苦丁茶多酚提取物對四氯化碳誘導小鼠肝損傷的改善作用及機制研究

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(1.重慶第二師范學院,重慶市功能性食品協同創新中心,重慶市功能性食品工程技術研究中心,功能性食品研發重慶市工程實驗室,生物與化學工程學院,重慶 400067;2.桂林醫學院公共衛生學院食品衛生與營養學教研室,廣西高校預防醫學重點實驗室,廣西桂林 541004)

肝臟是機體的重要器官,擔負營養和藥物新陳代謝的功能,能夠清除體內的毒素和細菌,具有很強的再生和修復能力[1]。物理和化學因素都可能導致肝損傷,進而影響肝臟的解毒功能,引起肝功能障礙,引發其他多器官功能失調,甚至導致肝衰竭,威脅生命[1-3]。

苦丁茶是一種特殊的類茶飲品,是由冬青科冬青屬的苦丁茶種常綠喬木樹葉制成[4]。作為一種天然飲品,苦丁茶在中國西南地區和華南地區比較普遍,常用來清熱消暑、生津止渴和潤喉止咳[5]。研究證實苦丁茶具有抑制氧化應激、預防炎癥和癌癥等活性功能[6-7],這與其含有的多酚類組分密切相關[8-9]?？喽〔瓒喾宇惢衔镏饕蔷G原酸及其衍生物[10]。有研究表明苦丁茶提取物對肝損傷有較好的抑制作用[11],所以其抗肝損傷成為研究熱點，但其在作用機制需要進一步的研究;同時,由于苦丁茶多酚物質的成分與綠茶多酚有所不同,綠茶多酚物質發揮生物活性作用的機制已有一定研究[11-12]，但苦丁茶多酚物質的相關研究還是不足。因此,本研究將針對苦丁茶多酚對四氯化碳誘導小鼠肝損傷進行研究,并對作用機制進行分析,研究結果將對苦丁茶多酚的深入應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

野生苦丁茶安國市祁珍養生食品有限公司;綠原酸標準品上海源葉生物科技有限公司;水飛薊素美國Sigma公司;天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)測定試劑盒、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)測定試劑盒、堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒、甘油三酯(TG)測定試劑盒、總膽固醇(TC)測定試劑盒、尿素氮(BUN)測定試劑盒、白蛋白(ALB)測定試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、一氧化氮(NO)測定試劑盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒南京建成生物工程研究所;IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ酶聯免疫試劑盒美國Biolegend公司;CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒德國Becton Dickinson公司;Trizol試劑、oligodT18、RNase、dNTP、MLV和PCR引物美國Invitrogen公司;其余試劑均為國產分析純;清潔級昆明小鼠60只(6周齡、雌雄各半),購于重慶醫科大學實驗動物中心,動物許可證SCXK(渝)2012-0001,在溫度(22±4) ℃、濕度50%±20%下飼養1周后進行實驗。

Biomate3S型紫外可見光分光光度儀、SimpliAmp梯度PCR儀、LUX多功能性酶標儀美國Thermo Fisher Scientific公司;ICEN-24R高速冷凍離心機杭州奧盛儀器有限公司;BX43生物顯微鏡日本奧林巴斯公司。

1.2　實驗方法

1.2.1苦丁茶多酚的提取純化取1 kg苦丁茶粉碎后加入9 L的純水,在90 ℃下水浴提取30 min后收集提取液,然后重復1次,收集2次的提取液后將提取液過大孔樹脂HP20,經過大孔樹脂吸附后,在2 mL/min速度下以70%的乙醇洗脫,得到苦丁茶多酚提取物(PEK)[13]。

1.2.2苦丁茶多酚的含量測定稱取一定量綠原酸標準品,加入去離子水配制成綠原酸標準液,然后吸取1.0 mL不同濃度的綠原酸標準液于25 mL的容量瓶中,再加入3.0 mL的Folin-Ciocalteu試劑沖劃分混合,待反應5 min后在容量瓶總加入4.5 mL的飽和Na2CO3溶液,加水定容后在30 ℃下避光反應30 min,最后在747 nm處測定吸光度值,繪制綠原酸的標準曲線[14]。將PEK進行梯度稀釋至10-4倍,按上述方法測定PEK的吸光度值,對照標準曲線計算PEK的多酚物質含量。

