響應面優化串葉松香草總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性研究

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(吉林農業大學動物科學技術學院,吉林長春 130118)

串葉松香草(SilphiumperfolialumL.),菊科多年生宿根草本植物,又名法國香檳草,別名松香草菊花草,英文名為cup plant。串葉松香草喜溫暖濕潤氣候,是多年生越冬性植物,株高1.5～2.5 m,6月下旬至8月中旬進入花期,花為頭狀花序,邊緣由舌形花數十朵組成,花盤直徑2～2.5 cm,花期較長,含有豐富黃酮類化合物。黃酮屬酚性化合物,是一類植物次生代謝產物,具有抗氧化、防止血管增生、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂[1-3]等多種生物活性,至今已分離鑒定出4000多種[4],如番石榴葉黃酮可以作為植物油脂很好的天然抗氧化劑[5]。黃酮類化合物具有很好的藥理及保健作用[6-10],在化妝品領域也具有非常好的應用前景[11]。充分開發利用串葉松香草中總黃酮,不但能夠研發相關功能性食品,還可以開發生物黃酮新資源,延伸串葉松香草產業鏈,大大提高其產業經濟效益。

目前我國對串葉松香草的研究還處于起步階段,主要集中于引種適應性及栽培技術研究,遺傳育種[12],葉蛋白的開發和利用[13]、營養成分鑒定[14],天然產物提取及其活性研究[15]及作為優質飼草飼喂家畜方法等方面。其中對利用響應曲面法(response surface methodology,RSM)是否能有效地提高串葉松香草葉中的總黃酮提取率及其抗氧化能力的研究還沒有詳細的實驗數據作為理論支持。

植物黃酮的提取方法包括醇提法、回流提取法、超聲提取、微波提取和超臨界流體萃取法等[16]。本文使用乙醇浸提法提取串葉松香草中的總黃酮,操作簡便成本低廉,再利用響應面法對串葉松香草中總黃酮提取工藝進行優化,以期獲得更高的提取率,為串葉松香草畜牧、食品、醫藥、旅游觀光等領域的應用研究提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

串葉松香草樣品吉林農業大學牧草種植園區；蘆丁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、抗壞血酸、過硫酸鉀等均為化學分析純。

LFP-1000A型高速多功能粉碎機上海楚定分析儀器有限公司;752型紫外光分光光度計上?，F科分光儀器有限公司;101-3AB型電熱鼓風干燥箱天津泰斯特儀器有限公司;AB204-L型分析天平上海詠繹儀器儀表有限公司;DK-8D型電熱恒溫三孔水槽上海龍躍儀器設備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1串葉松香草樣品的制備采集開花期串葉松香草，留茬10 cm，將余上部分用蒸餾水洗凈置于55 ℃烘箱烘干，完全干燥后粉碎成粉狀，用40目篩網過濾備用。

1.2.2串葉松香草總黃酮的提取

1.2.2.1串葉松香草總黃酮的提取稱取串葉松香草干粉0.5 g置于50 mL離心管中，加入一定濃度乙醇溶液，按照一定液料比混勻，放入水浴鍋中一定溫度的恒溫加熱一定時間提取串葉松香草總黃酮。

1.2.2.2單因素實驗設計提取條件為：固定提取溫度35 ℃，液料比30∶1 mL/g，提取時間90 min，考察不同濃度的乙醇溶液(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對串葉松香草總黃酮提取量的影響；固定提取溫度35 ℃，乙醇濃度60%,提取時間90 min,考察不同液料比(15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1 mL/g)對串葉松香草總黃酮提取量的影響;固定液料比30∶1 mL/g,提取溫度35 ℃,乙醇濃度60%,考察不同提取時間(90、120、150、180、210、240 min)對串葉松香草總黃酮提取量的影響;固定液料比30∶1 mL/g、乙醇濃度60%,提取時間90 min,考察不同提取溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)對總黃酮提取量的影響;固定液料比30∶1 mL/g,提取溫度35 ℃,提取時間90 min,分別考察不同乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%、80%)對串葉松香草總黃酮提取量的影響。

1.2.2.3響應面設計實驗根據單因素實驗結果和Box-Behnken設計原理來選取液料比、提取時間、提取溫度、乙醇濃度4個因素為自變量,串葉松香草總黃酮提取量為響應值進行4因素3水平響應面設計實驗。因素水平表見表1。

