微波輔助萃取羅非魚魚油工藝優化及脂肪酸分析

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(海南大學食品學院,生物活性物質與功能食品開發重點實驗室,海南?？?570228)

羅非魚屬鱸形目麗魚科,原產于非洲,別稱非洲鯽魚,非鯽、越南魚等。體肥味鮮,極易養殖[1]。近年來,隨著人們對保健產品的認可度不斷增強,魚油提取與開發已成為世界研究熱點。魚油富含ω-3多不飽和脂肪酸,其中二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)能顯著地促進嬰兒智力發育、提高記憶力、改善視力,二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)可預防動脈粥樣硬化、高血壓,抑制過敏反應等,在人體中具有重要的生物學意義[2-4]。目前魚油提取方法主要包括:蒸煮法、稀堿水解法、酶解法和超臨界萃取法等[5]。蒸煮法等傳統提取方法,相對提取率較低,浪費較嚴重,而超臨界萃取法等對于設備要求較高,不易實現生產化[5-8]。微波輔助萃取是近年來興起的一種油脂提取分離技術,多應用于植物油脂的提取,至今未見有關于微波輔助提取魚油的報道[9-11]。在微波場中,微波能加熱,而不同的物質對微波能吸收度不同,這就使得萃取體系中的某些組分被選擇性加熱從而萃取出來[12]。微波輔助萃取相比其他傳統提取方法,具有升溫快速均勻,熱效率高,無污染,溶劑回收率高等優點,大大縮短了提取時間,提高萃取率,節約成本[13]。

自2012年以來,國內羅非魚進出口市場,主要以銷售鮮魚和冷凍魚片為主,產生了大量的下腳料(魚頭、魚皮、魚骨、內臟等)[14]。國內外關于羅非魚的魚油提取及脂肪酸分析,主要以魚頭和內臟為主。鄒舟等[15]通過研究鰱魚各部位脂質分布及脂肪酸組成,發現魚各個部位的脂肪酸組成及含量具有較大差異,尤其是DHA、EPA、花生四烯酸等。分析羅非魚各個部位的脂肪酸,可以更加科學的利用加工過程中產生的下腳料。

在傳統研究中,通常是將鮮魚進行簡單的清洗晾干,然后提取其魚油。然而,該方法難以保證原材料含水量的均一性。因此,本實驗采用冷凍干燥法預先處理原材料,然后通過微波輔助萃取魚油,在單因素基礎上,應用正交實驗法確定最佳工藝,并通過氣相色譜儀對整魚及各個部位的魚油脂肪酸組成和含量進行分析,為近一步科學的綜合利用羅非魚提供新途徑。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

新鮮羅非魚5～7月份,重約1.5 kg,長約25 cm,寬約14 cm,?？谑惺?正己烷、石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、丙酮、草酸、乙酸甲酯均為分析純,廣州化學試劑公司;正己烷色譜純,美國Fisher公司;脂肪酸GLC-463NU-CHEK-PREP公司。

7890A氣相色譜儀、全自動進樣器、FID檢測器、cp-sil88毛細管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm)Agilent有限公司;CW-2000超聲波-微波協同萃取儀上海新拓微波溶樣測試技術有限公司;EV321旋轉蒸發儀北京萊伯泰科技有限公司;JM-B20002電子天平諸暨市超澤衡器設備有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1原材料預處理整魚:羅非魚洗凈,晾干,去掉苦膽,切塊,在-18 ℃冰箱下冷凍24 h,放入真空冷凍干燥機,-80 ℃下,凍干48 h,粉碎,樣品放入樣品袋,密封,存放于-80 ℃冰箱中待用;各個部位:羅非魚洗凈,去掉苦膽,然后分解為魚頭、魚尾、魚皮、內臟、魚肉和魚骨,晾干,在-18 ℃冰箱下冷凍24 h,放入真空冷凍干燥機,-80 ℃下,凍干48 h,粉碎,樣品放入樣品袋,密封,存放于-80 ℃冰箱中待用。

1.2.2整魚魚油的提取稱取一定量的樣品,加入適當的溶劑,放入超聲波-微波協同萃取儀,按實驗設計設置參數,進行提取。提取結束后,取出提取瓶,抽濾,濾紙用正己烷沖洗,濾液移至旋蒸瓶中,旋轉蒸發至恒重,旋蒸瓶內油脂,即為羅非魚粗魚油,稱量其質量,計算魚油萃取率(DW)[6]。

