高效液相色譜法測定紅小丑魚中蝦青素和葉黃素含量

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(1.汕頭大學理學院,廣東汕頭 515063; 2.福建省水產研究所,福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室,福建廈門 361013)

蝦青素(Astaxanthin)化學名稱為3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素,是一種類胡蘿卜素,具有脂溶性和水溶性,易溶于丙酮、醚、氯仿、苯、二硫化碳等有機溶劑,50 ℃以上可溶于水[1]。魚類和甲殼類喂養蝦青素一段時間后著色效果明顯,其對蝦青素的吸收和積累能力比葉黃素、玉米黃質等其它色素強,尤其是血鸚鵡、錦鯉、金魚等紅色系觀賞魚[2-3]。蝦青素對魚蝦貝類的生長和代謝有重要的作用,食用了含有蝦青素的飼料后,其免疫力、活力都顯著增強[4-6]。因而蝦青素在市場上的應用十分廣泛,魚類飼料添加劑,化妝品,保健品,醫藥方面都有所涉及[7]。目前,蝦青素主要從紅球藻和酵母中獲取[8]。

葉黃素(lutein)化學名稱:3′3-二羥基-α-胡蘿卜素,不溶于水,易溶于油脂和有機溶劑。研究表明,葉黃素經動物體內消化、吸收、轉移、酯化后在皮膚、肌肉等組織中沉積[2],也可以轉化為蝦青素沉積在組織內[9],是一種優良的抗氧化劑,有助于預防人體衰老。葉黃素是眼睛晶狀體唯一存在的類胡蘿卜素,缺少可能增加老年性黃斑病及白內障等疾病的發生[10]。

紅小丑魚(Amphiprionfrenatus)自身無法合成蝦青素和葉黃素,只能從食物中攝取以滿足生長發育需要[11]。蝦青素是一種紅色的增色劑,是類胡蘿卜素的代謝產物,可以增艷魚體表顏色,改善市場上人工養殖的觀賞魚顏色暗淡問題。目前測定水產動物體表色素含量多使用分光光度法[12-13]、柱層析法、薄層色譜法[14-16],但是這些方法存在靈敏度、準確性差等問題,而高效液相法操作簡便、準確性和靈敏性高。趙艷等[17]通過優化樣品皂化提取條件以及色譜分析條件測定巴沙魚中的黃體素和玉米黃質。李歡等[18]選擇丙酮/石油醚(v/v=4/3)作為提取劑,優化洗脫條件和色譜分離條件測定大黃魚皮膚中葉黃素、角黃素和蝦青素。本實驗中小丑魚皮膚和鰭部組織含有少量的脂肪,在趙艷和李歡等[17-18]實驗基礎上減少皂化過程,對提取溶劑比例、氨基柱固相萃取以及色譜條件進行優化,建立簡單快速的測定海洋觀賞魚體內色素的方法,為檢測海洋觀賞魚類體表增色效果提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紅小丑魚12周齡,未成熟,體長(3.5±0.3) cm,體重(1.1±0.2)g,福建省水產研究所飼養;蝦青素(純度不低于97%)美國Sigma公司;葉黃素(純度不低于98%)美國ChromaDex;丙酮、甲基叔丁基醚(MtBE)、甲醇、乙腈均為色譜純;2,6-二叔基對甲酚(BHT)分析純。

Alliance 2695高效液相色譜儀2487紫外檢測器,ENPOWER色譜管理系統，美國Waters公司;SPE型萃取裝置美國安譜(上海)公司;LC-NH2固相萃取小柱(500 mg,6 mL)北京同創翔運同創科技有限公司;MTN-2800氮吹儀天津奧特賽恩斯公司;SY-2000型旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;KQ5200B型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;FA135S型電子分析天平北京京科瑞達科技有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1類胡蘿卜素的提取魚皮膚和魚鰭部組織用剪刀剪碎,稱取0.5 g,置于研缽中,每次加入5 mL丙酮反復研磨提取類胡蘿卜素,將所得的溶液吸入40 mL離心管中,最終提取試劑定容至10 mL,繼續往 離心管中加入5 mL甲基叔丁基醚(MTBE),參照Li[24]的方法加入純水10 mL。渦旋30 s,高速離心機3000 r/min,離心5 min,此時溶于水的雜質在離心管最底層,旨在除去水溶性雜質。用吸管吸取上層黃色有機相,轉移至雞心瓶中,40 ℃旋轉減壓蒸干。

1.2.2提取液的凈化和濃縮根據李歡等[18]方法,對實驗條件進行優化。LC-NH2小柱預先以5 mL乙腈活化,真空抽干備用;用4 mL的丙酮沖洗蒸干的50 mL雞心瓶底部和內壁,將沖洗液倒入預先活化的氨基小柱中上樣,真空泵控制洗脫流速為1 mL/min,除去殘余脂類及部分其他雜質,再用5 mL正己烷淋洗氨基柱,洗掉脂肪和部分雜質,除去淋洗液,最后用10 mL乙腈洗脫氨基柱,收集洗脫液40 ℃旋轉蒸干,2 mL的甲醇定容。定容液經0.22 μm微孔有機膜過濾,供HPLC分析用。以上所有操作都應避強光操作。