表1　響應曲面實驗設計因素水平表Table 1　Factors and levels in the response surface design

1.2.3總黃酮提取量測定參照尚紅梅[17]方法進行,略作修改。標準曲線的繪制:精密稱取蘆丁標準品0.025 g,用75%乙醇溶解并定容至50 mL,制備質量濃度為0.5 mg/mL的標準溶液。精確量取上述標準液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于10 mL刻度試管中,加無水乙醇至5 mL,搖勻,加入質量濃度為50 mg/mL的NaNO2溶液0.3 mL,搖勻放置6 min,再加入質量濃度為100 mg/mL的Al(NO3)3溶液0.3 mL,搖勻放置6 min,最后加1 mol/L的NaOH溶液4 mL,用無水乙醇補至刻度,搖勻放置10 min后,以無水乙醇為空白,在510 nm波長處測定吸光度,建立標準曲線,得線性回歸方程為:y=1.0776x-0.0086(R2=0.9949),式中,x為蘆丁溶液質量濃度(mg/mL),y為A510 nm。

串葉松香草總黃酮提取量的測定:吸取提取液1 mL,按標準曲線步驟反應后,測定吸光度,結果以串葉松香草中含有相當于蘆丁的毫克數表示,單位為mg/g。

式中:y為標準曲線計算出的質量濃度(mg/mL);v為提取液的總體積mL;m為串葉松香草粉末質量g。

1.2.4抗氧化活性實驗

1.2.4.1DPPH自由基清除活性的測定1 mL DPPH溶液(0.10 mmol/L無水乙醇溶液,現用現配),加入3 mL系列濃度的總黃酮溶液,混勻。室溫下在暗處反應30 min。用無水乙醇做空白對照,在517 nm下測定吸光度?？箟难嶙麝栃詫φ誟18]。

式中:A0:用蒸餾水代替總黃酮提取液樣品按照上述方法測定吸光度;A1:按照上述方法測定總黃酮提取液樣品吸光度;A2:用無水乙醇代替DPPH溶液按照上述方法測定吸光度。

1.2.4.2ABTS+自由基清除能力測定ABTS溶液的配制:將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液和1 mL 5 mmol/L過硫酸鉀混合,在室溫,避光條件下反應12 h,得到ABTS儲備液。使用時用蒸餾水稀釋成工作液,使其在室溫下,734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。3 mL ABTS工作液與0.75 mL同濃度的串葉松香草溶液,室溫反應15 min。用蒸餾水作空白對照,在734 nm下測定吸光度?？箟难嶙麝栃詫φ誟19-20]。

式中:A0:用蒸餾水代替總黃酮提取液樣品按照上述方法測定吸光度;A1:按照上述方法測定總黃酮提取液樣品吸光度;A2:用蒸餾水代替ABTS工作液按照上述方法測定吸光度。

1.2.4.3還原力采用普魯士蘭法測定還原力[21-22]。1.5 mL系列濃度的多糖溶液加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.6)和1.5 mL鐵氯化鉀溶液(10 g/L),混合物在50 ℃條件下水浴20 min。冷卻后加入1.5 mL三氯乙酸溶液(100 g/L),混合物于3000 r/min離心10 min,取該混合物的上清液1.5 mL,加入1.5 mL的去離子水和0.3 mL氯化鐵(1 g/L)溶液,反應10 min后,在700 nm波長處測吸光度,以蒸餾水為空白對照?？箟难釣殛栃詫φ?。

1.3統計分析

實驗數據以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用Microsoft Office Excel 2010、SPSS 19.0、Design-Expert V8.0.6數據分析工具進行處理,并用Duncan多重比較法檢驗各處理之間的差異顯著性,p<0.05表示差異顯著。

2　結果與分析

2.1單因素實驗

2.1.1液料比對串葉松香草總黃酮提取量的影響液料比對串葉松香草總黃酮提取量有顯著影響(見圖1)。隨著液料比例的增加,總黃酮提取量先緩慢增大后呈減小趨勢,在液料比小于30∶1 mL/g時,增加溶劑用量可增大溶劑對總黃酮化合物的絕對溶解能力,當液料比為30·1 mL/g時，總黃酮提取量最多為36.30 mg/g,顯著高于其它液料比的提取量(p<0.05)。當液料比大于30·1 mL/g時，隨著液料比增加提取的總黃酮提取量下降,可能是由于溶劑溶解的碳水化合物、葉綠素等物增多,這些物質有的可與類黃酮結合生成沉淀或吸附黃酮化合物,而減少串葉松香草總黃酮浸出率[23]。因此,將液料比確定在25∶1～35∶1 (mL/g)之間進行后續響應面優化實驗。

2.3 由此畫產生出了對景寫生這一藝術理念的解讀式悟讀，我覺得可以這樣來理解了，畫山水畫可以在寫生基礎上，憑自己主觀的意圖、構圖需要，使得景物變化成為適合自我需要的元素加以合理利用，這就是“景觀合成法”。這種藝術手法可以說是貫穿于石濤此后的漫長的藝術生涯之中，在其三十年之后所作的《黃山圖卷》中也十分熟練的應用這一手法，尤如凌空采珠將黃山諸峰置入自己的畫面中任意擺布，但不失掉黃山實景的印象。景觀合成法是手段，傳山川之神乃為目的。繪畫藝術不僅可以反映大自然美的一面，也更能表現出它的純粹之美，在自然中尋找繪畫語言，在繪畫中尋找自然之美。用藝術的語言來更好地詮釋這自然的靈魂之美。

