柑橘中類黃酮的前處理及檢測技術研究進展

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(1.西南大學化學化工學院,重慶 400715;2.中國農業科學院/西南大學柑桔研究所,農業部柑桔產品質量安全風險評估實驗室(重慶)，重慶 400712;3.中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所,北京 100081；4.農業部柑桔及苗木質量監督檢驗測試中心，重慶 400712 )

柑橘屬蕓香科柑橘亞科植物,因酸甜多汁,清香爽口,營養豐富,深受人們喜愛[1]。2014年全球柑橘產量已達1.39億噸[2],中國柑橘總產量為3492萬噸[3],是目前最大的小柑橘類水果生產國。研究表明,柑橘中含有的類黃酮活性成分具有增強人體免疫能力、抗癌、抑菌消炎、預防糖尿病和心腦血管疾病等重要生理作用,可以作為生產食品、保健食品、醫藥化妝品和動物飼料的來源,如橙皮素就是美國熱銷保健品的主要活性成分,也是多款化妝品晚霜中的添加劑。而且從酸橙中分離出的類黃酮可以抑制A549細胞(人肺腺癌細胞)的新陳代謝,誘導癌細胞凋亡,有效預防和治療非小細胞肺癌等[4]。Ke等[5]的研究結果也顯示長期服用添加3%的柚皮素的膳食補充劑,可以提高血漿和組織中的柚皮素含量,降低高血糖,減少腹腔中過多的脂肪,具有明顯的抗肥胖功效。由于柑橘中類黃酮活性物質的顯著生理功能以及在食品、醫藥和化妝品中的廣泛應用,柑橘中類黃酮的樣品前處理及檢測技術一直是國內外學者研究的熱點和重點。本文綜述了近年來國內外有關柑橘中類黃酮的種類、樣品前處理及檢測技術方面的研究進展,并對未來的研究開發提出展望。

1　柑桔中類黃酮的種類

黃酮類化合物是指兩個具有酚羥基的苯環(A-與B-環)通過中央三碳原子相互連結而成(C環)的一系列化合物[6]。根據中間三碳鏈的氧化程度、B-環連接位置(2-或3-位)以及三碳鏈是否構成環狀等特點,天然黃酮類化合物可分為:黃酮醇[7]、黃酮[8]、黃烷醇[9]、花青素、黃烷酮[10]以及異黃酮[11]等。它主要以與糖結合成苷的形式存在,小部分以游離態(苷元)存在,黃酮基本化學結構如圖1所示。

圖1　黃酮化學結構式Fig.1　Chemical structure of flavonoid

黃烷酮類是柑桔中含量最多的類黃酮,約占類黃酮總量的80%。黃酮類化合物多為結晶性固體,少數(如黃酮苷類)為無定形粉末。黃酮苷元一般難溶或不溶于水,易溶于稀堿液及甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機溶劑。黃酮苷一般易溶于水、甲醇、乙醇、醋酸乙酯、吡啶等溶劑,難溶于乙醚、三氯甲烷、苯等有機溶劑。多甲氧基黃酮(PMFs)主要存在于柑橘果皮的油胞層,生理功能顯著,尤其是其抗癌活性,其官能團3、5、6、7、8、2′、3′、4′和5′等位置發生四個及以上甲氧基取代基則為PMFs,難溶于水,易溶于熱乙醇、苯、乙酸乙酯、石油醚、己烷等有機溶劑[12],黃酮類化合物基本母核結構及代表化合物如表1所示。

2　黃酮類化合物的前處理技術

由于柑橘成分復雜,試樣一般需要經過溶劑提取、分離、純化等處理后才能進行黃酮類化合物的檢測,因此黃酮類活性物質前處理技術的研究是個關鍵環節,目前已有固相萃取、閃式提取、超臨界流體萃取等技術。

2.1　固相萃取(Solid phase extraction,SPE)