1.2.3動物實驗將小鼠平均分為5組,每組12只小鼠,雌雄各半,分別為正常組、模型組、水飛薊素灌胃組(陽性對照組)、PEK低劑量(50 mg/kg·bw)和高劑量灌胃組(100 mg/kg·bw)。正常組和模型組小鼠每天灌胃2 mL的生理鹽水;水飛薊素灌胃組每天灌胃0.2 mL水飛薊素溶液(100 mg/kg·bw);PEK低、高濃度組小鼠每天分別按濃度50和100 mg/kg·bw灌胃PEK溶液0.2 mL,實驗持續28 d。第28 d對除正常組外所有小鼠腹腔注射四氯化碳誘導劑(2 mL/kg·bw,CCl4∶橄欖油=1∶1,v/v)誘導急性肝損傷,然后對所有小鼠實施禁食,但允許自由飲水。禁食24 h后斷頸處死小鼠,解剖后心臟取血并取肝臟組織[15]。

1.2.4小鼠肝指數測定稱量小鼠的體質量和肝質量,按公式肝指數(%)=肝臟質量/小鼠體質量×100。

1.2.5小鼠血清水平測定將小鼠血漿在4000 r/min離心10 min后分離血清,使用AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN、ALB、SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px試劑盒測定小鼠血清相關生化指標的水平[15],每只小鼠的以上指標重復測定3次。

1.2.6小鼠血清細胞因子水平測定采用IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子測定試劑盒檢測1.2.3中所制備小鼠血清中細胞因子水平[15],每只小鼠的以上指標重復測定3次。

1.2.7肝組織病理學觀察取肝組織切塊,用10%的福爾馬林溶液固定,并用濃度為95%(v/v)的乙醇脫水,然后用二甲苯置換出肝組織內的乙醇,采用石蠟包埋后冷卻切片,采用HE染色法對切片進行染色,并在光學顯微鏡下觀察[16]。

研究對象來源于我院收治的85例腦卒中后焦慮抑郁患者,選取時間為2016年1月-2017年6月。其分組資料整理如下:對照組男女比例為27:15,平均年齡(55.3±6.7)歲。觀察組男女比例為28:15,平均年齡(55.6±6.2)歲。納入標準:所有患者經腦卒中診斷和抑郁評分確診為腦卒中后抑郁[2];簽署知情同意書。排除標準:卒中前存在精神心理疾病、中途退出、護理依從性差者。上述組間數據對比均保持同質性(P>0.05)。

表1　引物序列Table 1　Sequences of reverse transcription polymerase chain reaction primers used in this study

1.2.8RT-PCR實驗測定小鼠肝組織mRNA表達取小鼠的肝組織勻漿后用RNAzol提取肝組織的總RNA,然后將肝組織的總RNA濃度稀釋到1 μg/μL。取稀釋定量后的總RNA提取液2 μL,在其中依次加入1 μL的oligodT18、1 μL的RNase、1 μL的dNTP、1 μL的MLV酶和10 μL的5×buffer,在條件37 ℃、120 min,99 ℃、4 min,4 ℃、3 min合成cDNA。然后以反轉錄-聚合酶鏈反應法擴增Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT、GSH-Px、NF-κB-p65、IκB-α、iNOS和COX-2的mRNA表達(見表1),同時以持家基因GAPDH作為內參照按同樣條件進行擴增。最后用含1%溴化乙錠瓊脂電泳檢查PCR擴增產物[17]。半定量分析按以下公式計算:表達相對模型組倍數=(樣品組表達強度÷對應組GAPDH表達強度)÷(模型組表達強度÷模型組GAPDH表達強度)。其中樣品組指正常組，PEK低劑量組、PEK高劑量組和水飛薊素灌胃組。

1.3　數據統計

使用SAS 9.1統計學軟件對平行實驗結果進行one-way ANOVA方法分析,判斷各組數據在p<0.05水平上是否具有顯著性差異。

2　結果與分析

2.1　苦丁茶多酚提取物的含量

按照1.2.2節方法繪制綠原酸標準液的標準曲線,得出標準曲線的回歸方程為Y=0.215X-0.002(R2=0.998),Y為綠原酸濃度,X為吸光度值。通過標準曲線計算可知提取純化后的苦丁茶多酚(綠原酸計)的含量達到71.3%。

表2　各組小鼠的肝指數Table 2　Liver index of mice in different groups

注：字母不同表示組間存在顯著差異(p<0.05),表3～表7同。

2.2　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝指數的影響

肝臟是機體的重要器官,肝臟出現損傷后,將出現肝指數提高的現象,四氯化碳作為實驗性肝損傷誘導劑,可使動物的肝指數增大,通過計算肝指數可以快速判斷肝損傷程度[18]。如表2所示,模型組小鼠的肝指數顯著高于其他各組(p<0.05),水飛薊素灌胃組小鼠的肝指數顯著低于模型組,隨著PEK濃度的提高,PEK灌胃組小鼠的肝指數顯著下降(p<0.05)。

