響應面法優化無核白葡萄多酚氧化酶的提取工藝

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(1.石河子大學食品學院,新疆石河子 832000; 2.新疆農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所,新疆烏魯木齊 830091; 3.農業部農產品質量安全風險評估實驗室(烏魯木齊),新疆烏魯木齊 830091; 4.新疆農產品質量安全實驗室,新疆烏魯木齊 830091; 5.新疆農業大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052)

無核白葡萄又名“無籽露”,中晚熟品種,在世界分布極廣。無核白葡萄不僅含有許多糖分,還含有易于人體吸收的鐵、鈣、磷、鉀、鎂等礦物質和多種維生素[1]。無核白葡萄多以制干為主,鮮食為輔,而干制過程中的褐變問題不僅有損產品特色,也嚴重影響了其商品價值和經濟效益,褐變一直是困擾葡萄干制業發展的關鍵因素[2]。有研究表明,多酚氧化酶催化的酶促褐變是導致無核白葡萄干制褐變的主要原因[3-4]。

多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是以氧為受氫體的一種氧化酶,它能催化酚類化合物氧化成相應的醌類化合物[5]。無核白葡萄富含酚類物質,在PPO酶的催化下生成鄰醌,鄰醌具有很高的活性,極易與蛋白質氨基酸等發生聚合,最后生成黑色素,造成色澤的劣變及營養損失[6]。

提取多酚氧化酶的常見方法有丙酮提取法、緩沖溶液浸提法、超聲波輔助浸提法。粟銀等[7]在研究新疆馬乳葡萄多酚氧化酶性質采用丙酮法提取新疆馬乳葡萄中的PPO。Zhou等[8]在研究通過水楊酸競爭性抑制多酚氧化酶抑制中國鮮切板栗的酶促褐變中采用緩沖溶液浸提法提取板栗中PPO。明婷等[9]在不同溫度對新鮮蓮子根褐變率和苯酚的影響中采用緩沖溶液浸提法提取蓮子根中的PPO。李全文[10]在桑葉多酚氧化酶的提取、純化、及其固定化研究中采用超聲波輔助浸提法提取桑葉中PPO。另外,無核白葡萄多酚氧化酶提取方法也很多,林向東等[11]在無核白葡萄多酚氧化酶特性研究中采用了丙酮提取法提取PPO。吳繼紅等[12]在新疆無核白葡萄多酚氧化酶特性研究中采用了緩沖溶液法提取PPO。但關于無核白葡萄多酚氧化酶提取條件優化的報道卻極少見。

因此本實驗采用常見的3種方法提取無核白葡萄中多酚氧化酶,篩選出適合無核白葡萄多酚氧化酶提取方法,在此基礎上對提取方法的提取條件進行優化,以期為無核白葡萄多酚氧化酶純化、性質、結構研究提供基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

無核白葡萄果實可溶性固形物含量為18%～20%，含水量為79.44%±0.13%,果實直徑為(12.1±0.2) mm,長度為19.3 mm,新疆烏魯木齊市北園春市場;丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、鄰苯二酚均為分析純。

FA2104N電子天平上海民橋精密科學儀器有限公司;TU-1810紫外-可見分光光度計北京普析通用儀器有限責任公司;SK2200H超聲波清洗器上?？茖С晝x器有限公司;TGL-16G高速冷凍離心機上海安亭科學儀器廠;雷磁PHSJ-3F pH計上海權浩儀表有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1無核白葡萄PPO提取方法確定通過比較丙酮提取法、緩沖溶液浸提法和超聲波輔助浸提法這三種方法提取PPO的酶活、酶蛋白含量的多少來確定無核白葡萄PPO的提取方法。

1.2.1.1丙酮提取法準確稱取10.0 g鮮無核白葡萄,加入10 mL 4 ℃冷丙酮,用均質機將鮮無核白葡萄研磨成勻漿,抽濾,濾餅再次用冷丙酮抽濾,在室溫下干燥即得無核白葡萄多酚氧化酶丙酮粉。將丙酮粉溶于0.2 mol/L,pH6.8,4 ℃預冷磷酸緩沖液中在4 ℃冰箱中浸提1.5 h,在4 ℃下,以9000 r/min離心15 min,去除沉淀,取其上清液[11]。重復1次,即為無核白葡萄PPO粗提液。

1.2.1.2緩沖溶液浸提法準確稱取10.0 g鮮無核白葡萄,加入10 mL 0.2 mol/L,pH6.8,4 ℃預冷磷酸緩沖液,用均質機將鮮無核白葡萄研磨成勻漿,在4 ℃冰箱中浸提1.5 h,在4 ℃下,以9000 r/min離心15 min,去除沉淀,取其上清液[12]。重復1次,即為無核白葡萄PPO粗提液。

