凡納濱對蝦在二氧化碳麻醉無水?；钸^程中呼吸代謝及免疫的變化

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(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東湛江 524088；2.廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東湛江 524088)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)又稱南美白對蝦,肉嫩味美,具有較高的營養價值,深受國內外消費者的喜愛。凡納濱對蝦以鮮銷和冷凍加工為主,其中鮮活蝦大約是冷凍蝦價格的兩倍,因此凡納濱對蝦的?；钸\輸尤為重要。凡納濱對蝦的活體運輸方法主要有帶水?；詈蜔o水?；顑煞N形式,其中無水?；钸\輸操作簡便,運載量大,成本低,有利于遠距離的運輸,具有廣闊的前景。無水?；羁梢酝ㄟ^使用麻醉劑麻醉水產品,使其進入休眠狀態。由于二氧化碳(CO2)具有無毒、無殘留以及不影響水產品銷售的優點,因此CO2麻醉水產品進行無水?；畛蔀橐粋€研究熱點[1]。凡納濱對蝦殼較薄,易受外界應激影響造成傷亡,?；钸\輸難度大,對其無水?；钛芯旷r有報道。

呼吸代謝是動物能量代謝的基本生理活動,通過研究動物呼吸代謝能夠了解動物的代謝特征和適應外界環境條件的能力[2]。環境因子大幅度波動和代謝變化都會引起甲殼動物免疫系統變化,從而影響其健康狀況[3]。研究凡納濱對蝦無水?；畹暮粑x及免疫功能變化,了解其新陳代謝特點,有助于完善?；罴夹g,提高存活率。

本研究擬采用CO2麻醉凡納濱對蝦后于常溫下進行無水?；?探討無水?；钸^程中對蝦呼吸代謝酶活力及免疫參數的變化規律,為凡納濱對蝦高值化開發利用以及長途運輸提供依據。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

凡納濱對蝦誼林水產公司,隨機挑選體質健康、個體大小均一,約600尾凡納濱對蝦,質量(14.1±1.5) g,體長(13.2±0.5) cm,實驗前隨機分成6組,分別在6個65 L塑料箱內暫養2 h,提供循環水流,水溫24 ℃,鹽度16‰,溶解氧>5 mg/L;泡沫盒(45.3 cm×45.3 cm×5 cm)、空運專用箱子(49.8 cm×49.8 cm×31.5 cm)湛江機場服務公司;葡萄糖(Glucose,Glu)、檸檬酸、檸檬酸鈉均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

PHST-3F酸度計上海雷磁儀器廠;5810R冷凍離心機德國Eppendorf公司;Varioakan Flash全波長多功能酶標儀美國熱電公司;Cary 60紫外可見分光光度計安捷倫科技有限公司;HH·S21-8-S電熱恒溫水浴鍋上海滬粵明科學儀器有限公司;Countstar IC1000自動細胞計數儀上海睿鈺生物科技有限公司;CO2麻醉設備由CO2(99.9%)鋼瓶、減壓閥、氣石組成,自行組裝。

1.2　實驗方法

1.2.1凡納濱對蝦無水?；钐幚矸布{濱對蝦暫養2 h后使用循環冷水機以2 ℃/h 降溫,使水溫達到18 ℃,再以1 L/min的流量向水中通入CO2至pH6.0,將蝦轉移到預先鋪有PU海綿和冰的泡沫盒(45.3 cm×45.3 cm×5 cm)內,每個泡沫盒裝載凡納濱對蝦約100尾。將泡沫盒用充氧的塑料袋密封后,裝入空運專用箱子(49.8 cm×49.8 cm×31.5 cm),每箱裝載3盒,密封,置于28 ℃恒溫室下模擬凡納濱對蝦無水?；? h。以未處理暫養狀態下的凡納濱對蝦為對照組,實驗組分別在無水?；畹牡?、2、4、6 h以及置于水中充氧復蘇1 h后取樣。

1.2.2樣品采集

1.2.2.1對蝦鰓的采集用吸水紙吸干對蝦的體表水分后,在冰盤上迅速解剖,取鰓,裝入1.5 mL的離心管中,迅速放入-80 ℃冰箱保存。取0.1～0.3 g對蝦鰓組織,剪碎研磨,加入9倍的4 ℃生理鹽水(0.86%),制成10%組織勻漿液,恒溫4 ℃下,800×g離心10 min,取上清液分別測定己糖激酶(HK)、果糖磷酸激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和乳酸脫氫酶(LDH)等酶活力。

1.2.2.2對蝦血淋巴的采集取樣時,用1 mL無菌注射器,按照血淋巴與抗凝劑(檸檬酸鈉:1.32%(m/v)檸檬酸:0.48%(m/v)Glu∶1.47%(m/v))1∶1的比例,從隨機挑選的對蝦腹面血竇中采集血淋巴。由于單尾對蝦的血淋巴量不足以測定全部免疫指標,因此,將同一時間點的對蝦血淋巴兩兩合并。所取的抗凝血,一部分直接用于血淋巴細胞總數(THC)測定;另一部分在4 ℃,700×g離心20 min,所得上清液用于測定葡萄糖(Glu)和乳酸(LD)濃度、超氧化歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)活力。