2.3　苦丁茶多酚提取物對小鼠血清生化指標的影響

AST和ALT是重要的轉氨酶,常作為肝功能檢查的指標,用來判斷肝臟是否受到損害,主要存在于肝細胞漿內,是一種重要的轉氨酶,肝細胞壞死會導致ALT和AST在血清內增加[19]。四氯化碳可導致肝組織發生嚴重的脂質過氧化反應,造成干細胞壞死和組織纖維化,此過程中肝組織的ALP水平急劇上升[20]。四氯化碳誘導的肝損傷能使脂肪酸向肝組織內轉移,造成肝組織的TG含量的上升,同時TC也是肝損傷造成脂質過氧化的表現,肝損傷發生后由于脂質過氧化TG和TC含量均增加[21]。肝損傷后也進一步對腎功能造成影響,使蛋白質代謝的產物BUN在機體中的含量升高,同樣由于肝損傷對機體合成、運輸和釋放ALB的影響,機體的ALB含量也下降[22]。

由表3可知,與正常組相比,四氯化碳處理組小鼠血清中AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平顯著升高(p<0.05),而ALB水平顯著降低(p<0.05),表明四氯化碳對小鼠肝組織造成了損傷,造模成功。PEK灌胃可以顯著緩解四氯化碳造成的AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平升高和ALB水平降低(p<0.05),且高濃度的PEK效果更為明顯,其中高濃度的PEK灌胃可以使BUN和ALB水平與藥物水飛薊素灌胃達到相似的效果。

表3　各組小鼠血清AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN和ALB的水平Table 3　AST,ALT,ALP,TG,TC,BUN and ALB serum levels of mice in different groups

表4　各組小鼠血清SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px的水平Table 4　SOD,NO,CAT,MDA and GSH-Px serum levels of mice in different groups

表5　各組小鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平的影響Table 5　IL-6,IL-12,TNF-α and IFN-γ serum cytokine levels of mice in different groups

2.4　苦丁茶多酚提取物對小鼠血清SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px水平的影響

四氯化碳在肝臟將引起強烈的氧化反應,提高動物體內SOD、CAT和GSH-Px的活力是通過酶性抗氧化達到抗氧化作用的主要機制[21]。SOD、CAT和GSH-Px是機體內重要的抗氧化酶,而且CAT和SOD具有協同作用,可增強抗氧化效果[23-24]。GSH-Px也是一種與機體氧化線管的酶,可催化過氧化氫分解,起到保護細胞膜,避免細胞損傷的作用[25]。MDA是體內脂質過氧化產生的代謝產物,肝損傷后MDA也在肝組織內大量積累[21]。一氧化氮及其氧化產物能使細胞表面的磷脂和蛋白發生損傷,導致機體組織出現炎性滲出和組織損傷[26]。另外,一氧化氮還能使氧化應激反應加強,導致細胞毒性進一步加劇從而使肝損傷加重[27]。

由表4可知,正常組小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px活力最高,而NO、MDA含量最低;而模型組小鼠的SOD、CAT、GSH-Px活力最低,NO、MDA含量最高,表明肝損傷可顯著導致SOD、CAT、GSH-Px活力降低和導致NO、MDA含量升高。PEK可使肝損傷小鼠血清中的SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px水平接近于藥物水飛薊素的效果,且PEK高劑量灌胃使血清中的SOD、CAT、MDA和GSH-Px水平與水飛薊素灌胃組小鼠無顯著差異(p>0.05)。由此可以看出,PEK可以提高肝損傷小鼠血清的抗氧化酶活力,起到改善肝損傷的作用。

2.5　苦丁茶多酚提取物對小鼠血清細胞因子水平的影響

IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ是重要的細胞炎癥因子,機體出現炎癥反應后其含量在體內大幅度上升[23]。IL-6是一種參與機體免疫應答的因子,IL-6的含量升高時可引發內臟發生功能性損害[28]。同時IL-6還能使T淋巴細胞發生分化、增殖和提升抗體含量,從而加劇機體炎癥反應[29]。IL-12也是一種在體細胞過度凋亡或過強的免疫應答情況下大量體現的因子,在肝損傷出現時作用十分強烈[30]。TNF-α能導致干細胞大量凋亡;同時,TNF-α可以激活NF-κB信號通路從而增強機炎癥反應,和肝損傷[31]。IFN-γ是前炎癥的細胞因子,能夠加強肝細胞對TNF-α的敏感性,使肝細胞更容易受損[32]。四氯化碳能夠通過加劇肝組織的氧化反應,使肝臟發生強烈的炎癥反應,使動物體內的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ含量上升[15]。

