櫛江珧粗多糖提取工藝優化、組成分析及其抗氧化活性研究

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(淮陰工學院生命科學與食品工程學院,江蘇淮安 223001)

多糖是自然界廣泛存在的一類生物信息大分子。多糖不僅廣泛參與各種生命活動,而且具有多種生物活性功能。大多數動植物多糖易溶于熱水,不易溶于冷水,遇到有機溶劑如乙醇、丙酮等能沉淀。目前,常用的多糖化學提取方法有水提取法、堿提取法、酸提取法、酶解法等。其中,水提取法是最為常見的提取方法,此方法具有操作條件溫和、成本低、操作簡單等優點[1]。近年來,國內外研究人員從不同的生物體中提取了多種活性多糖,發現其具有增強免疫力[2]、抗腫瘤[3]和抗凝血[4]等生理調節功能,可作為保健食品和藥物中的功能性成分而被越來越廣泛的應用于食品和醫藥工業。

櫛江珧屬軟體動物門、雙殼綱、鶯蛤目、江珧蛤科、曲江珧蛤屬[5]。櫛江珧是一種大型海洋底棲雙殼貝類,主要分布在溫帶和熱帶近海海域(主要是印度洋及太平洋海域)。櫛江珧在我國分布廣泛,北起遼東半島南至瓊州海峽,其中南海櫛江珧的種類及自然產量最多,山東北部沿海、福建及泉州等地也有豐富的野生櫛江珧資源[6-7]。櫛江珧是味道鮮美的海中珍品,其閉殼肌特別肥大,干品俗稱“珧柱”,民間及中醫均認為其具有滋陰補腎和調中功效,并有抗癌作用[8]。海洋軟體動物有顯著的藥理活性,而且其活性歸功于多糖的存在[10]。Li等[11]將提取的扁玉螺多糖,通過DEAE-52陰離子交換柱分離,得到3個多糖組分:GDPS-1、GDPS-2和GDPS-3,體外實驗發現3個組分均能促進脾細胞的增殖從而具有免疫活性。張艷軍等[10]采用水提法,在pH=6.75的條件下提取牡蠣多糖,得率為2.56%。Qiao等[12]從三角帆蚌中得到三個純化多糖組分HCPS-1、HCPS-2、HCPS-3,通過體外抗氧化模型評價證明該多糖在體外可清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基,并能還原鐵離子和螯合亞鐵離子。仲娜等[13]從櫛孔扇貝中得到多糖FAGP,通過紙層析的方法得出FAGP含有Glc、Man、Rha、Fuc、Gal。

目前對于櫛江珧的研究主要集中于人工育苗和養殖、優良品種的篩選、遺傳多樣性的評價和活性蛋白的分離提取等方面。尚未有關于櫛江珧粗多糖(crudeAtrinapectinatapolysaccharides,CAPPS)提取和活性研究的相關報道。鑒于此,本研究采用響應面法優化櫛江珧粗多糖的提取工藝,為櫛江珧多糖的工業化生產提供理論參考。同時進一步對粗多糖進行組成和紅外光譜等分析,并對其體外抗氧化活性進行了研究,為櫛江珧多糖的深入開發利用提供理論依據。

表1　響應面實驗因素和水平Table 1　Factors and levels used for RSM

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

冷凍的櫛江珧閉殼肌采購自遼寧大連;無水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、硫酸、苯酚、肌醇、鹽酸羥胺、乙酸酐、吡啶均為國藥分析純;鼠李糖(純度99.0%)、阿拉伯糖(純度99.0%)、巖藻糖(純度99.0%)、木糖(純度99.1%)、甘露糖(純度99.5%)、葡萄糖(純度99.5%)和半乳糖(純度99.5%)德國Dr.Ehrenstorfer公司;氯化硝基四氮唑藍(NBT)、還原性輔酶Ⅰ(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、菲洛嗪、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、氯化亞鐵、硫酸亞鐵、水楊酸、維生素C和EDTA-2Na等上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

