響應面分析法優化堿蓬多糖的脫色工藝

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(1.錦州醫科大學,遼寧錦州 121000; 2.錦州醫科大學附屬第一醫院,遼寧錦州 121000)

堿蓬(Suaedasalsa)又名翅堿蓬,俗稱黃須菜,屬黎科,為一年生葉肉質化真鹽生草本植物,具有極強的生命力,屬于一種典型的鹽生結構[1]。鹽地堿蓬的藥用價值早在《本草綱目拾遺》中就有記載,“鹽蓬,味咸性寒,清熱消積”[2]。常食用堿蓬有助于人體酸堿平衡,近年來一些研究表明,堿蓬提取物具有降低膽固醇、降血脂、抗免疫[3-5]、抗衰老、抗腫瘤等功效,對于保健及功能藥物的開發具有重要意義[6-7]。多糖是一種廣泛存在于動植物、微生物中的大分子物質,它不僅在生物體的生長發育中發揮重要作用,而且具有多方面的生物活性和功能。隨著科學研究的發展,多糖生物功效多樣性的研究正日益成為國內外研究的熱點[8-9]。

由于堿蓬多糖本身結構復雜,利用傳統工藝提取的堿蓬多糖顏色深,純度低,不利于堿蓬多糖成分的進一步分離和產品的開發。為了能夠更好的對堿蓬多糖進行深入研究,需要對其進行脫色處理?；钚蕴课椒?、大孔樹脂法以及雙氧水法等方法是目前最常用的多糖脫色方法。通過查閱文獻發現,已有趙肖通[10]等人利用大孔樹脂法對姬松茸多糖進行脫色,汪榮斌[11]等人利用雙氧水法對青錢柳葉多糖進行脫色,但大孔樹脂法操作較復雜,且樹脂價格較貴,樣品處理量有限,不利于大規模應用,雙氧水是強氧化劑,容易破壞堿蓬多糖的結構,影響其活性[12-14]。與前兩種方法相比,活性炭是最常用的吸附劑,研究發現,活性炭可吸附水解液中相對分子質量為500和1000以內的色素物質,并且可以吸附溶液中的某些雜質,從而達到分離提純的目的[15]。目前,已有單曉菊[16]、吳光杰[12]等人利用活性炭分別對苦豆子多糖、馬齒莧多糖進行脫色。而Box-Behnken實驗設計作為一種基于統計技術的優化方法,具有預測性好,便于觀察,精密度高等優點[10]。

目前,對堿蓬多糖的分離純化已見報道,但對堿蓬多糖脫色工藝的研究未見報道。因此本文通過利用活性炭對堿蓬多糖進行脫色處理,在單因素實驗的基礎上,利用Box-Behnken實驗設計對堿蓬多糖脫色工藝條件進行優化。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

堿蓬遼寧省錦州市沿海灘涂濕地,經錦州醫科大學附屬第一醫院主任藥師郭斌鑒定為堿蓬屬堿蓬草;活性炭天津市瑞金特化學品有限公司,批號:20150823;葡萄糖中國食品藥品檢定研究院,批號:110732-201406;95%乙醇、苯酚和濃硫酸等試劑均為分析純。

UV-2550型紫外分光光度計日本島津;LD4-2A(Ⅱ)離心機北京京力公司;真空干燥箱上海一恒科技儀器有限公司;BP 211D型電子分析天平德國Sartorius公司;PHSJ-4A實驗室pH計上海精密科學儀器有限公司;恒溫水浴鍋上海騰方儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1堿蓬多糖的制備取堿蓬的干燥葉300 g粉碎后,過20目篩,得堿蓬粗粉。稱取堿蓬粗粉以80%乙醇回流脫脂2次,每次2 h。提取完畢,過濾,殘渣置于烘箱內烘干。殘渣加10倍量水于80 ℃水浴鍋中加熱回流提取2次,每次3 h[6]。浸提后抽濾,離心(3000 r/min,15 min),取上清液濃縮,按Sevag法脫蛋白后,加3倍量的90%乙醇過夜沉淀,離心(2500 r/min,10 min),冷凍干燥24 h,即得堿蓬粗多糖。

1.2.2標準曲線的繪制將葡萄糖標準品在105 ℃干燥至恒重,精密稱取20 mg,加水溶解,定容至100 mL容量瓶中,搖勻,配成濃度0.2 mg/mL的葡萄糖標準溶液。分別準確吸取上述葡萄糖標準液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL分別置于具塞試管中,加蒸餾水補至1 mL,再加入6%苯酚溶液0.5 mL,搖勻,然后沿壁加入濃H2SO42.5 mL,立即搖勻。將6只具塞試管室溫放置15 min后,在490 nm處測定各管吸光度,進行三次平行實驗,取平均值。以葡萄糖質量濃度(C)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線。得標準曲線方程:A=1.250C+0.009,r=0.9991。