1.2.1.3超聲波輔助浸提法準確稱取10.0 g鮮無核白葡萄,加入10 mL 0.2 mol/L,pH6.8,4 ℃預冷磷酸緩沖液,用均質機將鮮無核白葡萄研磨成勻漿,在100 W功率4 ℃條件下超聲30 min,超聲儀內放置冰塊使溫度保持在4 ℃左右,再在4 ℃冰箱中浸提1 h。在4 ℃下,以9000 r/min離心15 min,去除沉淀,取其上清液[10]。重復1次,即為無核白葡萄PPO粗提液。

1.2.1.4蛋白質含量測定采用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[13],用牛血白蛋白做蛋白質標準曲線,標準曲線方程為y=0.003x+0.418,R2=0.994(式中y為吸光度,x為蛋白質質量濃度,μg/mL)。根據標準曲線方程計算蛋白質含量。

1.2.1.5酶活力與比活力測定在試管中加入3 mL 0.2 mol/L pH6.8磷酸緩沖液,1 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚溶液,1 mL PPO粗提液,混合均勻,在420 nm吸光度下測定其4 min內的吸光度值,每隔30 s測一次吸光度值[14]。

式(1)

式中:Vr為加樣緩沖液總體積(mL),Vs為比色體積(mL),W為取樣質量(g)。

酶比活力即為每毫克蛋白質所具有的酶活力數。

式(2)

1.2.2緩沖溶液浸提法提取無核白葡萄PPO單因素實驗

1.2.2.1料液比對無核白葡萄PPO比活力的影響以浸提時間為2 h,緩沖溶液pH6.0,考察料液比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 (g/mL)時對無核白葡萄PPO比活力的影響。

1.2.2.2提取時間對無核白葡萄PPO比活力的影響以料液比為1∶2 (g/mL),緩沖溶液pH6.0,考察提取時間0、1、2、3、4、5 h時對無核白葡萄PPO比活力的影響。

1.2.2.3緩沖溶液pH對對無核白葡萄PPO比活力的影響以料液比為1∶2 g/mL,浸提時間為3 h時,考察緩沖溶液pH在4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時對無核白葡萄PPO比活力的影響。

1.2.3響應面法優化無核白葡萄PPO提取條件的實驗在單因素實驗基礎上,采用Box-Behnken中心實驗優化設計,分析料液比、提取時間、緩沖液pH對無核白葡萄PPO比活力的影響。響應面設計實驗因素及水平見表1。

表1　響應面實驗水平設計Table 1　Factors and levels in the response surface analysis

1.3　數據處理

所有數據均為3次重復實驗的平均值,表示為平均值±標準差,實驗數據采用Origin8.5軟件作圖,響應面設計利用Design Expert 8.0.6軟件。

2　結果與分析

2.1　無核白葡萄PPO提取方法確定

由表2可知,超聲波輔助浸提法提取出的酶蛋白含量最高,丙酮提取法提取的蛋白含量最低。其原因可能是一方面超聲波加速無核白葡萄組織破碎,細胞內物質流出,使得蛋白質含量增加,另一方面是超聲的過程中超聲空化作用所產生的沖擊波改變酶分子的構象或者是超聲波產生的熱使一部分酶的活力下降[15]。丙酮提取法提取酶活最低,緩沖溶液浸提法提取酶活最高?？赡苁怯袡C試劑在提取過程中會使酶失活,導致酶活降低[9]?？偟膩碚f,緩沖溶液浸提法適合無核白葡萄PPO,所得酶活高,酶蛋白含量高為后續的PPO純化做好鋪墊。

表2　不同提取方法酶活與酶蛋白含量的比較Table 2　Comparison of enzyme activities and enzyme proteins in different extraction methods

注：同列小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

2.2　單因素實驗結果

2.2.1料液比對無核白葡萄PPO比活力的影響由圖1可知,當料液比小于1∶2 mg/mL時，隨著料液比的增加其酶比活力逐漸增加；當料液比大于1∶2 mg/mL時，隨著料液比的增加其酶比活力隨之降低。原因可能是盡管鮮葡萄中水分很高,但料液比過低就無法使無核白葡萄中的PPO溶解于緩沖液中,提取不完全導致PPO酶比活力低,料液比增加,比活力也隨之增加[16]。但當料液比達到一定比例時,PPO酶溶解量不再隨之變化,而提取液量增加,導致PPO酶比活力降低。

圖1　料液比對無核白葡萄PPO比活力的影響Fig.1　Effect of liquid ratio on specific activity of PPO enzyme in seedless white grape