AG R-210型旋轉蒸發儀瑞士Buchi公司;HK-08B型流水式中藥粉碎機廣州市旭朗機械設備有限公司;J-26 XP型冷凍離心機美國Beckman Coulter公司;TU-1810型紫外可見分光光度計北京普析;7890A氣相色譜儀美國Agilent公司;Nicolet 5700傅立葉變換紅外光譜儀美國賽默飛公司。

1.2　實驗方法

1.2.1櫛江珧多糖的提取工藝櫛江珧閉殼肌→勻漿→無水乙醇脫脂→離心→沉淀物烘干→櫛江珧粉→熱水浸提→離心→抽濾→濃縮→醇沉→離心→烘干→櫛江珧粗多糖。

1.2.1.1原料預處理冷凍的櫛江珧閉殼肌,冷藏解凍后破碎勻漿。向勻漿中加入無水乙醇至終濃度為75%,以脫去組織中的脂肪。之后將勻漿液5000 r/min離心20 min,保留沉淀物,60 ℃烘干后用中藥粉碎機進行粉碎,80目篩分,得櫛江珧粉。

1.2.1.2熱水浸提取適量櫛江珧粉,加一定體積的蒸餾水,在一定溫度下浸提。提取液于5000 r/min下離心20 min,上清液經抽濾,旋轉蒸發濃縮至原體積的1/10,放于4 ℃待用。濾渣相同條件下再提取1次。合并濃縮液,加入無水乙醇至體積分數為75%,充分振蕩,4 ℃靜置12 h后,5000 r/min離心20 min,保留沉淀物,60 ℃烘干,即為櫛江珧多糖粗提物。

1.2.2脫蛋白采用Sevage法進行脫蛋白處理[14]。按照粗提物溶液與Sevage試劑(氯仿∶正丁醇=5∶1 V/V)5∶1混合,劇烈振蕩30 min,靜置15 min,于2000 r/min離心10 min,保留上層清液,清液重復上述操作3次。所得的清液在50 ℃濃縮至適量。濃縮液按1∶9的比例加入90%的無水乙醇,劇烈振蕩,在4 ℃的冰箱中靜置12 h,7000 r/min離心20 min,保留沉淀物。將沉淀物在50 ℃烘干,得到去除蛋白后的櫛江珧粗多糖。

1.2.3單因素實驗及響應面優化實驗設計實驗設置了提取溫度(55、65、75、85、95、100 ℃)、液固比(15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1 mL/g)以及提取時間(120、180、240、300、360 min)三個單因子,固定因素水平為提取溫度75 ℃、液固比35∶1及提取時間4 h,分別考察這三個因素對櫛江珧粗多糖得率的影響。

在單因素實驗結果的基礎上,選取合適的水平,通過中心組合實驗進行實驗設計(表1)。

1.2.4櫛江珧粗多糖的測定與得率計算

式中:w1為櫛江珧多糖粗提物重量;w2為櫛江珧組織粉末重量。

1.2.5理化分析總糖含量采用苯酚-硫酸法測定[15];蛋白含量采用考馬斯亮藍染色法測定[16];糖醛酸含量參照Terho等[17]的方法進行測定;硫酸基含量采用氯化鋇-明膠法進行測定[18]。

1.2.6紅外光譜分析烘干適量的KBr,稱取0.2～0.3 g的溴化鉀粉末,以及2～3 mg粗多糖樣品,在瑪瑙研缽中均勻研磨,用壓片機把混勻的粉末壓成半透明狀的薄片。設定傅立葉變換紅外光譜儀的掃描波長為4000～500 cm-1,先單獨用KBr粉末壓成薄片做空白實驗,再用加過樣品的薄片進行檢測。

1.2.7粗多糖的組成成分測定稱取粗多糖約5 mg,置于安瓿瓶中,加入2 mol/L的三氟乙酸5 mL,酒精噴燈封口,在120 ℃條件下水解反應2 h。水解液在55 ℃旋轉蒸發至干,加入2.5 mL的甲醇,再次蒸干,如此反復5次,蒸干后備用。隨后按照YANG等的方法,使用氣相色譜儀進行測定[19]。