1.2.3指標測定

1.2.3.1呼吸代謝指標測定Glu采用葡萄糖氧化酶法測定,LD采用比色法測定,PK、PFK、HK均采用紫外比色法測定,LDH采用微板法測定,SDH采用比色法測定[4-5]。

1.2.3.2免疫指標測定SOD采用羥胺法測定,POD采用比色法測定,血淋巴細胞總數(THC)使用細胞計數儀計數[4]。

1.3　數據統計與分析

實驗中所得結果以平均值±標準差表示(n=5),數據使用SPSS 22.0軟件進行差異性分析,通過單因素方差(One-way ANOVA)及Duncan多重比較分析處理。

2　結果與分析

2.1　無水?；顚Ψ布{濱對蝦Glu和LD濃度的影響

凡納濱對蝦無水?；钸^程中Glu和LD濃度的變化如圖1(Ⅰ)、(Ⅱ)所示。

從圖1(Ⅱ)可看出:無水?；钸^程中,對蝦血糖濃度下降且均低于對照(p<0.05),在第6 h,血糖濃度降到最低值5.11 mmol/L;復蘇后,血糖濃度有所上升,但仍顯著低于對照(p<0.05)。Lorenzon等[6]研究指出,當動物承受較長時間應激時,血糖會下降。根據Barrento[7]報道,黃道蟹在經過麻醉劑AQUI-S和浸泡冷海水處理后,血糖濃度呈現下降狀態。而在Trushenski[8]、Kuo[9]的研究中,經過低溫、低氧或者麻醉劑應激的凡納濱對蝦會出現高血糖癥。但本實驗中血糖濃度一直下降,說明經過CO2麻醉后無水?；钸^程中對蝦沒有出現高血糖癥,這可能是因為對蝦加快Glu消耗以及啟動代謝補償機制,以獲得更多能量來適應環境脅迫[10]。無水?；顥l件下對蝦體內Glu降低說明Glu的消耗加快。

從圖1(Ⅱ)可看出,無水?；顥l件下的對蝦體內LD濃度從0 h開始顯著高于對照組(p<0.05),2 h達到最大值后下降,但在第6 h的濃度約為對照的1.6倍;復蘇后,LD濃度仍顯著高于對照(p<0.05)。麻醉后對蝦體內的LD濃度較高,可能是CO2的刺激作用使對蝦LD濃度處于較高水平。因為CO2本身是一種應激介質,會擾亂水產品體內酸堿平衡,導致LD積累[1]。Weber等[11]研究使用不同麻醉劑麻醉Senegalese sole(SoleasenegalensisKaup 1858)的應激反應時指出,麻醉劑能使LD濃度升高。而在無水?；畹暮笃?對蝦進行無氧代謝繼續生成LD。Samet等[12]研究斑節對蝦(Penaeusjaponicus)以及Bernardi等[13]研究美國龍蝦(Homarusamericanus)的無水?；顣r,均認為LD是無氧代謝的最終產物。

圖1　無水?；顚Ψ布{濱對蝦中Glu和LD濃度的影響Fig.1　Effects of waterless transportation on Glu and LD concentration of L. vannamei注:不同的字母表示差異顯著(p<0.05),圖2～圖4同。

2.2　無水?；顚Ψ布{濱對蝦HK、PFK和PK活力的影響

糖酵解是生物體共同經歷的Glu分解代謝的前期途徑。HK、PFK和PK是糖酵解限速酶,具有調節糖酵解途徑的作用,而且這三種酶活力會根據代謝情況受到轉錄的控制[14]。無水?；顥l件下凡納濱對蝦HK、PFK和PK活力的影響如圖2(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)所示。

在無水?；顥l件中,對蝦鰓HK、PFK和PK活力均高于對照,HK在第4 h達到峰值,并顯著高于對照(p<0.05);PFK活力在第2 h后顯著高于對照組(p<0.05),并同樣在第4 h達到峰值;PK活力一直顯著高于對照(p<0.05),在第6 h達到最大值。復蘇后,HK和PK活力恢復到對照組水平。三種關鍵酶活力均高于對照,說明無水?；顥l件下對蝦糖酵解速度加快,這與血糖下降的結果相吻合。遭受溫度下降脅迫時,蝦(Farfantepenaeuspaulensis)大部分呼吸代謝酶活力會上升[15];在低氧條件下,凡納濱對蝦鰓中的HK、PFK轉錄表達上調[16-17];溫度突變會使凡納濱對蝦PK酶活力發生變化[18]。這些都說明在脅迫條件下,凡納濱對蝦調整糖酵解速度使其能適應變化[19],而糖酵解速度的加快是為了獲取更多能量[20]。無水?；顥l件下,對蝦的HK、PFK和PK活力升高說明凡納濱對蝦為了適應不良環境加快糖酵解速度以獲得能量。

