由基清除率按照下面公式計算[25-26]。

式中:A0為試劑空白的吸光度值;Ai為樣液的吸光度值;Aj為樣液本底的吸光度值。

1.2.4.3DPPH自由基清除率的測定稱取適量美拉德反應上清液備用，其中樣品組為1 mL DPPH+1 mL樣品;對照組1為1 mL 95%乙醇+1 mL樣品;對照組2為1 mL蒸餾水+1 mL DPPH;調零組為95%乙醇?；旌暇鶆?避光反應30 min。檢測各組在波長535 nm處的吸光度,依次記為A1、A2、A3,按照下面公式計算清除率[27]。

1.3　數據分析

2　結果與討論

2.1　糖的篩選

2.1.1糖種類的篩選如圖1所示,加糖組的清除率均高于對照組,乳糖組對羥基自由基的清除率高于其他四組為36.96%±3.44%,其次是蔗糖組、木糖組、半乳糖組和無水葡萄糖組;木糖組對超氧陰離子自由基清除率顯著高于其他四組為52.51%±3.13%,其次是蔗糖組、乳糖組、無水葡萄糖組和半乳糖組;蔗糖組的DPPH自由基清除率顯著高于其他四組為63.62%±3.21%,其次是乳糖組、木糖組、半乳糖組、無水葡萄糖組。分別選出對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除效果最好的乳糖、木糖、蔗糖,進行下一步實驗。

圖1　糖種類對抗氧化性能的影響Fig.1　Effect of different sugar on oxidant resistance

2.1.2組合糖的篩選選取木糖、蔗糖、乳糖這三種糖進行兩兩質量比1∶1組合,得到木糖-蔗糖、木糖-乳糖、蔗糖-乳糖三種組合糖。如圖2所示,木糖-乳糖組對羥基自由基的清除率為42.68%±1.26%,高于蔗糖-乳糖組,低于木糖-蔗糖組;對超氧陰離子自由基清除率為60.85%±2.56%,高于木糖-蔗糖組和蔗糖-乳糖組;對DPPH自由基清除率為66.13%±3.05%,高于木糖-蔗糖組和蔗糖-乳糖組。綜合考慮,選取木糖-乳糖組進行下一步實驗。

圖2　糖組合對抗氧化性能的影響Fig.2　Effect of compound sugar on oxidant resistance

2.1.3糖配比的篩選如圖3所示,糖配比1∶3組對超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率均高于其它五組,分別為58.27%±2.19%和68.09%±1.33%;對羥基自由基效果最好的是糖配比1∶4組,清除率為47.41%±1.03%,糖配比1∶3組對羥基自由基的清除率為47.13%±2.24%。綜合考慮選取木糖和乳糖以質量比為1∶3的比例混合而成的復合糖進行下一步實驗。

圖3　糖比例對抗氧化性能的影響Fig.3　Effect of sugar ratio on oxidant resistance

2.2　單因素實驗

2.2.1pH的篩選圖4所示在不同pH條件下反應產物對自由基的清除效果不同,pH=7時,羥基自由基清除率最大達到47.40%±2.01%;pH=8時超氧陰離子自由基清除率達到最佳,為62.95%±2.05%;pH=6時,DPPH自由基清除率達到最佳為75.36%±3.92%。實驗數據表明,pH為6、7、8時三種自由基清除率在同組實驗中均高于pH為2、4、10時的清除率。另外,本研究發現當反應體系在酸性范圍時,MRPs對DPPH自由基的清除能力隨著pH的增大而增強;當反應體系在堿性范圍時,MRPs對DPPH自由基的清除能力隨著pH的增大而降低,羥自由基清除率與超氧陰離子清除率也呈此規律,即MRPs表現出的抗氧化能力隨著pH的上升呈現先上升后下降的趨勢。這與朱敏等人的研究結果一致[28]。因此,選取pH6、7、8進行正交實驗。