Wan等[13]以自制的介孔分子篩SBA-15為固相吸附劑,基于小型化固相萃取(SPE),結合UHPLC-Q-TOF/MS成功處理和測定了柑橘類水果中的六種黃烷酮。SBA-15由于其晶體空腔內強烈的極性和庫侖力,對于非飽和的黃烷酮極性化合物具有高效的選擇萃取能力,儀器檢測限和定量限值分別小于4.26和14.29 ng/mL,此法分析時間更短,靈敏度更高,適用于從復雜的柑橘類水果樣品中純化和富集目標黃烷酮。A. ASGHARI等[14]在常規固相萃取(SPE)的基礎上,去掉了活化和淋洗的步驟,以硅膠為吸附劑,14%的NaCl溶液調節離子強度,甲醇直接洗脫橙汁中的待測組分。與常規SPE及其他技術的提取率相比,提取效率相似,但提取時間和溶劑大大減少,非常適合作為工業,制藥和監管實驗室從各種柑橘汁樣品中提取黃酮的篩選方法。Behruz等[15]開發了一種微型超聲輔助MSPD法,將經過預處理的C18硅膠基質與150 μL橙汁樣品先后放入1 mL注射器中,兩端封閉后室溫超聲6 min,連接真空除去殘留,500 μL甲醇真空洗脫分析物。HPLC分析六種類黃酮化合物的檢測限和定量限為23.3～46.8,74.8～141.5 ng/mL,平均回收率在84.6%～101.5%。首次將此法應用在提取液體樣品(人類血漿、尿液)中的黃酮類化合物,可廣泛應用于生物化學和臨床研究,但此法處理量少,不適合工業化制備。

2.2　閃式提取法(Flash Extraction)

閃式提取法是利用閃式提取器高速轉動時所產生的機械剪切作用、振動作用和負壓渦流,迅速將植物細胞組織粉碎至細微粒度,從而使組織內的有效成分與溶劑充分接觸,達到快速溶解和高效提取,完成一次提取一般在30 s左右,常采用水、乙醇、甲醇、丙酮等作為它們的含水溶劑[16]。閃式提取法是一種快速有效的天然產物提取方法,能最大限度的避免植物有效成分受熱破壞,是最近迅速發展起來的一種新興的天然產物提取技術。

有研究者[17]用此法從陳皮中提取了橙皮苷,最佳工藝條件為乙醇濃度70%,提取時間2.6 min,液固比42.1 mL/g,閃式提取2次,與乙醇熱回流法相比,橙皮苷得率提高了6.35%,提取時間大大縮短。還有研究者以胡柚皮為原料,閃式提取法提取了胡柚皮中黃酮類化合物,僅用95 s,柚皮黃酮提取率4.37%[18]。

2.3　超臨界流體萃取法(Supercritical fluid extraction,SFE)

SFE是一種快速、高效的環境友好型提取技術?；驹硎强刂瞥R界流體(CO2)在高于臨界溫度(31 ℃)和臨界壓力(7.4 MPa)的條件下,從樣品中提取有效成分。當恢復到常壓和常溫時,溶解在CO2流體中的成分立即以溶于吸收液的液態與氣態CO2分開,從而達到提取目的[19]。CO2是非極性溶劑,對極性較強的物質溶解能力不足,在提取極性較大的物質時,需加入夾帶劑,也叫提攜劑,如甲醇、乙醇和水等[19]。

表1　黃酮類化合物基本母核結構及代表化合物Table 1　The basic parent nucleus structure of flavonoids and representative compounds

Lee等[20]以乙醇為夾帶劑,采用SFE法萃取了臺灣香檬中的川皮苷和桔皮素,研究發現,夾帶劑85%的乙醇水溶液在超臨界流體CO2中的比例為9.1%時,川皮苷和桔皮素的產率顯著增加,SFE法得到的產物純度比傳統提取方法的更好。Seorns等[21]采用逆流超臨界流體萃取法(CC-SFE)萃取分離橙汁中的抗氧化活性成分,比較了樣品流速和溶劑流速比(S/F)對萃取效率的影響,結合HPLC-DAD-MS法檢測出甜橙黃酮、柚皮蕓香苷、橙皮苷、柚皮苷、川皮苷等多種類黃酮。呂凜等[22]也采用CO2超臨界流體萃取了橘皮中的黃酮類化合物,提取率為2.723%。SFE法與其他方法相比,具有提取條件溫和,有效成分不易破環,雜質少,節省時間,所得產物外觀色澤更佳等優點,但是生產成本較高。

2.4　分子印跡技術(Molecularly imprinted technology,MIT)