2.2.2浸提時間對無核白葡萄PPO比活力的影響由圖2可知,隨著浸提時間的增長,無核白葡萄PPO比活力也隨之增加。當浸提時間大于3 h時,隨著浸提時間的增長,無核白葡萄PPO比活力隨之降低。剛開始隨著浸提時間的增長,無核白葡萄中更多的PPO溶解于提取液中,使得PPO比活力增加。當浸提時間大于3 h時,隨著浸提時間的延長,由于酶蛋白在溶液中構象不穩定,以及無核白葡萄中酚類物質等流出,均易造成酶活降低[17]。

圖2　浸提時間對無核白葡萄PPO比活力的影響Fig.2　Effects of leaching time on specific activity of PPO enzyme in seedless white grape

2.2.3緩沖液pH對無核白葡萄PPO比活力的影響由圖3可知,當緩沖液pH小于6時，無核白葡萄PPO比活力隨著緩沖液pH的增加而增加,這可能是因為酸性條件會引起酶蛋白的聚集、變性等,造成酶活力降低[18]。當緩沖液pH大于6時,無核白葡萄PPO酶比活力隨著緩沖液pH的增加而降低?？赡芤环矫媸怯捎赑PO酶的輔基是Cu2+,在酸性條件下,酶中的銅離子被解離出來,使酶失去活性。在堿性條件下,Cu2+轉化為Cu(OH)2沉淀,脫離了酶蛋白,也能使酶失去活性;也有可能是由于反應體系的pH對底物的解離使之不能被催化反應[19]。

圖3　緩沖液pH對無核白葡萄PPO比活力的影響Fig.3　Effects of buffer pH on specific activity of PPO enzyme in seedless white grape

表4　響應面法實驗結果方差分析Table 4　Variance analysis of response surface method test results

注：*差異顯著,p<0.05,**差異極顯著,p<0.01。

2.3　響應面實驗

2.3.1回歸模型的建立響應面實驗設計方案如表3所示,每組實驗進行3次平行實驗取其平均值為實驗結果。采用Design-Expert 8.06軟件進行回歸擬合分析,得到無核白葡萄PPO比活力對料液比、浸提時間和緩沖液pH的三元二次回歸方程。Y=376.53-38.85A-9.57B-27.50C-3.23AB-13.59AC+24.31BC-91.18A2-84.00B2-81.74C2。

表3　Box-Behnken實驗設計方案與結果Table 3　Box-Behnken experimental design and results

由表4響應面實驗結果方差分析可以看出,該模型p<0.0001極顯著,失擬項p=0.3627>0.05不顯著。這表明建立的回歸模型成立,可用于無核白葡萄PPO的提取結果的分析與預測。表3的分析結果還表明料液比和緩沖液pH都是影響無核白葡萄PPO提取效果的顯著因素。

2.3.2無核白葡萄PPO提取條件的響應面分析模型中各因素交互作用對無核白葡萄PPO提取的影響,經軟件分析得到交互因素的響應面和等高線圖。

等高線的形狀可反映交互作用的強弱大小,橢圓形表示兩因素交互作用顯著[20]。由圖4可知,當料液比一定時,無核白葡萄PPO比活力隨著緩沖液pH和浸提時間的增加呈現先增加后下降的趨勢。當浸提時間一定時,無核白葡萄PPO比活力隨著緩沖液pH和料液比的增加呈現先增加后下降的趨勢。當緩沖液pH一定時,無核白葡萄PPO比活力隨著浸提時間和料液比的增加呈現先增加后下降的趨勢。浸提時間和緩沖液pH交互作用顯著,料液比和緩沖液pH交互作用不顯著,料液比和浸提時間交互作用不顯著。

根據回歸方程分析計算,無核白葡萄PPO最佳提取工藝條件為料液比1∶1.8 (g/mL),浸提時間2.92 h,緩沖液pH5.84,在此條件下無核白葡萄PPO酶比活力為(383.02±1.6) U/mg。

2.3.3驗證實驗為了檢驗該模型的可行性,在優化提取條件下進行無核白葡萄PPO的提取,根據實際操作,采用料液比為1∶1.8 (g/mL),浸提時間2.9 h,緩沖液pH5.8為最佳提取條件,進行3次實驗,所得無核白葡萄PPO比活力平均值為(378.12±1.3) U/mg,與模型預測值較接近。說明該模型優化無核白葡萄PPO提取條件具有可行性。

圖4　浸提時間、緩沖液pH和料液比交互作用的響應面和等高線圖Fig.4　The response surface and contour map of the interaction between the extraction time,the buffer pH and material ratio

3　結論

在單因素實驗的基礎之上,通過響應面實驗設計確定了無核白葡萄PPO提取的最佳工藝為料液比1∶1.8 (g/mL),浸提時間2.9 h,緩沖液pH5.8。在此條件下,無核白葡萄PPO比活力為(378.12±1.3) U/mg,與模型預測值非常接近。采用響應面法分析,能較為準確的預測實驗結果,以期為無核白葡萄多酚氧化酶純化、性質、結構研究提供基礎。

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