基于色譜質譜聯用技術分析紐荷爾臍橙果汁及其果酒的香氣成分和苦味物質

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(1.贛南師范大學臍橙學院,江西贛州 341000; 2.贛州出入境檢驗檢疫局,江西贛州 341000; 3.江西省檢驗檢疫科學技術研究院,江西南昌 330000; 4.國家臍橙工程技術研究中心,江西贛州 341000)

柑橘類水果是江西省獨具特色的農產品,其中以贛南臍橙最負盛名,據贛州市果業局統計,截止2014年,贛州市臍橙種植面積達168萬畝,總產量達122萬噸,總產值達96億美元[1]。贛州市栽種的臍橙品種90%是紐荷爾臍橙(Citrussinensis(L.)Osbeck),其原產于美國,果實肉質細嫩,化渣多汁。芳香物質占臍橙果實鮮重的0.001%～0.01%,其種類繁多并隨著果實的成熟而變化,是評價果實風味的重要指標[2]。張涵、唐會周、喬宇等[3-5]通過不同的萃取方法分別研究了柑橘果皮、果實及果汁的香氣成分。

我國的臍橙大都以鮮食為主,加工用果僅占5%左右,其中大部分經過簡單加工成水果罐頭,果肉鮮食并不明顯的苦味一旦經制汁、加熱以及儲藏,無苦味的前體物質大量轉化為苦味物質[6-7],會使加工產品帶有明顯的后苦味,比如果實中原無苦味的檸檬苦素A-環內酯(Limonoate A-ring Lactone)在酸性條件和檸檬苦素D環內酯水解酶的催化下,轉變成了具有強烈苦味的檸堿[8]。鄔應龍等[9]研究了榨汁溫度、熱處理、過濾等加工工藝對柑橘類果汁主要苦味成分的影響。楊文俠[10]以臍橙為原料釀造干型臍橙果酒,并展開活性炭脫苦實驗,獲得較為理想的效果;Selli等[11-13]對土耳其柑橘品種和Moro甜橙釀造的果酒中的香氣組分進行研究。本文采用頂空固相微萃取技術提取紐荷爾果汁及果酒中的香氣成分,通過氣相色譜質譜聯機分析其主要成分;采用QuEChERS方法凈化果汁及果酒,通過液相色譜質譜聯機分析其中苦味物質的成分,以期能夠找到相比于傳統的感官評價法,從香氣組成和苦味組成綜合評價果汁及果酒的質量。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

紐荷爾臍橙采摘自贛州市信豐縣臍橙生產基地;白砂糖上海國藥試劑集團,分析純;葡萄酒型干酵母、高活性干酵母BV818安琪酵母股份有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)上海安譜實驗科技股份有限公司,凈化填料,主要用于去除脂肪酸、有機酸、極性色素以及糖類。

WJE2802D榨汁機美的(Midea);固相微萃取裝置美國Supelco公司;50/30 μm DVB/CAR on PDMS纖維萃取頭美國Supelco公司;7890A-5977氣相色譜質譜聯用儀美國安捷倫科技有限公司;1290-6495液相色譜質譜聯用儀美國安捷倫科技有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1果汁和果酒的制備紐荷爾臍橙果汁:采摘充分成熟且色澤鮮艷、無腐爛、無病蟲害的臍橙果實洗凈,剝皮榨汁過濾,取濾液,測得可溶性固形物含量為15%,總酸為0.8%。

紐荷爾臍橙果酒[12]:按20 g/L糖產生1%的酒精計算所需加入糖量,將白砂糖溶解煮沸過濾,調入殺菌后的果汁中,使臍橙果汁中糖含量達到20%;將酵母按1∶20加入到2%的白砂糖溶液中,40 ℃保溫復水15 min后于30 ℃培養1.5 h活化;將活化好的酵母按0.15%比例接入含糖量為20%的臍橙果汁中,混合均勻,在25 ℃下恒溫發酵;果酒中酒精含量趨于穩定時,分離上層酒液與酒腳,得到臍橙原酒;加入0.05%單寧和0.03%明膠對原酒進行澄清,加入0.3%活性炭,25 ℃ 150 r/min處理2 h進行脫苦處理。將澄清脫苦后的果酒常溫放置一年后得到陳釀果酒,測得果酒的酒精度(20 ℃,CV%):(11.5±0.5) g/L,總糖(以葡萄糖計)≤4.0 g/L,總酸:4.0～6.0 g/L。