1.2.3羅非魚魚油萃取率計算公式

式中:m0為旋蒸瓶質量量(g);m1為(旋蒸瓶+魚油)質量(g);m2為羅非魚樣品質量(g)。

1.2.4單因素實驗

1.2.4.1萃取溶劑的選擇料液比1∶8 (g/mL),微波功率100 W,萃取時間10 min,考察不同萃取溶劑(正己烷、石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、丙酮)對萃取率的影響,選擇毒性較小,萃取率相對較好的溶劑為實驗萃取溶劑。

1.2.4.2料液比萃取溶劑為正己烷,微波功率100 W,萃取時間10 min,考察料液比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12) (g/mL)對魚油萃取率的影響。

1.2.4.3微波功率萃取溶劑為正己烷,料液比1∶8 (g/mL),萃取時間10 min,考察微波功率(60、80、100、120、150 W)對魚油萃取率的影響。

1.2.4.4萃取時間萃取溶劑為正己烷,料液比1∶8 (g/mL),微波功率100 W,考察萃取時間(3、5、10、12、15 min)對魚油萃取率的影響。

1.2.5正交實驗通過單因素實驗,選擇正己烷為萃取溶劑,選用L9(34)正交表設計正交實驗。

表1　正交實驗設計表Table 1　Factors and levels table of orthogonal experiment

1.2.6氣相色譜分析羅非魚魚油脂肪酸組成脂肪酸甲酯化:取適量魚油樣品,加入1.5 mL色譜級正己烷溶劑,依次加入40 μL乙酸甲酯和100 μL甲醇鈉-甲醇溶液(0.5 mol/L),混勻。在室溫條件(25 ℃左右)反應20 min后,立即在-18 ℃下冷凍10 min,迅速加入60 μL草酸,于4000 r/min下離心5 min后,吸取上層清液,加入2.0 g無水硫酸鈉除去水分,濾液經0.22 μm濾膜注入進樣瓶,氮氣吹干,加入1 mL色譜級正己烷,待測[17]。

氣相色譜條件:cp-sil88毛細管柱(100 m×0.25 mm×0.2 μm),載氣:H2,燃燒氣:N2,H2和空氣。進樣口溫度250 ℃。程序升溫條件:起始溫度為45 ℃,保持4 min。以13 ℃/min升溫至175 ℃,保持27 min。再以4 ℃/min升溫至215 ℃,保持35 min。脂肪酸的分析參照GLC-463脂肪酸甲酯標準圖譜,脂肪酸的百分含量釆用面積歸一化法確定(以峰值面積的百分比表示)。

1.2.7羅非魚魚油理化指標的測定酸值:GB 5009.229-2016;過氧化值:GB 5009.227-2016;碘值:GB/T 5532-2008;不皂化物:GB/T 5535.2-2008;水分及揮發物:GB 5009.236-2016。

1.3　數據處理

2　結果與分析

2.1　羅非魚魚油提取的單因素實驗

2.1.1萃取溶劑對魚油萃取率的影響在微波場中,極性溶劑的介電常數越大,吸收的微波能量就越多,細胞內的溫度就會在瞬間升高,導致細胞壁破裂,油脂容易被釋放出來[18]。如圖1所示,乙酸乙酯作為萃取溶劑時,魚油的萃取率最高(27.83%±0.56%);丙酮與正己烷的萃取率接近,分別為(24.66%±0.97%)和(23.35%±0.77%),石油醚的萃取率最低(20.11%±0.67%)。由于乙酸乙酯和丙酮的毒性較大,且工業大規模生產中常選用正己烷作為萃取溶劑[19]。因此,從安全性、經濟效益及實際生產等多個因素綜合考慮,接下來的單因素和正交實驗選擇正己烷作為羅非魚魚油萃取溶劑。

圖1　萃取溶劑對魚油萃取率的影響Fig.1　Effect of extraction solvent on fish oil extraction rate

2.1.2料液比對魚油萃取率的影響如圖2所示,當料液比從1∶4 (g/mL)增加到1∶12 (g/mL),羅非魚魚油萃取率先增大后下降;當料液比1∶6 (g/mL)時,魚油萃取率最高(27.14%±0.14%)?？赡苁且驗楫旚~粉質量一定時,料液比越大,反應接觸面積越大,油脂較容易浸出。但當萃取溶劑用量達到一定量后,微波在穿透溶劑過程中會衰減,萃取溶劑越多,使得到達基提物質的微波能越少,同時,萃取溶劑量增大,也會延長溶劑的回收時間[20]。而由圖2可知，雖然料液比1∶6～1∶10 g/mL的過程中，萃取率在下降，但仍然比1∶4 g/mL時要大，因此進行正交實驗時，先取1∶6～1∶10 g/mL 3個水平。