圖4　pH對抗氧化性能的影響Fig.4　Effect of pH on oxidant resistance

2.2.2反應溫度的篩選如圖5所示,MRPs在不同反應溫度下對自由基清除效果不同。40～90 ℃之間,MRPs對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率均成上升趨勢,這表明隨反應溫度增加,反應產物的抗氧化能力顯著提升;90 ℃時,三種自由基清除率達到最高，分別為54.36%±2.58%、68.84%±3.20%、78.13%±3.10%;反應溫度繼續升至100 ℃時清除率稍有下降,但清除效果較好,可能是因為溫度過高引起抗氧化活性降低。本研究發現,當反應溫度達到90 ℃時抗氧化能力達到最高值。由此可見,常壓下高溫有利于泥鰍肉水解產物與糖進行美拉德反應。趙晶等采用酪蛋白與還原糖在不同溫度下發生美拉德反應[29],也發現在一定范圍內,溫度越高反應產物的抗氧化能力越高。100 ℃的清除率稍低于90 ℃,仍高于40～80 ℃,故選取加熱溫度80、90、100 ℃作為美拉德反應的條件,進行下一步正交實驗。

圖5　溫度對抗氧化性能的影響Fig.5　Effect of temperature on oxidant resistance

2.2.3反應時間的篩選由圖6可知,進行美拉德反應的實驗組,自由基清除率均高于對照組。0～15 min自由基清除率迅速上升,在反應初期MRPs表現出較高的清除力,這可能與泥鰍肌肉酶解液本身存在這樣的能力有關;隨著反應時間的增加,15～45 min泥鰍肌肉水解產物的抗氧化能力緩慢提升,MRPs對自由基清除率的增加逐漸趨于平緩,這一研究結果與Soottawat Benjakul等的結果相類似[30];當反應時間達到45 min時,抗氧化能力最強,羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除率分別為43.29%±3.40%、65.43%±4.22%、70.64%±2.08%;45 min后,基本保持不變,甚至出現負增長,清除率略小于45 min,其原因可能是泥鰍肌肉水解產物中的游離氨基酸或者肽類物質不斷與還原糖發生美拉德反應,產生的還原性物質不斷積累,因而表現出一段時間內抗氧化能力逐漸提升,然而隨著加熱時間的增加,部分還原性物質分解[31],因此抗氧化能力有所減小。綜合效率和成本考慮,選擇30、45、60 min三個時間,進行正交實驗。

圖6　時間對抗氧化性能的影響Fig.6　Effect of time on oxidant resistance

2.3　正交實驗

實驗結果如表2所示,三個因素對羥基自由基清除率的影響的主次順序為C>B>A,反應pH對羥基自由基清除率的影響排第一,加熱時間、加熱溫度次之。最佳組合為A1B2C2,即加熱溫度80 ℃,加熱時間45 min,反應pH為7,對羥基自由基的清除率效果最佳為58.86%。三個因素對超氧陰離子自由基清除率的影響的主次順序為A>C>B,加熱溫度對超氧陰離子自由基清除率的影響排第一,反應pH、加熱時間次之。最佳組合為A3B2C1即加熱溫度100 ℃,加熱時間45 min,反應pH為6,對超氧陰離子自由基的清除率效果最佳為70.63%。三個因素對DPPH自由基清除率的影響的主次順序為A>C>B,加熱溫度對DPPH自由基清除率的影響排第一,反應pH、加熱時間次之,與影響超氧陰離子自由基清除率的主次順序相同。由表3可知，經驗證實驗最佳組合為A2B3C3,即加熱溫度90 ℃,加熱時間60 min,反應pH為8,對DPPH自由基的清除率效果最佳為85.40%。

表2　正交實驗設計及自由基清除率Table 2　Orthogonal design and free radical scavenging rate

表3　DPPH·清除率驗證實驗Table 3　DPPH-clearance rate verification test

3　結論

本研究結果表明,加入單種糖進行反應的產物抗氧化性能低于混合糖,其中又以木糖和乳糖質量比1∶3混合效果最佳,對羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率分別為47.13%±2.24%、58.27%±2.19%、68.09%±1.33%。從正交分析的結果來看,反應溫度對超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率的影響大于時間及pH的影響，這表明反應溫度對美拉德反應產物抗氧化性影響較大,控制好美拉德反應的加熱溫度非常重要。在pH7、80 ℃下反應45 min的產物對羥基自由基的清除率效果最佳，為58.86%；在pH6、100 ℃下反應45 min的產物對超氧陰離子自由基的清除率最佳，為70.63%；在pH8，溫度90 ℃下反應60 min的產物對DPPH自由基的清除率最佳，為85.40%，結果表明美拉德反應條件的優化對泥鰍蛋白酶解產物抗氧化性能提升效果明顯。

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