1.2.3標準溶液的配制蝦青素和葉黃素的標準儲備液:分別稱取5 mg蝦青素和葉黃素標準品,用甲醇溶解并定容至50 mL的容量瓶中,超聲輔助溶解,得到100 μg/mL標準品儲備液,加入0.1 g BHT充氮密封置于-20 ℃避光保存。

將標準儲備液用甲醇稀釋制備成濃度梯度為1.0、0.5、0.2、0.05、0.02 μg/mL混合標準溶液。

1.2.4HPLC條件

1.2.4.1波長的選擇色譜柱:ZORBAXEclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min柱溫:25 ℃;檢測器:紫外檢測器,波長430、435、440、455、460、470、475 nm;進樣體積:10 μL;流動相:甲醇:水(98∶2,v/v),等度洗脫。

1.2.4.2流動相的選擇色譜柱:ZORBAXEclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流速:1.0 mL/min；柱溫:25 ℃;檢測器:紫外檢測器,波長475 nm;進樣體積:10 μL;流動相:乙腈∶甲醇(9∶1，v/v)，甲醇∶甲基叔丁基醚(8∶2，v/v)，乙腈∶甲基叔丁基醚(8∶2，v/v)，乙腈∶甲基叔丁基醚(9∶1，v/v)，乙腈∶甲基叔丁基醚(3∶1，v/v)，甲醇∶水(98∶2，v/v)等度洗脫。

2　結果與分析

2.1　色譜條件的選擇

2.1.1波長的確定有研究表明,含有蝦青素的紅色系魚類體內色素在可見光區(400～750 nm)有1～2個吸收峰[19],本實驗通過對蝦青素和葉黃素的標準品用分光光度計在350～700 nm進行總波長掃描,結果顯示蝦青素的最大吸收波長區為470～476 nm,葉黃素的最大吸收區為444～445 nm,見圖1a和圖1b?？疾炝?30、435、440、455、460、470、475 nm七個波長條件下蝦青素和葉黃素標準品的出峰效果。采用高效液相色譜對以上七個波長進行檢測,結果發現475 nm時,標品的峰面積最大。

圖1　標準品在350～700 nm波長處吸光度值Fig.1　The absorbance value of 350～700 nm注:a.蝦青素;b.葉黃素。

2.1.2流動相的選擇實驗選用極性較強的有機溶劑(甲醇、乙腈)作為流動相,使蝦青素和葉黃素得到很好的分離,有研究報導[18],流動相為乙腈/甲醇(9∶1,v/v)時,其余色譜條件同1.2.4,蝦青素和葉黃素可以達到極佳的分離效果,有關實驗表明,在流動相中加入少量的甲基叔丁基醚對類胡蘿卜素的洗脫分離有促進作用[17]。由此本文比較了6種流動相乙腈∶甲醇(9∶1,v/v)、甲醇:甲基叔丁基醚(8∶2,v/v)、乙腈∶甲基叔丁基醚(8∶2,v/v)、乙腈∶甲基叔丁基醚(9∶1,v/v)、乙腈∶甲基叔丁基醚(3∶1,v/v)、甲醇:水(98∶2,v/v)對蝦青素和葉黃素的分離效果,實驗結果表明:流動相為乙腈/甲基叔丁基醚時,蝦青素不能洗脫分離出來;流動相為甲醇/甲基叔丁基醚時,葉黃素的峰型尖銳,達到理性的分離效果,但是蝦青素的峰形分叉;流動相為甲醇∶水(98∶2,v/v)時,葉黃素和蝦青素都能被洗脫分離,達到理想的分離效果,可能由于蝦青素和葉黃素的分子結構中含有醇羥基以及氧元素,與水、醇有較強的氫鍵結合力[20],利于洗脫分離。最終確定流動相為甲醇∶水(98∶2,v/v),此時各色素成分達到基線分離,出峰時間快,峰型尖銳,對稱性好,無明顯基線波動,見圖2。

圖2　蝦青素和葉黃素標準品475 nm處的色譜圖Fig.2　HPLC chromatogram of mixed astaxantin, lutein standards at the wavelength of 475 nm

2.2　前處理條件的優化

2.2.1提取劑溶液比例確定對含有水分的紅小丑魚組織樣本采用水溶性大和毒性較小的丙酮作為提取劑,再使用甲基叔丁基醚進行液液萃取將色素物質轉移至醚中[21],最后加入純水,常溫下4000 r/min離心,可以將可溶于水的雜質分離出來,同時可以形成界限分明的色素層、有機相層和水層[22]。由表1可知，除3#與10#外，丙酮和甲基叔丁基醚比例比例小于2.5,純水和甲基叔丁基醚大于2時,有機溶液才能出現分層,丙酮、甲基叔丁基醚和純水比例為2∶1∶2時,有機溶劑色素層界限清晰,色素帶寬度適中。為避免水分過多進入分離的色素中,此比例是達到分層要求時加入的最少水量。提取時所用丙酮的量及液液萃取時所用的甲基叔丁基醚、純水三者比例不同,最終色素分層效果也不同,可能由于有機相在彼此的分配系數不同,加入不同量的甲基叔丁基醚和水使水相和有機相的比重達到一定的數值,溶液就出現了明顯的分層。