分子印跡技術是一種以目標分子(模板分子或印跡分子)為模板,合成對該分子具有特異性識別功能的聚合物的技術。在色譜分離、固相萃取、臨床藥物分析、食品檢測等領域得到了廣泛應用,在天然產物,如黃酮、生物堿、多酚等活性成分提取領域中的應用逐漸增多[23]。近年來,分子印跡技術是廣受關注的新興技術,它集分離與富集于一體,材料廉價,可反復使用,適合從復雜基質中分離純化痕量目標物用以檢測。

Hui等[24]以橙皮素為模板分子,丙烯酰胺為功能單體,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑,在甲醇、甲苯和十二烷醇的混合致孔劑中,采用熱聚合法合成了對橙皮素具有特異性識別的分子印跡聚合物(MIP)。將其作為固相吸附劑裝入固相萃取小柱中,形成了分子印跡固相萃取(MISPE)整體柱,來提取橙皮素及與其結構相似的化合物蘆丁混合物,經HPLC分析,橙皮素回收率為94%,蘆丁回收率僅為2.7%,結果說明合成的MIP對橙皮素具有高度的選擇性。此法用于提取茶枝柑干燥果肉中的橙皮素,回收率為90.8%±3.2%,精度較好(RSD=6.48%),線性關系良好。鄧茜珊等[25]以橙皮素為模板分子,乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑,偶氮二異丁腈為引發劑,通過本體聚合方式制備了橙皮素分子印跡聚合物。紫外分光光度法對功能單體進行選擇,將該聚合物用作液相色譜固定相,可實現橙皮素與結構類似物染料木素的基線分離。馬秀玲[26]以柚皮苷為印跡分子,在水相中制備了柚皮苷分子印跡殼聚糖膜,有效地從橙皮苷和柚皮苷的混合水液中分離出柚皮苷,透過率為11.16%。

MIP的各種聚合方法和萃取形式使得該技術適用于不同來源和性質的分析物。該技術在對復雜食品基質中分析物的凈化和富集時，表現出的選擇性、穩定性、重復利用性等都比傳統固相萃取技術更具競爭力。但是,分子印跡技術在其發展過程中仍然存在一些問題,如水相中分子印跡聚合物(MIP)的不相容性、結合位點不均勻、模板滲漏、生物大分子的印跡等。

式中:μm 為混合油黏度，mPa·s;μA、μB為組分油黏度，mPa·s;X A、X B為組分油質量分數;α為經驗常數;δA、δB、△δ分別為組分油 A、B的密度和密度差，kg/m3。

3　檢測技術

3.1　液相色譜

高效液相色譜法(HPLC)是目前檢測柑橘中酚類物質最廣泛的色譜方法,具有樣品預處理簡單,分辨率高,速度快,重復率高的優點。HPLC通常連接紫外(UV)、二極管矩陣(DAD或PDA)檢測器等[27]。

表2總結了最近幾年來液相色譜在檢測柑桔中類黃酮成分方面的應用,可以看出,在檢測柑橘中類黃酮數目較少的情況下,HPLC還是目前主要的分析方法,并且反相梯度洗脫的效果較好。在1993年,鄔安珍等[28]以RP-C8為色譜柱,在55 min內分離了植物提取物中18種黃酮類化合物,最佳波長和溫度分別是280 nm和35 ℃。HPLC還可以拆分黃酮類化合物對映體,孫壓男等[29]以正己烷-異丙醇(乙醇)-三氟乙酸(75∶25∶0.1)為流動相,流速0. 5 mL/min,290 nm下,采用直鏈淀粉Chiralpak AD-H與纖維素Chiralcel OZ-H兩種手性柱建立了13種黃酮類化合物對映體的正相HPLC拆分方法,并考察了流動相比例、三氟乙酸的添加和醇的種類對手性識別的影響,直鏈淀粉Chiralpak AD-H柱對于流動相中醇的種類變化更敏感,纖維素Chiralcel OZ-H手性柱對此的差別小,醇的極性不同將導致立體位阻不同,從而影響分離物的選擇因子和分離度。也有采用長波熒光系統檢測橙汁中的類黃酮成分,Alvaro Andreu-Navarro等[30]基于十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)膠束介質中的長波熒光體甲苯酚紫(CV)和鈰(IV)與待分析物在585、625 nm時的相互作用會引起熒光強度的減少,減少值與待分析物的濃度成比例,采用柱后LC反應系統成功檢測了橙汁中6種類黃酮活性成分,檢測范圍在3.5～4000 ng/mL,LOD是1.0～3.7 ng/mL,相對標準偏差(RSD%)在2.8%～6.2%,此方法避免了樣品前處理和濃縮的步驟,減少了干擾,可用于橙汁中痕量成分的檢測。