1.2.3單因素實驗取1.2.1項下堿蓬多糖溶液,脫色條件為:固定反應條件為脫色溫度45 ℃、脫色時間30 min、pH2,考察不同活性炭用量(1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%)對多糖脫色率的影響;固定反應條件為活性炭用量2.5%、脫色時間30 min、pH2,考察不同脫色溫度(35、40、45、50、55、60 ℃)對多糖脫色率的影響;固定反應條件為活性炭用量2.5%、脫色溫度45 ℃、pH2,考察不同脫色時間(20、25、30、35、40、45、50、55 min)對多糖脫色率的影響;固定反應條件為活性炭用量2.5%、脫色溫度45 ℃、脫色時間30 min,考察不同pH(1、2、4、6、8、10)對多糖脫色率的影響。以上每組單因素實驗均進行3次重復實驗取平均值,以考察各因素變量對堿蓬多糖溶液脫色率的影響。

1.2.4Box-Benhnken中心組合實驗設計在單因素實驗的基礎上,采用中心組合實驗Box-Behnken設計方案,選取活性炭用量、脫色溫度、脫色時間、pH四個因素,以堿蓬多糖溶液脫色率為響應值,設計四因素三水平的響應面分析實驗,各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼,如表1。

表1　響應曲面實驗因素水平表Table 1　Factors and their levels used in the response surface design

1.2.5堿蓬多糖脫色率的測定準確稱取1.2.1項下堿蓬多糖5 g,加水溶解并定容至500 mL,得堿蓬多糖溶液,于450 nm[17]處測定堿蓬多糖溶液脫色前后的吸光度。計算公式為:

脫色率(%)=(A脫色前-A脫色后)/A脫色前×100

1.2.6堿蓬多糖糖損率的測定利用苯酚-硫酸法[18]測定堿蓬多糖溶液脫色前后的多糖含量。計算公式為:

糖損率(%)=(C脫色前-C脫色后)/C脫色前×100

1.3　數據處理

2　結果與討論

2.1　單因素實驗結果

2.1.1活性炭用量對脫色效果的影響由圖1可知,多糖的脫色率呈先增加后降低的趨勢,當活性炭加入量為3%時,多糖的脫色率增加幅度較大,當活性炭加入量超過3%時,多糖脫色率明顯下降,糖損率隨著活性炭用量的增加隨之增大,原因可能是由于活性炭加入量過大,過量的活性炭可能會對多糖產生少量吸附作用,并且會使脫碳不完全,反而影響多糖的脫色率,綜上所述,實驗選擇活性炭的添加量為3%。

圖1　活性炭用量對脫色效果的影響Fig.1　Influence of amount of activated carbon addition on decolorization effect

圖2　脫色溫度對脫色效果的影響Fig.2　Influence of decolorization temperature on decolorization effect

2.1.2脫色溫度對脫色效果的影響由圖2可知,在35～50 ℃范圍內,多糖的脫色率隨著溫度的升高上升較快,50 ℃時脫色效果最好,當溫度繼續升高時,脫色率反而下降,糖損率隨著溫度的升高而升高。原因可能是由于溫度升高,多糖溶液的黏度降低,色素分子運動速度加快,進而加速吸附作用,當達到平衡點時,溫度過高反而造成了色素的解析[19]。因此50 ℃是比較適宜的脫色溫度。

2.1.3脫色時間對脫色效果的影響由圖3可知,在20～40 min內,隨著時間的延長,多糖的脫色率上升較快,糖損率上升緩慢,當脫色時間超過40 min時,多糖的脫色率緩慢降低,糖損率增長迅速,可能是由于活性炭吸附已經達到一定程度,吸附與解吸附處于相對平衡,繼續延長脫色時間,反而會引起部分被吸附色素的解析,綜合考慮,脫色時間應為40 min。

圖3　脫色時間對脫色效果的影響Fig.3　Influence of decolorization time on decolorization effect

2.1.4pH對脫色效果的影響由圖4可知,隨著pH的增加,多糖的脫色率呈先增高后降低的趨勢,在酸性范圍內多糖的脫色率較高,說明活性炭在偏酸性條件下脫色效果好,但繼續降低pH,后期所需要的堿液以指數倍數的增加,增加了成本,同時會產生大量的鹽,為后續脫鹽帶來不便[15],并且糖損率也隨著pH的增大而增大,因此,為獲得較好的脫色效果,選擇pH4為較適宜。

圖4　初始pH對脫色效果的影響Fig.4　Influence of decolorization pH on decolorization effect

2.2　響應面實驗設計及結果

2.2.1響應面實驗設計結果由Design-Expert 8.0.6統計分析軟件的實驗設計功能可知,以堿蓬多糖脫色率為響應值,以活性炭添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時間(C)、pH(D)為自變量,建立四因素三水平的中心組合設計包括29個實驗方案,每個實驗方案進行3次平行實驗取平均值,具體的實驗方案及實驗結果如表2所示。

表2　響應面實驗設計及結果Table 2　RSM design and corresponding experimental data

表3　回歸模型及方差分析Table 3　The variance analysis of regression equation

注：**p<0.01為極顯著;*p<0.05為顯著。

2.2.2模型的建立及其顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0.6軟件,通過回歸分析對表2中實驗數據進行回歸擬合,得到活性炭添加量(A)、脫色溫度(B)、脫色時間(C)、pH(D)四個因素對堿蓬多糖脫色率(Y)的二次回歸方程為:Y=64.30+0.68A+2.30B+0.99C+0.57D+1.27AD-1.04BC+1.13CD-1.90A2-1.79B2-1.03C2-1.44D2