圖1　液料比對提取串葉松香草總黃酮提取量的影響Fig.1　Effect of material-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from cup plant注:不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖4同。

2.1.2提取溫度對串葉松香草總黃酮提取量的影響根據圖2可知,溫度對串葉松香草總黃酮的提取效果影響較大,提取總黃酮提取量隨提取溫度的升高而升高,在提取溫度40 ℃時獲得總黃酮提取量最高,與其他各溫度差異顯著(p<0.05),提取的總黃酮提取量達到最高點為38.64 mg/g。隨后當溫度繼續升高時,總黃酮提取量呈下降趨勢,這可能是由于溫度過高,串葉松香草中總黃酮的熱不穩定性成分或揮發性成分被破壞,或揮發損失,使得提取量有所下降[24]。將提取溫度的范圍確定在35～45 ℃,進行后續響應面優化實驗。

圖2　提取溫度對提取串葉松香草總黃酮提取量的影響 Fig.2　Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from cup plant

2.1.3提取時間對串葉松香草總黃酮提取量的影響根據圖3可知,隨著時間的增加串葉松香草總黃酮含量持續上升,在浸提時間150、180 min時提取的總黃酮含量明顯高于其他時間段,120 min時串葉松香草總黃酮提取量與其不呈現明顯差異(p>0.05),說明150 min和180 min時串葉松香草中的總黃酮在此時段能最多溶于乙醇溶劑中。繼續增加時間總黃酮的溶出不在增加反而呈迅速降低的趨勢,固選擇篩選120～180 min的提取時間范圍進行后續響應面優化實驗。

圖3　提取時間對提取串葉松香草總黃酮提取量的影響Fig.3　Effect of extraction time on the extraction yield of total flavonoids from cup plant

圖4　乙醇濃度對提取串葉松香草總黃酮提取量的影響Fig.4　Effect of ethanol concentration the extraction yield of total flavonoids from cup plant

2.1.4乙醇濃度對串葉松香草總黃酮提取量的影響由圖4可知,串葉松香草總黃酮提取量從乙醇濃度30%到50%時顯著上升,隨后隨著浸提液乙醇濃度的升高對總黃酮提取量呈下降趨勢,原因可能與總黃酮極性大小有關[25]。當乙醇濃度50%時提取的總黃酮提取量最高,為33.64 mg/g,因此乙醇濃度的最佳條件是50%,我們將乙醇濃度40%～60%納入響應面優化實驗范圍。

表2　響應面分析方案及實驗結果Table 2　Response surface design matrix with experimental andpredicted values of flavonoid content of cup plant

表3　響應面模型方差分析統計表Table 3　ANOVA for response surface quadratic model

注：**：差異極顯著,p<0.01;*：差異顯著,p<0.05。

2.2響應面實驗結果與優化分析

2.2.1響應模型的建立根據表2的結果,運用Design-Expert V8.0.6軟件對表2中的實驗數據進行多元擬合回歸,模型系數顯著性結果和方差分析結果見表2。

總黃酮提取量對液料比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、乙醇濃度(D)的回歸模型方程為:總黃酮提取量(mg/g)=38.54+0.68A-0.39B-0.19C-0.38D-1.64AB-1AC+0.91AD+3.41BC+1.71BD-0.66CD-2.78A2-2.85B2-2.51C2-0.71D2

圖5　兩因素交互作用對串葉松香草總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.5　Response surface of two factors interaction effects on the extraction of total flavonoids from cup plant

從表3可看出,一次項A,交互項AB、AC、AD、BC、BD,二次項A2、B2、C2、D2表現為極顯著;一次項B、C、D,交互項CD為顯著。比較各因素的F值,可得出各因素的實驗結果的影響大小順序A>B>D>C,即提液料比>提取時間>乙醇濃度>提取溫度。

2.2.2響應面分析通過觀察響應面的變化情況和等高線的稀疏程度可直觀地反映液料比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、乙醇濃度(D)之間的交互作用對串葉松香草總黃酮提取量的影響,當等高線呈圓形時表示兩因素交互作用不顯著,而呈橢圓形或馬鞍形時則表示兩因素交互作用顯著[25-26]。