近年來超高效液相色譜(Ultra performance liquid chromatography,UPLC)發展迅速,應用也越來越廣泛?；?.7 μm小顆粒技術的UPLC與HPLC具有相同的分離原理,不同的是UPLC不僅比傳統HPLC具有更高的分離能力,而且結束了人們多年來不得不在速度和分離度之間忍痛割舍的歷史。使用UPLC可以在很寬的線速度、流速和高反壓下進行高效的分離工作,并獲得優異的結果。

Alexander等[31]采用UPLC-DAD法,僅用5.5 min就從三種柑橘水果的提取物中檢測出了11種類黃酮,比HPLC分析快8.2倍,單個分析的溶劑消耗量也減少了近6.2倍。樣品中最豐富的是柚皮苷、蘆丁和槲皮素,11種物質的檢測限(LOD)在0.02～0.23 μg/mL,定量限(LOQ)在0.08～0.77 μg/mL。鄭潔等[32]建立了UPLC快速、同時測定柑橘中主要酚酸、黃烷酮、黃酮醇、黃酮類及多甲氧基黃酮組成及含量的方法,以ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)為分離柱,0.3%乙酸水溶液-甲醇梯度洗脫,19種物質在18 min內基線分離,線性范圍為0.01～500 mg/L,LOD為0.001～0.09 mg/kg,結果顯示黃烷酮(圣枸櫞苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮甙、香蜂草甙、柚皮蕓香甙、柚皮素和橙皮素)是柑橘中主要的類黃酮,通過不同提取劑提取效率的比較,發現乙酸乙酯的提取效率最高,而且最大限度地保留了柑橘的抗氧化活性。Cao等[33]采用反相UPLC-PDA法,定量檢測了枳殼中6種類黃酮,分析時間僅為8 min,回收率為95.33%～103.78%。UPLC采用直徑為1.7μm的填料顆粒提高了分離能力,峰數和峰容量是HPLC的2.5倍,可以同時分離更多的物質,從而對樣品所能提供的信息達到了一個新的水平,而且又極大地縮短了開發方法所需的時間。

表2　近十年來LC法分析檢測柑桔類黃酮成分的部分實例Table 2　Some examples of flavonoids analyzed with LC in past ten years

3.2　液質聯用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)

液相色譜與質譜聯用技術集成了色譜分離和光譜結構鑒定的優點,實現了快速分離與快速結構信息測定的同步化,在復雜組分的分離與鑒定研究方面顯示出了極大的優勢[44]。質譜的質量分析器將帶電離子根據其質荷比加以分離,用于紀錄各種離子的質量數和豐度[45-46]。主要分類包括扇形磁場分析器、四極桿分析器、離子阱分析器、飛行時間分析器、傅里葉變換分析器。離子阱分析器、四極桿分析器和飛行時間分析器最為常用,各種質量分析器經常聯用以達到更好的分離檢測效果。

離子阱分析器是由兩個端蓋電極和位于它們之間的類似四極桿的環電極構成,偏重于定性,可得到多級碎片,常用于未知化合物結構推導,全掃描靈敏度很高,中等分辨率,正負離子模式易于切換。Monica等[47]結合SPE純化技術,采用LCQ離子阱質量分析器,建立了高度降解的柑桔汁中甜橙黃酮(SIN)等六種PMFs的HPLC-PDA/ESI-MS/MS檢測法,在保留時間(tR)為61.0～66.8 min之間獲得了六種不同的PMFs。正離子模式下的總離子流圖顯示[M+H]+在m/z=373、403、403、343、433、373,結合二級質譜和保留時間,推斷化合物為甜橙黃酮、3,5,6,7,3′,4′-六甲氧基黃酮、川皮苷、4′,5,6,7-四甲氧基黃酮、3,5,6,7,8,3′,4′-七甲氧基黃酮以及桔皮素。林志燕等[48]以蘆丁、金絲桃苷等8個黃酮類化合物為研究對象,采用超高壓液相色譜-三重四級桿串聯質譜分析8個黃酮類化合物的色譜、質譜特性,結果顯示黃酮苷的保留時間小于相應苷元的保留時間,同類化合物苷元的羥基數目越多,保留時間越小。黃酮苷元的裂解主要以RDA裂解為主,即斷裂主要發生在C環的1位與2位和3位與4位,形成特征離子,對于黃酮化合物未知結構的解析具有指導意義。四級桿或三重四級桿偏重于定量,全掃描靈敏度低大約10～100個數量級,但是在選擇離子掃描模式下靈敏度很高,從而用于已知化合物定量。