色譜條件:毛細管色譜柱(HP-1 MS,30 m×0.250 mm×0.25 μm),火焰離子檢測器(FID),色譜柱升溫程序為120 ℃保持3 min,以3 ℃每分鐘的速度升溫至210 ℃,210 ℃保持10 min;N2流速為25 mL·min-1,H2流速為40 mL·min-1,空氣流速為400 mL·min-1。

1.2.8粗多糖的抗氧化活性測定以超氧自由基清除活性、羥基自由基清除活性和Fe2+離子螯合能力測定作為衡量櫛江珧粗多糖抗氧化能力的參考標準。以抗壞血酸VC作為對照,按照GUO等[20]的方法測定超氧自由基清除活性和羥基自由基清除活性;以EDTA-2Na作為對照,按照LIU等[21]的方法測定Fe2+離子螯合能力。

1.2.9數據處理采用Origin 8.0和Design-Expert 10.0軟件進行數據分析。

2　結果與分析

2.1　單因素實驗

2.1.1浸提溫度對粗多糖得率的影響如圖1所示,在55～95 ℃時,櫛江珧粗多糖的得率隨著溫度的提高而顯著增加,原因可能是隨著溫度的增加,分子運動的速率增加,分子擴散速率增加,從而提高多糖的溶解性[22-23]。在95 ℃時粗多糖的得率達到最高值21.06%。在95～100 ℃時,粗多糖得率開始呈現下降的趨勢,原因可能是在高溫條件下多糖分子會發生降解或者被破壞[24]。綜合考慮多糖提取的成本和能耗等,浸提溫度設置在85～95 ℃范圍內較合適,因此選擇90 ℃作為中心實驗點。

圖1　溫度對櫛江珧粗多糖提取得率的影響Fig.1　Effect of extraction temperature on CAPPS yield注:不同小寫字母代表有顯著差異(p<0.05),圖2、圖3同。

2.1.2液固比對多糖得率的影響當液固比較小時會造成多糖溶解不完全而得率較低,如圖2所示,當液固比從15∶1增加到45∶1時,多糖得率逐漸提高,其中,液固比從15∶1到35∶1時,多糖的得率遞增趨勢明顯,從35∶1增加到45∶1時,多糖得率呈小幅增加。原因可能是當水的比例增加時,多糖分子的擴散滲透能力持續提高,多糖得率也大幅提高;液固比到達一定值時,隨著水的增多,多糖分子的溶解能力無法進一步大幅提高,多糖得率增勢減緩[25]。當水的比例由45∶1繼續增加時,櫛江珧多糖的得率呈下降趨勢,可能是在熱水提取后的離心、濃縮等操作中,水分過多導致多糖損失較大?？紤]到多糖得率及成本、能耗,選擇液固比在35∶1為宜。

圖2　液固比對櫛江珧粗多糖得率的影響Fig.2　Effect of solvent-to-solid on CAPPS yield

2.1.3提取時間對多糖得率的影響如圖3所示,當提取時間在120～180 min的范圍內時,多糖得率隨時間的增加而增大;在180～240 min的范圍內時,多糖得率仍然呈上升趨勢,但上升趨勢變緩;當提取時間超過240 min時多糖得率呈明顯的下降趨勢,其原因可能是在一定提取時間下,多糖隨溫度的升高逐漸溶出,但加熱時間過長,會導致多糖被包裹在加熱變性的蛋白質內部[26],多糖的得率降低。因此選擇210 min作為中心實驗點。

圖3　提取時間對櫛江珧粗多糖得率的影響Fig.3　Effect of extraction time on CAPPS yield

2.2　響應面實驗結果分析

運用響應曲面法確定櫛江珧粗多糖提取工藝的最佳條件,本實驗以提取溫度、提取時間和液固比作為變量因素,考察其對櫛江珧粗多糖得率的影響,實驗結果如表2所示。

表2　響應曲面法優化設計方案及實驗結果Table 2　Program and experimental results of RSM

2.2.1回歸模型統計學檢驗由Design expert 10.0軟件分析得到三元二次回歸方程:Y=18.08+0.052A+0.070B+0.1C+0.050AB-0.15AC+0.090BC-0.074A2-0.13B2-0.086C2。

