響應面法優化東北紅松針總黃酮的超聲輔助乙醇提取工藝

　,　,,　,　

(哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076)

紅松(PinuskoraiensisSieb.etZucc.)主要分布于俄羅斯遠東南部、朝鮮半島、日本本州及中國東北部地區,分布數量以中國為首,主要集中于長白山,小興安嶺一帶,屬于天然可再生資源[1]。松針是松樹的針形葉子,松屬植物的副產物之一,含有豐富的黃酮、揮發油、色素、維生素、粗蛋白、萜類等多種成分。具有止咳鎮痛,疏風活血,明目安神,提高免疫力,降三高等作用[2-3]。關于松針國內外研究,主要對松針化學成分進行分析[4],其黃酮物質具有抗氧化和抗腫瘤作用[5],松針提取物可以減輕大鼠胰島素抵抗力[6]。提取物中精油可以提高小鼠記憶力,且具有抑菌作用[7-8]。針葉被廣泛運用在茶飲及乳制品等的制作中[9-10]。高巖等[12]采用乙醇溶液回流法從紅松針中提取黃酮類物質;站英等[13]采用微波輔助乙醇法確定了紅松針總黃酮提取的最佳工藝;文攀等[14]利用超聲波輔助提取紅松籽殼中的總黃酮。以往研究中對東北紅松針黃酮研究較少,本實驗主要針對東北豐富的紅松資源并結合超聲波空穴作用,以優化超聲波輔助乙醇提取總黃酮工藝條件為目的,探索東北紅松針總黃酮的含量,為大批量合理開發利用東北松針資源提供可行性理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紅松松針新鮮松針預處理除雜,室溫下陰干,粉碎后過60目篩儲存在廣口瓶中備用,黑龍江省小興安嶺;蘆丁標準品(純度98%)中國食品藥品鑒定研究院;無水乙醇(分析純)、亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純)、氫氧化鈉(分析純)天津市天力化學試劑有限公司。

DHG-9123A 型電熱恒溫鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司;DEF-500型搖擺式高速萬能粉碎機溫嶺市林大機械有限公司;HC-7P11-5 型架盤藥物天平上海精科科技有限公司;FA2004B型電子天平上海越平科學儀器有限公司;KQ-500VDED雙頻數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;TDL-4A 離心機上海菲恰爾分析儀器有限公司;V5000型可見分光光度計上海元析儀器有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1工藝流程新鮮紅松松針除雜陰干→粉碎過篩(60目篩)→稱取松針粉末→乙醇溶解→超聲輔助提取→離心(4000 r/min)→上清液定容→NaNO2-Al(NO3)3顯色法顯色(參照文獻[15])→測定吸光度→計算總黃酮得率。

1.2.2標準曲線的繪制配制濃度為0.2 mg/mL的蘆丁標準溶液,硝酸鋁顯色法[16]制作蘆丁標準曲線,分析處理可得到線性回歸方程。

1.2.3總黃酮得率的計算取在不同條件下所得的樣品濾液稀釋到一定體積,并取稀釋液1.0 mL于10 mL比色管中,顯色反應后,測定其吸光度,結合公式(1)和標準曲線回歸方程,求出松針總黃酮的得率[17]。

式(1)

式中:Y-松針總黃酮得率,%;C-松針總黃銅質量濃度,mg/mL;N-稀釋的倍數;m-稱取松針粉末的質量,g;V-提取液體積,mL。

1.2.4單因素實驗實驗以松針總黃銅得率為評價指標,選取工藝中的料液比、超聲時間、超聲溫度和乙醇的體積分數為影響因素確定其提取的最適范圍,平行實驗三次,計算得率。單因素實驗設計如下:

1.2.4.1不同料液比對松針總黃酮得率的影響準確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,設置料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80 g/mL,乙醇的體積分數為50%,超聲溫度為65 ℃,功率為500 W的條件下,超聲100 min后4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.4.2不同的乙醇體積分數對松針總黃酮得率的影響準確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,設置乙醇體積分數為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%,料液比為1∶50 g/mL,超聲溫度為65 ℃,功率為500 W的條件下超聲100 min后4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.4.3不同超聲溫度對松針總黃酮得率的影響準確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,設置超聲溫度為40、50、60、70、80、90 ℃下,料液比為1∶50 g/mL,功率為500 W的條件下,超聲100 min后,同樣4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.4.4不同超聲時間對松針總黃酮得率的影響準確稱取1.00 g過60目篩備用的紅松松針粉末若干份于250 mL碘量瓶中,加入50 mL體積分數為50%的乙醇溶液,料液比為1∶50 g/mL,超聲溫度為65 ℃,500 W下分別超聲20、40、60、80、100、120、140、160、180 min后,4000 r/min離心15 min,上清液用50%乙醇溶液定容至100 mL,取1 mL于比色管中顯色測定其吸光度。平行實驗三次取平均值,按公式(1)計算總黃酮得率。

1.2.5Box-Behnken響應面實驗優化提取條件在單因素實驗的基礎上,根據響應面設計原理[18],選取料液比、乙醇體積分數、超聲溫度和超聲時間為影響因素[19]。設計四因素三水平響應面優化實驗,進一步優化分析,確定超聲波輔助乙醇提取紅松松針總黃酮的最佳條件[20]。設計因素水平表見表1。

表1　響應曲面因素水平表Table 1　Analytical factors and levels of response surface methodology

1.3　數據處理

實驗操作重復三次取平均值,計算標準誤差并制圖分析。根據Design-Expert 8.05軟件,設計響應面實驗方案、建立數學模型并進行多元回歸分析,選擇最佳提取工藝參數。

2　結果與分析

2.1　標準曲線的繪制

可見分光光度計510 nm處測定不同濃度梯度的蘆丁標準品溶液的吸光值,以蘆丁標準品的濃度作為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線[21]。如圖1所示,可以得到方程y=11.75x+0.0006,R2=0.9971。

圖1　蘆丁標準曲線Fig.1　The standard curve of rutin

2.2　單因素實驗結果與分析

2.2.1料液比對紅松松針總黃酮得率的影響根據圖2可知,當料液比在1∶10～1∶50 g/mL之間,增大料液比,總黃酮得率隨之升高。當料液比為1∶50 g/mL時,得率最高,而當料液比超過1∶50 g/mL時,得率開始下降,黃酮的溶解已達到了飽和,其他非黃酮類成分隨著溶出,影響總黃酮得率。根據總黃酮得率,可以確定料液比為1∶50 g/mL時為最適料液比。

圖2　料液比對松針中總黃酮得率的影響Fig.2　Effect of ratio of material to liquid on the yield of total flavonoid from pine needle

2.2.2乙醇體積分數對紅松松針總黃酮得率的影響根據圖3可知,當乙醇體積分數小于50%時，隨著乙醇體積分數的增大,總黃酮得率也隨之升高,當乙醇體積分數達到50%時總黃酮得率最高,乙醇體積分數大于50%之后,得率卻隨之下降。乙醇濃度的大小影響著極性的大小,當濃度為50%時,與松針總黃酮的極性相似,溶解率達到了最大,而乙醇的體積濃度過大時,醇溶性雜質也會隨著溶出,影響總黃酮得率[22]。因此確定最適乙醇體積濃度為50%。

圖3　乙醇的體積分數對松針中總黃酮得率的影響Fig.3　Effects of ethanol concentration on the yield of total flavonoid from pine needle

2.2.3超聲溫度對紅松松針總黃酮得率的影響根據圖4可知,當溫度在40～70 ℃之間,溫度升高,總黃酮得率也隨之升高,在一定溫度下,物質的溶解量是一定的,溫度升高,加快了分子的運動速度,總黃酮溶解滲透能力升高,當溫度大于70 ℃,總黃酮得率下降,過高的溫度導致部分黃酮內部結構破損,失去活性,得率降低[23],因此超聲最適溫度為70 ℃。