A、B、C、D構成三維空間曲面圖的響應面形象的表達出兩個因素間的交互作用,突出的最高圓心點說明在所選條件范圍內存在極值。結果如圖5(a ～ f)所示,其中圖(a)、圖(b)、圖(c)、圖(d)和圖(e)曲面較陡峭,表明液料比(A)和提取時間(B)、液料比(A)和提取溫度(C)、液料比(A)和乙醇濃度(D)、提取時間(B)和提取溫度(C)、提取時間(B)和乙醇濃度(D)之間的相互作用極顯著,與表3分析結果一致。圖(f)曲面較平緩,表明提取溫度(C)和乙醇濃度(D)之間的相互作用較顯著,與表3分析結果一致。根據圖4(b)看出,當提取時間(B)和乙醇濃度(D)兩因素為零水平時,液料比(A)和提取溫度(C)對串葉松香草總黃酮提取量有較大影響。串葉松香草總黃酮提取量隨液料比(A)和提取溫度(C)的增加呈先上升再下降的趨勢,且液料比(A)上升幅度明顯大于提取溫度(C),說明液料比(A)對串葉松香草總黃酮提取量的影響較大,即液料比(A)和提取溫度(C)呈顯著相關性,與方差分析結果相符。根據圖4(e)可看出,當液料比(A)和提取溫度(C)兩因素為零水平時,串葉松香草總黃酮提取量隨著提取時間(B)和乙醇濃度(D)的陡峭上升再較平緩下降,且提取時間(B)上升的傾斜度顯著大于乙醇濃度(D)的上升傾斜度,因此提取時間(B)對串葉松香草總黃酮提取量比乙醇濃度(D)的影響程度更大,即符合我們的分析結果。

2.2.3最佳條件的確定和回歸模型的驗證通過軟件分析得到提取串葉松香草總黃酮最佳工藝條件為液料比31.19∶1 (mL/g)、提取時間129.29 min、提取溫度37.88 ℃、乙醇濃度41.5%,在此條件下得到的理論提取物中總黃酮提取量為38.947 mg/g。實際實驗操作中稍作調整確定的最佳工藝條件為液料比31∶1 mL/g、提取時間129 min、提取溫度38 ℃乙醇濃度42%。在此條件下進行3次驗證實驗后,得到串葉松香草提取物總黃酮提取量平均值為(38.93±0.012) mg/g,與理論值相差0.04%,而且重復性也很好,說明了此響應面法得到的回歸模型可靠。

2.3抗氧化分析

2.3.1DPPH自由基清除作用由圖6所示,隨著串葉松香草總黃酮質量濃度和抗壞血酸的質量濃度增加,對DPPH自由基的清除率均呈上升趨勢,但串葉松香草中的總黃酮對DPPH自由基清除能力低于抗壞血酸,繼續提高濃度,清除率上升緩慢。當最大質量濃度為1 mg/mL時,串葉松香草總黃酮對DPPH自由基的清除率達73.06%。

圖6　不同總黃酮質量濃度對DPPH自由基的清除作用Fig.6　Scavenging activity of total flavonoids from cup plant at various concentrations against DPPH free radicals

2.3.2ABTS+自由基清除作用由圖7可以看出,隨著串葉松香草總黃酮濃度的增加,ABTS+自由基的清除作用逐漸增強,在0.2 mg/mL時抗壞血酸的清除能力與總黃酮的清除能力相差最大,ABTS+自由基的清除作力為88.66%,明顯高于抗壞血酸。在0.6 mg/mL時兩點重合,ABTS+自由基的清除作用與抗壞血酸的清除作用持平均為100%。

圖7　不同總黃酮質量濃度對ABTS+自由基的清除作用Fig.7　Scavenging activity of total flavonoids from cup plant at various concentrations against ABTS+ free radicals

2.3.3還原力由圖8可以看出在測定的質量濃度范圍內,串葉松香草總黃酮的還原力隨著質量濃度的升高也在不斷增強,在串葉松香草總黃酮質量濃度3～4 mg/mL時還原力增加速度最快,在6 mg/mL時的吸光度為0.188。而抗壞血酸在0.2 mg/mL時吸光值為0.701,還原力遠遠高于串葉松香草總黃酮的還原力,因此串葉松香草總黃酮的還原力較弱。

圖8　不同總黃酮質量濃度的還原力Fig.8　Ferric reducing power of total flavonoids from cup plant at various concentrations

3　結論

3.1采用響應面法優化了乙醇提取串葉松香草總黃酮的工藝,最優提取工藝條件為液料比31∶1 mL/g、提取時間129 min、提取溫度38 ℃、乙醇濃度42%。在此條件下獲得的實際總黃酮提取量達(38.93±0.012) mg/g,與理論值相差0.04%。

3.2串葉松香草中總黃酮對DPPH自由基和ABTS+自由基有較好的清除能力,當濃度為1 mg/mL的串葉松香草中總黃酮對DPPH自由基清除率是73.06%,當濃度為0.6 mg/mL的串葉松香草中總黃酮對ABTS+自由基清除率是100%,同時還具有一定的還原力,因此串葉松香草有較好的抗氧化能力。

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