圖2　無水?；顚Ψ布{濱對蝦HK、PFK和PK活力的影響Fig.2　Effects of waterless transportation on HK,PFK and PK activity of L. vannamei

2.3　無水?；顚Ψ布{濱對蝦SDH和LDH活力的影響

SDH是三羧酸循環中唯一嵌入到線粒體內膜的酶,直接連在電子傳遞鏈上,影響生物體的氧化磷酸化作用,是有氧呼吸的關鍵酶[14]。LDH可將丙酮酸轉化為LD,是無氧代謝的標志酶。凡納濱對蝦無水?；钸^程中SDH和LDH含量的變化見如圖3(Ⅰ)、(Ⅱ)所示。

無水?；顥l件下對蝦SDH活力呈現下降趨勢,在第2 h顯著低于對照組(p<0.05),活力下降約14%。而LDH活力一直顯著高于對照組(p<0.05),6 h后酶活力顯著比對照組高約55%。SDH活力的下降可以歸結于外源性應激[21],無水?；钸^程氧氣的供應不足以及其他不良因素使SDH活力下降。當有氧代謝受到抑制時,無氧代謝是主要的供能途徑。如凡納濱對蝦受到低氧應激時,LDH同工酶轉錄上調[22]。無水?；钸^程中對蝦有氧代謝減弱,無氧代謝加強,丙酮酸轉化為LD,釋放能量以繼續給機體提供能量。復蘇后,SDH和LDH活力都沒有恢復到對照組水平,與復蘇后LD濃度仍較高的結果相吻合,這可能與恢復時間較短或兩種酶的調控機制有關。

圖3　無水?；顚Ψ布{濱對蝦SDH、LDH活力的影響Fig.3　Effects of waterless transportation on SDH,LDH activity of L. vannamei

2.4　無水?；顚Ψ布{濱對蝦THC、SOD和POD活力的影響

血淋巴細胞在甲殼動物免疫系統中占重要地位,它主要承擔著細胞免疫[23]。THC在一定程度上反映機體的免疫應激能力或健康狀況[24]。由圖4(Ⅰ)可知,?；钸^程中THC先降低后升高,在第4 h下降到最低點后略有回升。環境的改變會使海洋甲殼動物的免疫系統發生改變,THC總是隨著甲殼動物自身的生理狀況和外界環境條件變化而變化[25]。研究表明,當凡納濱對蝦受到鹽度、銅離子、低氧或者溫度等脅迫時,THC會下降[26-27]。無水?；顥l件下THC顯著低于對照(p<0.05),復蘇后THC有所增加但仍顯著低于對照組(p<0.05),說明在無水?；顥l件下,對蝦的細胞免疫力有所下降。

SOD及POD都是甲殼動物體液免疫相關酶,其活力大小能反映機體的體液免疫機能。由圖4(Ⅱ)、(Ⅲ)可知,SOD與POD活力的變化一致:隨著?；顣r間延長,兩種酶活力增加。在第6 h,SOD活力比對照組高約56%。復蘇后,兩種酶活力與對照組沒有顯著差異。在?；畹? h,SOD和POD活力均顯著低于對照組,這可能是CO2麻醉應激導致的[28]。而SOD和POD活力上升可能是對蝦體內的氧化-抗氧化平衡沒有被打破,并出現呼吸爆炸,產生較多超氧陰離子,超氧陰離子的增多誘導SOD和POD活力的上升,以降低氧化損傷[28-29]。雖然無水?；钸^程中凡納濱對蝦的THC下降意味細胞免疫力下降,但SOD和POD活力上升說明體液免疫能發揮著清除自由基的作用[25]。復蘇后酶活力與對照沒有差異,說明在應激下對蝦的體液免疫沒有受到嚴重的破壞,在?；詈笃谝约皬吞K后都能正常發揮作用。Mercier等[30]在研究凡納濱對蝦在遭受到持續應激代謝與免疫變化時,同樣發現THC下降,SOD活力上升的情況。

圖4　無水?；顚Ψ布{濱對蝦THC、SOD和POD活力的影響Fig.4　Effects of waterless transportation on THC,SOD and POD activity of L. vannamei

3　結論

本文初步研究了二氧化碳麻醉凡納濱對蝦無水?；? h過程中的呼吸代謝及免疫變化規律,證明8 h?；钸^程中對蝦通過有氧代謝轉變為無氧代謝獲取能量,維持正常生理代謝;免疫相關酶SOD和POD活力升高,細胞免疫正常發揮作用。對蝦機體的正常運行,說明8 h的?；顣r長是可行的。本文可為對蝦?；顧C制提供理論參考。

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