表3　回歸方差分析結果Table 3　Analysis of variance of regression equation

注：a表示影響顯著(p<0.05)。

2.2.2響應曲面圖分析及結果驗證響應曲面圖能形象地描述二次回歸方程,直觀地反映櫛江珧粗多糖提取工藝參數的交互作用對櫛江珧粗多糖得率的影響是否顯著,等高線為橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則說明交互作用不顯著[27]。圖形的響應曲度可以反映因素兩兩交互效應的強弱,響應曲面圖的拋物面開口向下,且具有極大值點,說明所選因素水平里包括了最優化的組合[28]。

圖4　各個因素交互作用對櫛江珧粗多糖得率影響的響應面圖 Fig.4　Response surface plots of the interactive effects of three factors on CAPPS yield

如圖4a所示,提取溫度和提取時間交互作用的p值為0.2293,等高線近圓形,說明兩者差異不顯著,交互作用不大。溫度升高時雖然會加劇分子運動促進溶解,但是高溫同樣會破壞多糖分子,造成最終多糖得率降低,因此溫度必須保持在一個合理的范圍內。同樣過長的浸提時間可能會破壞多糖的結構而使得多糖得率下降。因此提取時間同樣必須保持在一個合理的范圍內。如圖4b所示,提取溫度和液固比交互作用的p值為0.0036,等高線近橢圓形,說明兩者,交互作用顯著。在一定范圍內,多糖得率隨液固比和提取溫度的增加而升高,液固比在初始增加時,會促進多糖溶出,但溶劑量的持續增加會影響提取體系的傳熱和傳質,此時多糖的得率呈下降趨勢;而液固比過低則無法完全溶解多糖,因此液固比也只能控制在一個合適的范圍內。圖4c中,提取時間與液固比之間同樣存在相似的交互作用,提取時間和液固比交互作用的p值為0.0439,等高線近橢圓形,說明兩者交互作用顯著。

通過響應面分析得出最佳條件:提取溫度94 ℃,提取時間215 min,液固比34∶1 (mL/g),在此條件下,模型預測的櫛江珧粗多糖的得率為18.21%。對此工藝條件進行驗證,得到粗多糖得率為18.37%,基本與理論值一致。

2.3　粗多糖基本組成分析

如表4所示,櫛江珧粗多糖的基本組成成分中糖含量為94.39%。除此之外,還含有少量的蛋白質(2.8%)、水分(2.1%)以及少量的糖醛酸(0.63%)和硫酸基(0.08%)。與櫛江粗多糖不同，翟呂平等[29]發現魷魚軟骨粗多糖中總糖含量為75.52%,糖醛酸含量為27.62%,硫酸基含量為23.08%。根據殷秀紅等[30]對紫貽貝粗多糖的研究,發現其總糖含量(59.60%)遠低于櫛江粗多糖，但糖醛酸含量(4.20%)和硫酸基含量(2.09%)則高于櫛江珧粗多糖。

表4　櫛江珧粗多糖組成成分Table 4　Composition of CAPPS

2.4　紅外分析譜圖

櫛江珧粗多糖的紅外圖譜如圖5所示,樣品在4000～400 cm-1區域具有多糖類物質的特征吸收峰,在3401.72 cm-1處出現了寬而強的羥基的O-H的振動的吸收峰[31];在2933.39 cm-1處出現了烷基的C-H伸縮振動吸收峰;在1401.92 cm-1處出現了烷基的C-H邊角振動的吸收峰;在1654.33 cm-1處出現了羧基的C=O非對稱的伸縮振動;在922.59 cm-1處出現吡喃糖中C-O-C非對稱環。在750 cm-1出現的吸收峰再次證明有吡喃糖[32]。