圖4　超聲溫度對松針中總黃酮得率的影響Fig.4　Effects of ultrasonic temperature on the yield of flavonoid from pine needle

2.2.4超聲時間對紅松松針總黃酮得率的影響由圖5可知,當超聲時間從20 min增長到100 min時,隨著時間的增加,總黃酮得率也隨之升高,開始提取時,總黃酮物質與乙醇溶液之間存在濃度差,增長提取時間,黃酮類物質充分溶出,濃度差減小,當超聲時間為100 min時,總黃酮溶解度飽和,得率達到了最高。之后隨時間增加,提取率反而下降,可能的原因是超聲波的空穴作用過度,使細胞結構破損,胞內非黃酮物質隨之溶出,使得率下降[24],因此確定提取的最佳時間為100 min。

圖5　超聲時間對松針中總黃酮得率的影響Fig.5　Effects of ultrasonic time on the yield of total flavonoid from pine needle

2.3　響應面實驗結果與分析

2.3.1模型組合設計及方差分析應用Box-Behnken中心組合實驗設計原理,選擇A料液比、B乙醇體積分數、C超聲溫度、D超聲時間為影響主要因素,以東北紅松松針Y總黃酮得率為響應值[25],得出的實驗結果見表2,超聲波輔助乙醇提取東北紅松松針總黃酮得率數據模型方差分析表見表3。

表2　響應面分析設計及結果Table 2　Design and results of response surface analysis

表3　響應曲面方差分析表Table 3　Analysis of response surface variance table

注：*：p<0.05表示差異顯著;**：p<0.01表示差異較顯著;***：p<0.001表示差異極顯著。

利用Design-Expert軟件對表2的數據,進行多元回歸擬合,二次回歸方程為:Y(%)=5.79+0.037A+0.039B+0.33C+0.050D+0.057AB+0.12AC+0.060AD+0.17BC-0.060BD+0.24CD-0.53A2-0.82B2-0.31C2-0.71D2。

圖6　乙醇的體積分數與料液比響應面及等高線圖Fig.6　Response surface and contour plots of ethanol concentration and material to liquid ratio

圖7　超聲溫度與料液比響應面及等高線圖Fig.7　Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and material to liquid ratio

圖8　超聲時間與料液比響應面及等高線圖Fig.8　Response surface and contour plots of ultrasonic time and material to liquid ratio

圖9　超聲溫度與乙醇體積分數響應面及等高線圖Fig.9　Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and ethanol concentration

圖10　超聲時間與乙醇體積分數響應面及等高線圖Fig.10　Response surface and contour plots of ultrasonic time and ethanol concentration

圖11　超聲時間與超聲溫度響應面及等高線圖Fig.11　Response surface and contour plots of ultrasonic time and ultrasonic temperature

2.3.2響應面分析根據Box-Behnken分析得到各因素交互作用對松針總黃酮得率的影響。由等高線圖可知等高線中心位置向邊緣延伸,總黃酮得率逐漸減少,中心位置表示得率最高。另一方面,三維曲面的陡峭程度反應出響應值隨著實驗條件的改變而改變,曲面越陡峭,實驗條件改變對總黃酮得率影響程度越大,反之,越平緩影響則越小[29]。分析圖7三維曲面圖可以看出,料液比曲面比超聲溫度曲面坡度陡峭,即固定其他因素不變,討論料液比與超聲溫度交互作用對松針總黃酮得率影響大小,改變料液比對總黃酮得率影響較超聲溫度大。同理分析圖9,可以得到固定其他因素不變,改變乙醇體積分數的大小對松針總黃酮得率的影響比改變超聲溫度大,這與二元回歸方程系數相吻合。等高線的形狀越趨于圓形,表明兩因素的交互作用不顯著,越趨于橢圓形,則交互作用越顯著,趨于橢圓形,且橢圓與兩軸之間形成一定的角度,則交互作用極顯著[30-32],分析圖11超聲時間與溫度交互作用等高線圖趨于橢圓,且橢圓與兩軸之間有一定的角度,因此交互作用極顯著;分析圖9超聲溫度與乙醇體積分數交互作用等高線圖較趨于橢圓形且與兩軸有一定角度,交互作用較顯著;同理分析圖7超聲溫度與料液比等高線圖趨于橢圓形,且橢圓形與兩軸之間也存在一定角度,交互作用顯著,其余的不顯著,與方差表分析一致。