表1　不同比例萃取劑色素分層結果Table 1　Pigment layered phenomenon of different proportio extracting agent

2.2.2洗脫劑用量的選擇樣品取自于紅小丑魚鰭和皮膚,會有少量的雜質和脂肪,取6份等量同批次的樣品,處理方法同1.2.1,色譜條件選擇1.2.4,提取液可以通過LC-NH2小柱進行脫脂,再用洗脫液將色素物質從LC-NH2小柱上洗脫下來,過量的洗脫液會將雜質物質洗脫出來同時造成有機溶劑的浪費,少量的洗脫體積不能將目標色素物質洗脫完全,造成測定結果偏低。因此,本實驗通過使用不同洗脫體積洗脫色素物質,測定回收率,確立最適洗脫體積,結果如圖3所示。

圖3　不同洗脫體積下的回收率Fig.3　The recovery percent under different volumes of solvents

表2　線性范圍及檢出限Table 2　Calibration and limit of detection

實驗結果表明,在一定的范圍內,色素的回收率隨著洗脫體積的增多而增多,蝦青素的回收率在洗脫體積為8、10 mL時變化不明顯,洗脫體積超過10 mL后蝦青素和葉黃素回收率出現小幅度下降,可能是洗脫體積增加,濃縮損耗大。保證最高回收率的同時,洗脫和濃縮時間最短,所以本實驗應選擇10 mL的洗脫體積。

2.3　線性與檢出限、回收率和精確度

將蝦青素、葉黃素系列混合標準溶液,按照1.2.4色譜條件下,以峰面積對質量濃度繪制標準曲線。以3 倍信噪比計算檢出限,線性方程、檢出限如表2所示。

向空白樣品(不含類胡蘿卜素的魚類肌肉)中添加0.5、2.5、5 μg/g三個水平的標準樣品,每個水平6次重復,前處理方法同1.2.1,按照1.2的實驗條件進行樣品回收率的測定,結果顯示蝦青素、葉黃素的加標回收率分別為79.92%～90.32%、78.51%～97.60%，平均回收率分別為86%、85%。相對標準偏差(RSD)分別為6.26%～7.07%、10.79%～13.41%,均小于15%,符合實驗要求,結果見表3。

表3　加標回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3　Spike recoveries and relative standard deviations(n=6)

2.4　紅小丑魚樣品中色素的測定

按照上述方法取紅小丑魚皮膚和鰭0.5 g進行定性定量的測定。利用液液萃取提取色素方法和LC-NH2固相萃取柱,按照1.2實驗方法,對紅小丑魚皮膚和鰭樣品進行了檢測,由圖4可知,出峰時間分別為5.519、6.848 min,分別與蝦青素和葉黃素標準品的檢出時間相近,因此判定紅小丑魚體表組織含有蝦青素和葉黃素。由表4可知,皮膚中蝦青素含量略高于鰭,但在皮膚中沒有檢測到葉黃素,而在鰭中有檢測出葉黃素。崔培等[23]研究發現錦鯉等淡水魚可以將玉米黃質、葉黃素等類胡蘿卜素轉化為蝦青素,此外蝦青素也會通過氧化或代謝轉化為其他物質。因此鰭中少量存在的葉黃素可能是魚體將部分蝦青素代謝轉化成葉黃素的結果。

圖4　紅小丑魚樣品中色素的色譜圖Fig.4　HPLC chromatogram of pigment in A.frenatus

樣品含量(μg/g)蝦青素葉黃素皮膚3 76±0 11未檢出鰭3 03±0 610 52±0 01

3　結論與討論

本文以紅小丑魚的體表組織為實驗材料，通過對樣品前處理條件的優化，確定以丙酮-甲基叔丁基醚-純水(2∶1∶2)為液液萃取溶劑提取色素，LC-NH2固相萃取小柱洗脫液體積為10 mL，此條件下蝦青素的平均回收率為86%、葉黃素的平均回收率為85%。當檢測波長為475 nm，流動相為甲醇-水(98∶2，v/v)時，蝦青素和葉黃素的分離度較好。本方法用于小型海洋觀賞魚色素檢測時,精密度和準確度較高,能為研究觀賞魚類體色變化規律提供理論方法。同文獻[17-19]報道高效液相測定魚類色素相比,本研究直接采用了毒性較低的丙酮作為提取劑,并以甲基叔丁基醚作為萃取劑快速提取色素,減少了前處理過程中色素的損耗,同時采用了甲醇和水作為單一流動相代替線性梯度流動相[24],簡化了操作步驟。此方法適合用于脂質含量較少的小型魚類體內色素的測定。

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