圖5　活性炭用量與pH交互作用對脫色率的響應面分析Fig.5　RSM analysis for interactive effects of amount of activated carbon addition and pH

2.2.3響應面圖分析響應面分析法是利用合理的實驗設計,通過對響應面等高線的分析尋求最優工藝參數,并且可以通過對3D曲面圖的分析,直觀地評價各因素間的交互作用[20-21]。在響應面圖中,曲面的傾斜度表明該實驗因素對響應值的影響程度,傾斜度越高,即坡度越陡峭,表明該實驗因素對響應值的影響越顯著。響應面等高線圖可以直觀地反映出兩個因素間交互效應的強弱,等高線的形狀越接近橢圓形,表示兩個因素交互效應越強,而圓形則反之[22]。如圖5～7所示,各圖響應曲面坡度較陡峭,說明AD、BC和CD之間交互作用較強。

圖6　脫色溫度與脫色時間交互作用對脫色率的響應面分析Fig.6　RSM analysis for interactive effects of decolorization temperature and decolorization time

圖7　脫色時間與pH交互作用對脫色率的響應面分析Fig.7　RSM analysis for interactive effects of decolorization time and pH

圖5表示固定脫色溫度和脫色時間為零水平,活性炭用量和pH對多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用?；钚蕴坑昧枯^低時,脫色率隨pH增加呈先上升后下降的趨勢,活性炭用量較高時,脫色率隨溫度增加先上升后下降;固定pH不變時,多糖脫色率隨活性炭用量增加呈先上升后下降的趨勢。通過圖5可以看出,活性炭用量上升的幅度較pH稍陡峭,說明活性炭用量對多糖脫色率的影響較pH稍大。

圖6表示固定活性炭用量和pH為零水平,脫色溫度和脫色時間對多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。由該圖可知,脫色溫度和脫色時間對多糖脫色率的影響是明顯的,因為響應曲面坡度陡峭,等高線圖接近圓形,同時也說明它們的交互作用并不明顯。多糖脫色率隨脫色溫度和脫色時間的增加,先上升后緩慢下降,脫色溫度的上升幅度明顯比脫色時間的上升幅度陡峭,說明脫色溫度對多糖脫色率的影響較大。

圖7表示固定活性炭用量和脫色溫度為零水平,脫色時間和pH對多糖脫色率的影響和兩者之間的交互作用。脫色時間和pH對脫色率的影響都是明顯的,因為曲面比較陡峭,等高線圖是橢圓形,所以證明它們的交互作用也是明顯的。固定pH不變時,多糖脫色率隨脫色時間的增加呈先上升后下降的趨勢。綜合圖7分析可知,脫色時間上升的幅度較pH稍陡峭,說明脫色時間對多糖脫色率的影響較大。

2.2.4驗證實驗本實驗以堿蓬多糖脫色率為最終考察指標,根據Design-Expert 8.0.6軟件對所得回歸方程的最優預測值求解,可得活性炭對堿蓬多糖脫色的最佳工藝條件為:活性炭用量3.25%,脫色溫度52.72 ℃,脫色時間43.18 min,pH5.39,活性炭脫色率的理論預測值為68.52%?？紤]實際條件,調整為活性炭用量3.3%,脫色溫度53 ℃,脫色時間43 min,pH5.4。在上述最優條件下進行重復3次平行實驗,驗證實驗所得平均脫色率為65.38%,RSD為1.74%。結果表明,經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值相吻合,證明本實驗建立的二次多項回歸方程模型能準確預測各因素與效應面之間的關系。

3　結論

多糖溶液中色素成分大部分為天然產物中已存在的物質,對多糖溶液進行脫色有利于提高多糖的純度,優良的脫色劑應具有較理想的脫色效果、較低糖損率,同時又容易在多糖中清除,但是要保證脫色前后多糖的結構不發生改變?；钚蕴繛楹谏嗫最w粒,無臭、無味、無毒,具有孔隙結構發達、比表面積大和吸附能力強的特點,活性炭對水溶性色素具有穩定可靠地脫色效果[12],因此常常被用來做吸附劑。

本實驗利用活性炭對堿蓬多糖溶液進行脫色處理,降低了色素含量,在單因素實驗基礎上,采用Box-Behnken響應面實驗設計,根據Design-Expert 8.0.6軟件進行分析,對堿蓬多糖的脫色工藝進行優化,建立了多糖脫色率的回歸模型,由該模型優化的堿蓬多糖脫色的最佳工藝條件為:活性炭添加量3.3%,脫色溫度53 ℃,脫色時間43 min,pH5.4。此條件下,堿蓬多糖的平均脫色率為65.38%,與模型預測結果相近,表明該響應面法優化的工藝條件具有實用價值,有利于堿蓬多糖的進一步研究和產品的開發。

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