1.2.2香氣成分測定萃取:將安裝好萃取頭的手動萃取裝置插入氣相色譜進樣口,設定進樣口溫度270 ℃,老化60 min。準確移取6 mL果酒(果汁)于15 mL螺紋頂空進樣瓶中,加入磁力轉子,用隔墊蓋子密封,將進樣瓶置于磁力加熱平臺中,設置加熱溫度60 ℃,轉速800 r/min,平衡20 min。平衡后,將老化后的萃取頭刺穿隔墊,調整高度,推出纖維頭,置于液面上方2 cm,萃取吸附40 min,抽回纖維頭,將手動萃取裝置插入GC進樣口,解析3 min。

儀器條件:采用氣相色譜質譜聯用儀,色譜柱型號HP-5MS,進樣口溫度250 ℃,載氣流速1.2 mL/min,1∶1分流進樣。升溫程序:起始柱溫40 ℃,保持1 min,以6 ℃/min的升溫速率上升到250 ℃,保持10 min。電離方式EI,電離能量70 eV,離子源溫度230 ℃,質譜的掃描范圍為(33～400)AMU/S,檢索譜庫為NIST11。

1.2.3苦味物質成分測定凈化方法:移取果汁(果酒)液1 mL于15 mL離心管中,加入9 mL去離子水稀釋,置于渦旋混合器上混勻。移取稀釋液5 mL置15 mL離心管中,加入PSA凈化填料120 mg,高速渦旋混合2 min,置于8000 r/min離心機中離心5 min,取上清液過膜上機。

儀器條件:采用液相色譜質譜聯用儀,色譜柱型號為ZORBAX SB-C18 4.6 mm×100 mm,1.8 μm。液相條件:溶劑A純水,溶劑B乙腈,初始平衡濃度90% A、10% B,流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃。0～1 min溶劑A梯度變為70%,溶劑B梯度變為30%;1～4 min溶劑A梯度變為25%,溶劑B梯度變為75%,并保持1 min;質譜條件如表1所示。

1.3　數據處理

香氣成分定性:通過氣相色譜質譜聯用儀采集到香氣的質譜數據,通過自動積分程序積分每個峰,后采用Mass Hunter軟件中的物質定性程序,匹配NIST 11質譜譜庫。程序會根據內置的運算規則,比對質譜的碎片離子峰,輸出可能的化合物。選擇與譜庫匹配度最高即得分最高的化合物作為該峰的定性化合物;定量:通過自動積分程序得到每個色譜峰的面積,所有峰的面積之和作為總面積,單個峰的面積除以總面積可得所占百分比,即通過面積歸一化法計算香氣成分的含量,每組樣品測定三次取平均值。

表1　苦味物質的質譜條件Table 1　Mass spectrometric conditions for bitter substances

苦味物質定性:通過液相色譜質譜聯用儀采集到四種標準物質的質譜數據,保留時間和二級質譜離子對,若樣品中在對應保留時間出現對應的離子對即能定性樣品中含有該苦味物質;定量:配制不同濃度標準物質,通過Mass Hunter計算標準曲線,同時定量樣品中的含量,每組樣品測定三次取平均值。四種苦味物質標準曲線方程分別為:橙皮苷(CPG)Y=636389.6X-6366.7,橙皮素(CPS)Y=2072426.3X-991.2,檸檬苦素(NMKS)Y=139042.9X+306.5,諾米林(NML)Y=412129.6X-95.7。

2　結果與分析

2.1　香氣成分測定

通過氣相色譜質譜儀檢測得到紐荷爾臍橙果汁、果酒總離子流圖,如圖1、圖2。

圖1　紐荷爾臍橙果汁(XZ-QC)香氣成分總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of Newhall navel orange juice(XZ-QC)

圖2　紐荷爾臍果酒(ZCNHE)香氣成分總離子流圖Fig.2　Total ion chromatogram of Newhall navel orange wine(ZCNHE)

通過Mass Hunter數據分析軟件匹配NIST 11譜庫,比對碎片離子豐度以及相似度,確定其香氣成分,同時采用面積歸一化法確定其相對含量,如表2所示。

紐荷爾臍橙果實中的芳香物質,如醇、酮、萜烯等是其成熟過程中形成的次生代謝產物,它們以一定比例構成了臍橙特有的香氣特征。由表2可知,臍橙果酒、果汁中共鑒定出香氣成分54種,其中酯類化合物12種,萜烯類化合物17種,醛類化合物14種,醇類化合物8種,其他化合物3種。