圖2　料液比對魚油萃取率的影響Fig.2　Effect of solid-liquid ratio on fish oil extraction rate

2.1.3微波功率對魚油萃取率的影響如圖3所示,隨著微波功率(60～150 W)的增加,羅非魚魚油萃取率先增加后降低;當微波功率100 W時,魚油萃取率最高(28.27%±0.29%)。微波功率的增大,對羅非魚蛋白質與魚油結合的部分破壞更加充分,使得魚油萃取率增大。然而當微波功率大于100 W時,微波累積的熱量會導致溫度升高,溶劑沸騰,造成低沸點揮發油損失,以致萃取率降低[16]。

圖3　微波功率對魚油萃取率的影響Fig.3　Effect of microwave output power on fish oil extraction rate

2.1.4萃取時間對魚油萃取率的影響如圖4所示,隨著萃取時間的增加,萃取率先升高后降低;在萃取10 min時,魚油萃取率達到最大值26.30%。超過10 min,萃取率逐漸減少,原因可能是隨著萃取時間的延長,微波產熱增加,使得萃取溶劑揮發或低沸點揮發油損失,導致萃取率降低[21]。

圖4　萃取時間對魚油萃取率的影響Fig.4　Effect of time on fish oil extraction rate

2.2　正交實驗

根據單因素實驗結果,選取影響魚油萃取率各因素中適當的水平進行正交實驗,對結果進行極差分析與方差分析,以確定最佳的反應條件。采用L9(34)正交表,以料液比(A)、萃取時間(B)、微波功率(C)作為3個考察因素,選取3個水平進行實驗,結果見表2。

根據極差分析可知,影響魚油的主次因素為:B>A>C。各因素的R值大于空列的R值,故各因素的水平效應的差異是存在的。正交實驗中魚油的最佳提取方案為A3B3C2，即正己烷為最佳萃取溶劑,當料液比1∶10 (g/mL),萃取時間10 min,微波功率100 W，萃取率為(29.17%±0.13%)。由方差分析可知,料液比、提取時間對魚油萃取率影響極顯著,微波功率影響顯著。

表3　正交實驗方差分析Table 3　Variance analysis of orthogonal experiment

表2　正交實驗設計及結果Table 2　Design and results of orthogonal experiment

2.3　羅非魚脂肪酸組成

由表4可知,棕櫚酸(C16∶0,20.98%～23.20%)、油酸(9cC18∶1,19.06%～25.96%)和亞油酸(9c12cC18∶2,10.38%～15.74%)是羅非魚整魚及其6個部位中的主要脂肪酸。這與郝記明等[21]利用酶解法提取下腳料油脂測得脂肪酸結果一致。部分研究表明,棕櫚酸可抑制HSC的增值和α-平滑肌肌動蛋白的表達,從而抑制肝纖維化[23]。而油酸是單不飽和脂肪酸,具有調節血糖血脂、降低膽固醇等功效[24]。亞油酸是人體必需脂肪酸,可促進生長發育,部分研究表明,亞油酸對嬰幼兒的視力和智力發展有一定的影響。羅非魚魚油含量大于1%的脂肪酸還有C14∶0、9cC16∶1、C18∶0、11cC18∶1、C18∶3 n-3、11cC20∶1、C20∶4、C22∶4及C22∶6n-3(DHA),大部分為不飽和脂肪酸,近年來許多研究表明不飽和脂肪與人體的健康息息相關,不飽和脂肪酸可有效地促進血液循環、抑制腫瘤和動脈粥樣硬化、提高免疫力,增進智力等[25-27]。因此羅非魚魚油具有較高的營養價值。

羅非魚整魚及其各部位中,飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量為(34.06%～39.89%),其中,C16∶0的含量最高(20.98%～23.20%),其次是C18∶0(5.48%～6.12%)和C14∶0(2.82%～3.51%);單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)的含量為(30.12%～37.55%),主要包括油酸(19.06%～25.96%)、棕櫚油酸(9cC16∶1,5.44%～6.14%)和11cC18∶1(3.31%～3.95%);ω-6 多不飽和脂肪酸的含量為(18.20%～21.94%),主要包括亞油酸(10.38%～15.74%)、花生四烯酸(C20∶4 n-6,1.06%～1.90%)和C22∶4 n-6(0.94%～2.43%)。相比較而言,ω-3 多不飽和脂肪酸的含量較少,為(4.93%～10.15%)。此外,在羅非魚中,還檢測到少量反式脂肪酸,含量為(1.69%～3.12%)。