2.4　工藝優化及驗證實驗

結合單因素實驗,通過響應面法建立二次回歸模型,并通過方差分析,得出提取方法合理可靠。采用響應曲面分析可得東北紅松松針黃酮最優提取條件:料液比1∶51.6 g/mL,超聲溫度76.27 ℃,乙醇體積分數50.87%,超聲時間102.91 min,此時總黃酮得率為5.89%。結合實驗室操作條件,經驗證確定東北紅松松針黃酮提取條件為:料液比1∶52 g/mL,超聲溫度76 ℃,乙醇體積分數51%,超聲時間103 min,三次平行實驗取平均值,最后得到總黃酮得率為5.82%。

3　結論

針對東北地區豐富的紅松松針資源,以優化紅松針黃酮的超聲輔助提取方法為目的,且通過實驗優化提取條件,確定最佳提取工藝為:料液比1∶52 g/mL,超聲溫度76 ℃,乙醇體積分數51%,超聲時間103 min,總黃酮得率可達到5.82%,超聲波法輔助乙醇提取東北紅松松針黃酮,成本低,操作簡潔方便。比起傳統的溶劑提取法,超聲波的空穴作用更易使黃酮類物質溶出,提高了松針黃酮的提取率,為東北松針資源的開發利用提供可行性依據。

[1]司洪生. 關于我國紅松分類與分布的探討[J]. 林業科技通訊,2015,57(8):3-5.

[2]謝濟運. 松針有效成分的提取與分析研究進展[J]. 安徽農業科學,2011,39(22):13498-13500,13512.

[3]Xiaofeng Shi,Dongyan Liu,Junmin Zhang,et al. Extraction and purification of total flavonoids from pine needles ofCedrusdeodaracontribute to anti-tumorinvitro[J]. Bmc Complementary & Alternative Medicine,2016,16(1):245-253.

[4]Dongyan Liu,Xiaofeng Shi,Dongdong Wang. et al. A new flavonoid in pine needles ofCedrusdeodara[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs,2011,3(1):5-6.

[5]T V Hurshkainen,V I Terentyev,N N Skripova,et al. The study of the chemical composition of pine cedar extract[J]. Russian Journal of Bioorganic Chemistry,2015,41(7):753-756.

[6]Jeon J R,Kim J Y. Effects of pine needle extract on differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and obesity in high-fat diet fed rats[J]. Biological & Pharmaceutical Bulletin,2006,29(10):2111-2115.

[7]Chaudhary A K,Ahmad S,Mazumder A. Cognitive enhancement in aged mice after chronic administration ofCedrusdeodaraLoud. andPinusroxburghiiSarg. with demonstrated antioxidant properties[J]. Journal of Natural Medicines,2014,68(2):274-283.

[8]Chenxi Wang,Yuping Li,Lihua Yao,et al. Optimization of ultrasonic-assisted extraction of flavonoid fromPortulacaoleraceaL. by sponse surface methodology and chemical composition analysis[J]. Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry,2014,57(5):647-653.

[9]曾菲,魏芳,夏道宗. 松針總黃酮提取工藝的優化及復合袋泡茶的研制[J]. 中國食物與營養,2015,21(2):53-56.

[10]林楚慧,陳宣伶,鄭文瑋,等.馬尾松松針抗氧化酸奶加工工藝研究[J]. 中國乳品工業,2014(6):58-61.