表2　紐荷爾臍橙果汁、果酒的香氣成分及含量Table 2　Aroma components in Newhall navel orange juice and wine

續表

注：-表示未檢出。

果酒中鑒定化合物27種,其主要成分含量從高到低依次為辛酸乙酯(23.54%)、4-萜烯醇(13.45%)、芳樟醇(8.54%)、苯乙醇(8.45%)、己酸乙酯(7.38%)、癸酸乙酯(6.64%)、香茅醇(5.72%)、十六酸乙酯(5.41%),占總含量的79.13%。臍橙釀酒過程中酵母菌代謝糖類會生成乙醇和二氧化碳,同時也會產生很多副產物,從各類物質的來源來看,醇類主要來源于發酵、氨基酸的轉化以及亞麻酸降解物的氧化,其中多數對酒的香氣有不良的影響;酯類主要來源于果實中脂肪酸與醇類通過輔酶A形成,即醇?；D移酶途徑,絕大多數酯類具有令人愉快的香氣。香氣中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、油酸乙酯分別為C6～C18偶數碳鏈脂肪酸與乙醇酯化生成的高級脂肪酸乙酯。碳鏈長度在C4～C10的乙酯類物質具有迷人的果香味[14],比如己酸乙酯具有較強烈的菠蘿、香蕉的水果香氣,葵酸乙酯具有椰子型香氣;隨著碳鏈長度的增長酯類會產生像肥皂泡一樣的氣味,當碳鏈長度達到C16～C18時,會有陳油香味,并且可以增加酒體的醇厚感和后味,降低酒中的干澀味[15]。辛酸乙酯是濃香型白酒中重要的呈香物質[16],具有杏、香蕉、菠蘿等果香氣,其香氣強度(OAV)在酯類中僅次于己酸乙酯,嗅覺識別閾參考值為127 μg/L[17],是臍橙酒果香的主要呈味物質。含量第二的4-萜烯醇又稱4-松油醇,是單環單萜烯醇,具有辛香、木香和百合香氣,是茶樹油的主成分和常用的日用香料之一。芳樟醇又名沉香醇,是鏈狀萜烯醇,純種的芳樟葉油有非常清新而強烈的花香香氣,似剛開放的鈴蘭花,也像剛采摘的茶葉香味,讓嗅聞到的人們聯想到柑橘、甜橙的果香,聞之令人愉悅欣快,其帶有一點令人神清氣爽的涼氣,似薄荷又似留蘭香,沒有各種萜烯生硬的木頭氣息[18]。苯乙醇是一種芳香高級醇,因其具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣,在橙花、風信子等多種花香型香精中大量使用,是酒精飲料中重要的高沸點香氣成分,廣泛存在于各種酒精飲料中[19]。李曉英從臍橙果酒中共鑒定出30種成分,主要香氣成分為苯乙醇、異戊醇、d-檸檬烯、2,3-丁二醇、乙酸乙酯、香葉醇、棕櫚酸乙酯等[20],這與本研究鑒定的物質不全相同,這是因為本實驗用臍橙果酒經過較長時間的陳釀,大部分都轉變為相應的酯類,這些醇、酸、酯類相互協調構成了酒中特有的果香和酒香。

表3　紐荷爾臍橙果汁、果酒中四種苦味物質含量Table 3　The content of four bitter substances in Newhall navel orange juice and wine