表3　正離子模式臍橙中13 種類黃酮信息Table 3　Peak assignments in positive ion mass spectra of thirteen flavonoids in navel oranges

飛行時間質譜是根據不同質荷比的離子,通過一定長度無場飛行區時所需時間差異而實現分離的一種質量分析器。Eduardo等[49]采用具有高準確度的混合離子阱TOF質譜儀,以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈為流動相梯度洗脫,建立了佛手柑果汁中17種類黃酮的UHPLC-IT-TOF-MS檢測法,僅用5 min,17種物質完全分離,比HPLC快十倍,柚皮苷、新橙皮苷、圣草苷在50～300 μg/mL,其他化合物在0.5～100 μg/mL內具有良好的線性關系。劉賢青[50]等采用高效液相色譜分離、串聯四極桿-飛行時間質譜正離子模式、雙電噴霧離子源檢測了兩種臍橙不同組織中含量較高的甜橙黃酮、川皮苷等13種類黃酮,相關質譜數據見表3。由表可知,飛行時間質量分析器的優點是測定質量范圍寬,分辨率高,可以給出物質的精確質量,將更好的推測未知物結構,質量誤差小,能在幾至幾十微秒內實現全譜分析[44],準確度高,掃描速度快,靈敏度高,但是價格也偏高。

總之,LC-MS和LC-MS/MS是目前進行黃酮類成分分析強有力的手段,可避免復雜、繁瑣、耗時的樣品前處理工作,通過多反應監測,可大大提高分析的專一性,改善信噪比,提高靈敏度,在痕量檢測樣品中的主成分和未知物方面有很大優勢。

3.3　其他檢測技術

除以上分析方法外,柑橘中類黃酮活性成分的檢測技術還有氣相色譜法(GC)、毛細管電泳法(CZE)。GC具有高分辨率和低檢出限等優點,但容易生成三甲基硅醚(TMS)衍生物,只適用于揮發性成分的檢測,局限性大,無法廣泛應用于檢測類黃酮[27]。CZE分析速度快、分辨率高,特別是對樣品提取、濃縮、純化和衍生等前處理過程無嚴格要求,但易被進樣量、溫度、鹽的濃度等因素影響,重現性不高。Almas等[51]以PDA為檢測器,首次建立了同時檢測果汁中四種類黃酮活性物質的CZE分析法,在10 mmol/L硼酸鹽緩沖液,pH8.5,外加電壓25 kV的最優條件下,4種物質在10 min內完全分離,柚皮苷、柚皮素和槲皮素的線性響應范圍為3.12～200 μg/mL,蘆丁的線性響應范圍為6.25～200 μg/mL,CZE法分離效率高,分析時間短,前處理過程簡單,適合于果汁中黃酮物質的分離分析。

4　結語

近年來,隨著對柑橘活性成分的研究日益深入,發現類黃酮尤其是多甲氧基黃酮比其他活性成分具有更強的生理活性,已經廣泛用于功能性保健食品的開發、功能性飼料的研制、化妝品添加劑、橙汁質量控制等。但對于一些生理功能的作用機理,質譜中斷裂機理方面還有待深入研究,至今為止還沒有形成一種標準體系來提取分離檢測柑橘中的活性成分,而且我國還存在水果及制品分析用標準物質數量少、種類單一、應用范圍窄等問題。核磁共振法廣泛應用于有機化合物的結構解析和定性分析,其實它在化合物純度定值和含量測定方面也有很多優勢,LC-NMR聯用技術將高效的分離手段與NMR聯用,可以獲得復雜樣品的信息,是一種新興的重要定量分析技術,但相關研究文獻較少。因此,我國應該加強研發出快速、準確、靈敏的標準化檢測方法和高通量、高純度的工業化制備工藝,以及加大力度研制一些類黃酮純度標準物質和基體標準物質,促進相關柑橘產品溯源與真實性檢測,為保健品、化妝品和醫藥產品等有效成分的質量監管提供技術支撐。

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