由圖5可知,微波提取的羅非魚各個部位EPA+DHA含量差異較大,魚肉含量最高為(3.29%±0.07%),其次是魚尾和魚骨,內臟含量最低為(1.59%±0.03%)。在以往的國內外研究中,羅非魚脂肪酸組成及含量的研究主要集中在羅非魚頭和內臟。而不飽和脂肪酸尤其是DHA+EPA的含量,往往成為衡量魚油營養價值的一項重要指標。應用微波提取的魚頭油中,DHA+EPA的含量為2.46%,而李夢凡等[28]通過酶解法提取羅非魚頭油,得到DHA+EPA的含量僅為1.36%;應用微波提取的羅非魚魚肉油脂中,魚肉含量最高為(3.29%±0.07%),而張立堅等[29]應用氯仿-甲醇法提取的羅非魚魚肉油脂中DHA+EPA的含量僅為2.71%,說明微波輔助法提取的魚頭油品質較好。魚內臟中,微波輔助萃取得到的魚油DHA+EPA的含量為1.59%,孫麗霞等[30]分別研究索氏抽提、超聲提取、高壓脈沖電場提取三種方法得到的羅非魚內臟油脂,其DHA+EPA的含量為1.91%～2.26%,與本測定結果略有差異,可能是由于羅非魚體內脂肪隨季節和產地等的變化而略有變化[16]。

圖5　羅非魚各個部位(EPA+DHA)含量Fig.5　Contents of DHA+EPA from different parts of tilapia

表4　羅非魚整魚及各個部分脂肪酸組成和含量(%)Table 4　The fatty acids compositions of the whole fish and different parts(%)

注：表中數據為平均值±標準差(n=3);-:未檢測到;SFA:飽和脂肪酸;MUFA:單不飽和脂肪酸;TFA:反式脂肪酸(trans fatty acids,TFA);PUFA:多不飽和脂肪酸。2.4羅非魚整魚及各個部位魚油理化性質

表5　羅非魚整魚及各個部位理化指標Table 5　Physical and chemical indexes of the whole fish and different parts of tilapia

在生物活性物質的利用過程中,只有滿足了量的需求,才能追求質的要求。而在羅非魚加工過程中,魚肉(腹肌)往往用于鮮食,而剩余部位大多為加工副產物。通過分析各個加工副產物部位油脂含量和他們的營養價值,我們可以更好地對其進行有效地利用。由表5可知,在羅非魚的各個部位中,采用微波輔助萃取法最優工藝條件提取各個部位油脂,其中內臟含油量最高為(31.59%±0.73%),其次為魚頭和魚皮,魚肉(腹肌)含油量最低(4.99%±0.26%)。從各個部位的理化指標檢測結果來看,均符合國家標準SC/T 3502-2000。但整體而言,內臟油脂的各項理化指標(如酸價、過氧化值、碘值等)明顯高于其他部位,可能是由于魚內臟油脂的不飽和脂肪酸含量最高導致的,魚尾魚骨次之。

3　結論

本實驗研究微波輔助萃取羅非魚魚油條件對提取率和質量的影響,在單因素實驗基礎上進行正交實驗設計優化魚油的提取工藝參數,結果表明最佳萃取溶劑為正己烷,在料液比為1∶10 (g/mL),微波時間為10 min,微波功率為100 W時,魚油提取率最高為29.17%±0.13%。整魚及各個部位提取的油脂,其理化指標均符合粗魚油國家標準。分析微波提取的羅非魚整魚及各個部位的脂肪酸組成和含量,可知羅非魚整魚及各個部位的脂肪酸主要由棕櫚酸(20.98%～23.2%)、油酸(19.06%～25.96%)及亞油酸(10.38%～15.74%)組成。SFA含量最多的為棕櫚酸,魚尾含量最高為23.20%±0.03%,魚頭次之。油酸是微波提取的羅非魚整魚及各個部位的主要單不飽和脂肪酸,內臟含量最高為23.96%±0.10%。ω-3 PUFA是魚油最重要的脂肪酸,其中魚骨含量最高(10.15%±1.04%),魚皮次之。整魚DHA+EPA的含量為總脂肪酸的2.16%,魚尾最高為3.10%。羅非魚各個部位的脂肪酸差異顯著,可根據其脂肪酸特點,選擇性地對其進行加工利用,提高副產物利用價值。微波輔助萃取在縮短萃取時間的同時還大大提高了萃取率,且得到魚油營養價值較高,因此微波輔助萃取法是羅非魚魚油提取的一種行之有效的方法,在工業生產中有較高的借鑒價值。

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