注：ND為未檢出。

果汁中鑒定化合物31種,其主要成分含量從高到低依次為D-檸檬烯(33.74%)、巴倫西亞橘烯(25.12%)、γ-芹子烯(4.98%)、2-已烯醛(4.17%)、β-蒎烯(3.67%)、β-芹子烯(3.50%),共占總含量的75.19%。Plotto A[21]與李曉英[20]的研究表明,檸檬烯、β-水芹烯、巴倫西亞橘烯為橙汁中主要的揮發性烯類成分,這與本實驗結果一致。林祥云[22]參照太陽光七色光譜原理,將自然界里各種氣味歸納成32個基本氣味,形成氣味輪,并具有“對角補缺”,“相鄰補強”的性質,其中柑橘香位列第三,屬于水果香的一部分,但又明顯區別于一般的水果香,其主要香氣成分是苧烯即檸檬烯,它與相鄰的芳樟醇、橙花醛相互調和,這些香氣有增食減疲的效果。D-檸檬烯又稱苧烯,是一種環狀單萜烯,廣泛存在于各種精油,特別是檸檬油和橙子油中,是一種低沸點、高蒸氣壓的頭香香料,留香時間很短,但香氣較強,具有令人愉悅的檸檬樣香氣并且性質活潑,可自動氧化成一系列的氧化單環單萜,如香芹醇和香芹酮。巴倫西亞橘烯為柑橘類水果特有成份,呈柑橘似香氣,天然存在于柑橘類水果和可可中。2-已烯醛又稱青葉醛、反式-2-已烯醛,呈濃郁新鮮水果、綠葉清香氣,天然存在于橙皮中。β-蒎烯為橙油中常見物質[23],楊君等[24]采用GC-MS和GC-O技術分析佛手精油,其中成分β-蒎烯呈現清香、果甜和松針味,并且具有很高的香氣稀釋值(FD)值,表明β-蒎烯在濃度極低的情況下仍具有強烈的香氣。

紐荷爾臍橙果汁和果酒中共同檢出的香氣成分有:2-已烯醛、芳樟醇、壬醛、香茅醇。壬醛是用于調配橙花、茉莉、玫瑰、鈴花的日用香精,具有柑橘、玫瑰的油脂果香氣味,香茅醇具有甜的玫瑰香氣,其香氣比香葉醇柔和,可用于調配玫瑰和鈴蘭等花香型日用香精[24]。

2.2　苦味物質測定

QuEChERS為果蔬中農藥多殘留樣品前處理方法,于2003年由Anastassiades M[25]提出,經改進先后成為美國官方分析方法(AOAC 2007.01)[26]及歐盟官方分析方法(BS EN:15662:2008)[27],本實驗將QuEChERS方法應用于果汁及果酒中的凈化,將N-丙基乙二胺固相吸附劑填料(PSA)加入液體中,用于去除樣品中的有機酸、色素和金屬離子,后用純水稀釋十倍,減少基質效應的影響。

紐荷爾臍橙果汁和果酒中橙皮苷(CPG)、橙皮素(CPS)、檸檬苦素(NMKS)、諾米林(NML)四種苦味物質的色譜圖見圖3。

圖3　四種苦味物質的色譜圖Fig.3　Chromatogram of four bitter substances

果汁及果酒中四種苦味物質的含量見表3,釀酒過程中檸檬苦素的含量由4.43 μg/mL降低為0.05 μg/mL,味覺上果酒相比于果汁少了明顯的后苦味。類檸檬苦素化合物是三萜類的植物次生代謝產物,主要存在于蕓香科和楝科植物中,比如臍橙、柑橘等,其中檸檬苦素和諾米林都為類檸檬苦素化合物,在柑橘果汁中含量超過6 mg/L則已不適宜飲用,所以它們是引起柑橘汁苦味的重要原因[28]。釀造過程中,檸檬苦素及其類似物諾米林通過酵母發酵、酶的作用等原因逐漸降解,轉變為沒有苦味的脫氫檸檬苦素及酸類[29],因此果酒中檸檬苦素的含量變低為0.05 μg/mL,諾米林在果酒中沒有檢測到。果汁中橙皮苷(13.4 μg/mL)和橙皮素(0.02 μg/mL)含量與果酒中橙皮苷(16.7 μg/mL)和橙皮素(0.08 μg/mL)的含量差異不大。

3　結論

本研究通過頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜聯用技術分析紐荷爾臍橙果汁及果酒的香氣成分,其中果汁中鑒定化合物31種,主要成分為D-檸檬烯(33.74%)和巴倫西亞橘烯(25.12%),果酒中鑒定化合物27種,主要成分為4-萜烯醇(13.45%)、芳樟醇(8.54%)、苯乙醇(8.45%)以及高級脂肪酸乙酯。通過液相-質譜聯用技術測定果汁、果酒中苦味物質含量,其中果汁中主要苦味物質為橙皮苷(13.4 μg/mL)、檸檬苦素(4.43 μg/mL)、橙皮素(0.02 μg/mL)、諾米林(0.07 μg/mL),果酒中主要苦味物質為橙皮苷(16.7 μg/mL)、檸檬苦素(0.05 μg/mL)橙皮素(0.08 μg/mL),果酒中沒有檢測到諾米林的存在,橙皮苷和橙皮素的含量沒有顯著變化。

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