由表5可知,與正常組小鼠相比,模型組小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水均顯著升高(p<0.05),說明四氯化碳造模肝損傷后小鼠肝臟出現炎癥,使小鼠體內出現炎癥反應。與模型組小鼠相比,PEK低劑量組、PEK高劑量組和水飛薊素灌胃組均能顯著降低以上細胞因子水平?？梢?PEK能夠降低小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細胞因子水平,達到降低小鼠體內炎癥水平的目的,從而通過減輕炎癥反應實現減輕肝損傷的作用。

2.6　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝組織病理學變化的影響

如圖1所示,正常組小鼠肝組織細胞結構正常,肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀分布;模型組小鼠肝組織細胞排列不均,中央靜脈呈現不規則,細胞結構被破壞,出現大量細胞壞死。PEK和水飛薊素均能夠減輕四氯化碳對肝細胞造成的壞死以及肝組織形態不完整,其中高濃度的PEK效果更為明顯,接近藥物水飛薊素。

圖1　各組小鼠肝組織的病理學變化(200×)Fig.1　Pathological observation of liver of mice in different group(200×)

表6　各組小鼠肝組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px mRNA表達的半定量分析Table 6　Semi-quantitative analysis of Mn-SOD,Gu/Zn-SOD,CAT and GSH-Px mRNA expressions in liver of mice in different groups

2.7　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝組織中抗氧化酶mRNA表達的影響

由圖2和表6可知,正常組小鼠肝組織中的Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px表達水平高于其他各組小鼠(p<0.05)。四氯化碳(模型組)導致小鼠肝組織中的Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px表達強度下降,PEK可以顯著緩解表達下降(p<0.05),且高濃度的PEK效果更為明顯,作用效果接近于水飛薊素。

圖2　各組小鼠肝組織中Mn-SOD、Gu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表達Fig.2　Mn-SOD,Gu/Zn-SOD,CAT and GSH-Px mRNA expressions in liver of mice in different group

2.8　苦丁茶多酚提取物對小鼠肝組織中COX-2、IL-1β和TNF-α mRNA表達的影響

COX-2是機體內重要的炎癥因子,機體組織出現炎癥后大量表達,是炎癥的標志性產物,肝損傷發生后由于炎癥反應使肝細胞損傷,Kupffer細胞被激活,COX-2被大量的表達及合成,進而促進肝損傷的加劇[35-36]。肝臟中的Kupffer細胞可以分泌的炎性細胞因子IL-1β和TNF-α,加劇肝損傷[37]。同時,TNF-α是細胞因子網絡中介導肝損傷的終末介質,能夠直接促進肝損傷[38]。

由圖4和表7可知,與正常組相比,四氯化碳使模型組小鼠肝臟組織中的COX-2、IL-1β和TNF-α表達顯著增強(p<0.05)。與模型組相比,PEK和水飛薊素灌胃均能下調四氯化碳造成的COX-2、IL-1β和TNF-α表達加強,且高濃度PEK灌胃組小鼠的COX-2、IL-1β和TNF-α表達顯著低于低濃度PEK灌胃組,但略高于正常組和水飛薊素灌胃組。由此可見,PEK可顯著下調肝損傷小鼠的COX-2、IL-1β和TNF-α表達(p<0.05),且效果接近于相同濃度的水飛薊素。

圖3　各組小鼠肝組織中COX-2、IL-1β和TNF-α的mRNA表達Fig.3　COX-2,IL-1β and TNF-α mRNA expressions in liver mice in different group

組別COX-2IL-1βTNF-α正常組0 49±0 01e0 34±0 03e0 13±0 03e模型組1 00±0 06a1 00±0 05a1 00±0 06aPEK低劑量組0 75±0 05b0 71±0 02b0 72±0 04bPEK高劑量組0 66±0 04c0 65±0 03c0 65±0 02c水飛薊素灌胃組0 55±0 02d0 57±0 02d0 33±0 03d

3　結論

本研究通過建立動物模型觀察了PEK對四氯化碳誘導肝損傷的改善作用,針對其多酚物質的肝損傷改善效果進行了機制研究。結果顯示PEK可以顯著緩解四氯化碳對小鼠體內血清和肝組織造成的影響,且PEK的作用接近于肝損傷治療藥物水飛薊素。本研究是基于動物體內進行了實驗,為了進一步驗證PEK的作用,未來需要在臨床研究中進行深入研究?；趧游矬w內實驗的結果可以看出,PEK作為一類從天然植物中提取的有效生物活性物質,具有較好的肝損傷預防效果,具有很好的開發利用價值。

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