[11]呂靜,賈凌云,袁久志,等. 紅松松針化學成分的分離與鑒定[J]. 沈陽藥科大學學報,2011,28(1):21-24,54.

[12]高巖,袁久志,王禹孝,等. 紅松松針中黃酮類成分的分離與鑒定[J]. 沈陽藥科大學學報,2010,27(7):539-543.

[13]戰英,陳麗娜,石矛. 微波輔助提取紅松松針總黃酮工藝優化[J]. 食品研究與開發,2015,36(16):69-72.

[14]文攀,王振宇,裴志勝. 響應面法優化紅松松籽殼總黃酮的超聲提取工藝研究[J]. 中國食品添加劑,2016,26(6):73-79.

[15]陶波,方梅,張嘉男,等. 沙冬青種子總黃酮測定方法及純化工藝研究[J]. 生物技術通報,2017,33(5):63-70.

[16]李怡錚,梁鐵強,王立娟. 超聲輔助提取黑皮油松松針黃酮及其穩定性[J]. 東北林業大學學報,2016,44(6):89-91.

[17]翁旭東,劉凡,劉翀,等.應用響應面法優化超聲波輔助乙醇提取桑根皮總黃酮的工藝條件[J].蠶業科學,2015,41(6):1071-1076.

[18]闕淼琳,蔣玉蓉,曹美麗,等. 響應面實驗優化藜麥種子多酚提取工藝及其品種差異[J]. 食品科學,2016,37(4):7-12.

[19]劉瓊,王仁才,吳小燕,等. 響應面法優化超聲波提取雞蛋棗原花青素工藝[J]. 食品工業科技,2017,38(16):182-188.

[21]楊萌,徐艷陽,楊光,等. 超聲波輔助酶法提取香菇柄中總黃酮的工藝優化[J]. 食品安全質量檢測學報,2017,8(1):202-209.

[22]王華,任廷遠,安玉紅. 超聲波輔助乙醇提取柑橘皮渣發酵液總黃酮工藝研究[J]. 食品科學,2009,30(24):206-212.

[23]黃瓊,謝向機. 超聲波輔助提取枇杷花黃酮類化合物工藝的優化[J]. 食品工業,2012(1):8-12.

[24]張俊生,陳莉華,侯孝璇,等. 超聲波輔助乙醇提取垂盆草中總黃酮及其抗氧化活性[J]. 食品科學,2012,33(8):18-23.

[25]汪澤,崔麗虹,唐冰,等. 響應面法優化菠蘿葉纖維多酚提取工藝[J]. 食品工業科技,2017,38(1):219-223.

[26]蔣美麗,久保輝幸,王正裔,等. 響應面法優化超聲輔助提取金銀花中綠原酸[J]. 化學與生物工程,2017,34(3):35-39,44.

[27]馬英麗,趙樺,王霞,等. 響應面法優化蜜楝果實中生物堿的超聲提取工藝研究[J]. 食品工業科技,2017(1):224-229.

[28]向福,付建強,胡淇淞,等. 響應面法優化大別山松針黃酮的提取工藝[J]. 河南農業科學,2015,44(9):145-149.

[29]劉奉強,肖鑒謀,劉太澤. 應用響應面法優化超聲波提取荊芥中總黃酮的工藝[J]. 南昌大學學報:工科版,2011,33(2):149-155.

[30]陳婷,徐文斌,洪怡藍,等. 響應面法優化甜葉菊殘渣中總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J]. 食品科學,2016,37(18):52-57.

[31]許靜雅,蘇小軍,李清明,等. 響應面法優化淮山中總黃酮提取工藝的研究[J]. 中國釀造,2016,35(5):115-118.

[32]陳紅梅,謝翎. 響應面法優化半枝蓮黃酮提取工藝及體外抗氧化性分析[J]. 食品科學,2016,37(2):45-50.