圖5　櫛江珧粗多糖紅外譜圖Fig.5　IR spectra of CAPPS

2.5　粗多糖的單糖組成分析

圖6為混合標準單糖糖腈衍生化后的氣相色譜圖,由圖6可知26.084 min是鼠李糖,26.497 min是阿拉伯糖,26.960 min是巖藻糖,27.033 min是木糖,34.042 min是甘露糖,34.383 min是葡萄糖,35.276 min是半乳糖,40.144 min是肌醇六乙酸酯。圖7為櫛江珧粗多糖水解后經衍生化處理的氣相色譜圖。由圖7可知,樣品在34.279 min出峰,對照圖6可知櫛江珧粗多糖主要是由葡萄糖組成。40.049 min處的肌醇六乙酸酯峰的峰面積較大,可能是由于作為內標物時,其絕對量相對于樣品高而導致的。

圖6　標準單糖氣相色譜圖Fig.6　GC spectrum of monosaccharide reference

圖7　櫛江珧粗多糖的氣相色譜圖Fig.7　GC spectrum of CAPPS

2.6　櫛江珧粗多糖抗氧化活性

2.6.1超氧自由基清除活性由圖8得知,隨著多糖濃度的增加,超氧自由基清除活性呈上升趨勢,在濃度范圍1.6～4.0 mg/mL時趨于穩定。在濃度4.0 mg/mL時,CAPPS對超氧自由基清除率為78.22%。CAPPS清除能力(IC50=0.599 mg/mL)顯著高于VC。

圖8　櫛江珧粗多糖的超氧自由基清除活性Fig.8　Scavenging effects of CAPPS on superoxide radical 注:不同小寫字母代表樣品和對照在相同濃度比較時有顯著差異,p<0.05,圖9、圖10同。

2.6.2羥基自由基清除活性由圖9可知,櫛江珧粗多糖具有羥基自由基清除能力。在濃度范圍0.4～3.2 mg/mL內,隨著多糖濃度的增加,羥基自由基清除活性呈上升趨勢,在3.2～4.0 mg/mL內羥基自由基清除率趨于穩定。在4.0 mg/mL時,對羥基自由基清除率達到86.78%。櫛江珧粗多糖對羥基自由基的清除率(IC50=1.01 mg/mL)顯著低于VC(IC50=0.39 mg/mL)。本研究提取的粗多糖對羥基自由基的清除活性與孫麗平等[33]研究的烏鱧粘多糖對羥基自由基的清除活性相當。

圖9　櫛江珧粗多糖的羥基自由基清除活性Fig.9　Scavenging effects of CAPPS on hydroxyl radical

2.6.3Fe2+螯合能力測定由圖10得知,櫛江珧粗多糖具有一定的金屬離子螯合能力。在濃度范圍0.025～0.8 mg/mL內,隨著多糖濃度的增加,金屬離子螯合能力呈上升趨勢(IC50=0.29 mg/mL),在0.8～4.0 mg/mL范圍內,金屬螯合能力趨向穩定。在濃度為4.0 mg/mL時,粗多糖金屬離子螯合能力為82.79%。由此可見,櫛江珧粗多糖是很好的金屬離子螯合劑。蔣長興等[34]發現青蛤多糖高濃度時對金屬離子的鰲合能力較強,當粗多糖濃度為4.0 mg/mL時,金屬離子的鰲合能力為95.1%。

圖10　櫛江珧粗多糖的Fe2+螯合能力Fig.10　Chelating effects of CAPPS on Fe2+ iron

3　結論

本研究通過單因素實驗和響應面優化實驗設計,得出了提取櫛江珧粗多糖的最佳提取工藝:提取溫度94 ℃,提取時間215 min,液固比34∶1 (mL/g)。在此條件下,櫛江珧粗多糖的得率為18.37%。通過基本組成分析,發現櫛江珧粗多糖中總糖含量為94.39%、蛋白含量為2.8%,糖醛酸為0.63%,硫酸基含量0.08%。通過紅外光譜掃描分析和氣相色譜分析,表明該粗多糖主要單糖組分是葡萄糖?？寡趸詼y定結果表明櫛江珧粗多糖具有一定的超氧自由基清除活性、羥基自由基清除活性和金屬螯合能力。本文為櫛江珧多糖活性研究以及活性與成分、結構的關系探討提供理論依據。

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