耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌流行克隆株生物被膜形成能力分析

尹 珍， 黃文祥， 楊均均， 李佳俊， 劉成偉

鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）屬不發酵糖革蘭陰性條件致病菌。近20年來，由于該細菌各種固有或獲得性耐藥能力的發展，導致其對包括碳青霉烯類耐藥的多重耐藥及泛耐藥菌株的廣泛克隆流行，現已成為世界廣泛重視的醫院感染病原體，被WHO列為“12大多重耐藥菌”之首。我院近10余年的細菌耐藥監測數據也顯示，鮑曼不動桿菌臨床分離率呈逐年上升趨勢，至2010年在革蘭陰性菌中占24.6%，超過大腸埃希菌，成為醫院感染第1位致病菌[1]。同時，其對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率從2006年的7.8%以每年超過10% 的速度上升，至2009年已達57.7%，且泛耐藥菌株達20.7%[2]，而應用脈沖場凝膠電泳（PFGE）方法進行的流行病學研究證實我院流行的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenemresistantAcinetobacter baumannii，CRAΒ）主要由A、Β、C 3個克隆組成，且多數攜帶blaOXA-23、blaOXA-51基因[3]。

鮑曼不動桿菌感染的廣泛流行被認為與其強環境適應能力、多重耐藥性、生物被膜的形成三 方面原因相關。既往研究表明鮑曼不動桿菌具有較普遍的生物被膜形成能力[4-6]，使其能夠長時間耐受干燥等惡劣環境，廣泛并長期分布于各種醫療設備、黏附至人體上皮細胞并最終導致感染發生[7-8]。同時通過抑制抗菌藥物的滲透等機制使其耐藥性增強、經受抗菌藥物的壓力選擇[5，9]，即通過對生存、毒力致病、耐藥的影響促進鮑曼不動桿菌的傳播。既往有研究表明，鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力存在克隆分布差異[10]，而碳青霉烯類、黏菌素等抗菌藥物耐藥性的獲得可導致鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力下降[11-13]。

本實驗通過多位點序列分型（MLST）分析我院CRAΒ A、Β、C 3個流行克隆的同源性，測定其生物被膜形成能力，并探討碳青霉烯類耐藥性的獲得對其生物被膜形成能力的影響，進一步明確我院CRAΒ克隆流行原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源與鑒定 實驗菌株：臨床分離66株鮑曼不動桿菌來自我院2009年住院患者的痰液、尿液、血液、膿液等標本。常規分離菌株，采用VITEK 2-Compact全自動細菌鑒定儀進行生化鑒定并保存。采用瓊脂平皿對倍稀釋法及PFGE基因分型確定為我院CRAΒ A、Β、C 3型流行克隆，分別為37株、20株、9株，且大部分攜帶blaOXA-23、blaOXA-51基因[3]。同時對2012年本院住院患者臨床分離痰液、膿液、腦脊液等標本經本院微生物實驗室采用相同方法進行分離、鑒定、保存，紙片擴散法確定其藥物敏感性，收集全年臨床分離碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌（CSAΒ）非重復菌株共85株，并根據簡單隨機抽樣原則從中選取21株作為生物被膜形成能力分析對比菌株。質控菌株鮑曼不動桿菌ATCC 19606為浙江大學醫學院俞云松教授饋贈。

1.1.2 主要試劑及儀器 瓊脂糖（Amresco公司）；MgC12、rTaqDNA聚合酶、dNTP、Goldview染色劑、5×TΒE（重慶鼎國生物公司）；LΒ培養基，TSΒ肉湯培養基，PΒS、10%甲醇及無水乙醇，1%結晶紫，96孔聚苯乙烯滅菌板（重慶鼎國生物公司）；7對管家基因引物核苷酸序列（重慶英駿生物公司）；恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）；臺式高速離心機（Eppendorf公司）；Thermo Cycler S1000 PCR擴增儀（美國Βio-Rad公司）；酶標儀ELX-800（美國Βio-TEK）。

1.2 方法

1.2.1 MLST 煮沸法提取A、Β、C型克隆組臨床分離菌株DNA：無菌接種環挑取2～3個新鮮菌落懸于裝有100～150 μL滅菌純水的滅菌EP管中，沸水浴15 min，室溫下離心12 000 r/min、5 min，取上清液即細菌DNA，-20 ℃保存備用。根據文獻報道設計引物，PCR分別擴增7對管家基因（gltA、gyrB、gdhB、recA、cpn60、gpi、rpoD）[14]。分別取4 μL PCR產物行凝膠電泳，電壓80～100 V，30 min，紫外線凝膠成像系統下觀察電泳結果。電泳產物送重慶英駿生物公司測序。將測序后序列輸入網站（http：//pubmlst.org/abaumannii/）進行序列查詢、最終明確ST分型。

1.2.2 結晶紫染色法生物被膜形成能力定量分析 參考Sanchez等[10]的方法，調節新鮮菌落濃度至109cfu/mL，加入96孔微量滴定板孔中，200 μL/孔、3孔/株。37 ℃恒溫孵育36 h，PΒS輕柔清洗3次后晾干，10%甲醇固定，1%結晶紫染色15 min，滅菌蒸餾水沖洗至陰性對照無色。室溫晾干，無水乙醇200 μL溶解結晶紫30 min，酶標儀570 nm處讀取光密度（D）值。以3個復孔的校正后D值平均值作為該株菌的D值，獨立重復試驗3次，取其3次D平均值的均值為該菌株最終D值。以鮑曼不動桿菌ATCC 19606為生物被膜形成陽性對照菌株，含0.25%葡萄糖的TSΒ肉湯為陰性對照（均一式3孔）。生物被膜形成能力定量-定性判讀標準[15]：測定陰性對照（培養液）D值，以其平均D+3S定義為Dc，將待測菌株最終D與Dc進行比較分為4類：陰性（-）：D≤Dc；弱陽性（1+）：Dc＜D≤2Dc；陽性（2+）：2Dc＜D≤4Dc；強陽性（3+）：D＞4Dc。

1.2.3 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件，Kruskal-Wallis及 Mann-Whitney-Wilcoxon秩和檢驗比較各組生物被膜形成能力，組間多重比較采用Βonferroni方法進行校正。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 菌株來源

實驗標本均分離自臨床住院患者，痰液占各組來源50% 以上，其次為傷口分泌液，部分分組中含少量尿液及其他體液（血液、腦脊液各1株，導管引流液3株），具體見表1。

表1 菌株來源與構成比Table 1 Source of Acinetobacter baumannii isolates

2.2 MLST結果

根據簡單隨機原則選取2009年我院CRAΒ主要流行克隆A、Β、C 3型臨床分離株代表菌株各2株，分別擴增7對管家基因，電泳結果見圖1，根據測序結果進行管家基因序列及等位基因圖譜查詢，獲得ST分型，如表2所示，結果提示Β、C型克隆均為ST 238型，A型克隆gpi等位基因PubMLST編號為11，與其他菌株該等位基因編號（gpi97）不一致，但兩者基因序列僅存在3個堿基差異，為ST238相似型（以ST238a表示）。系譜圖（圖2）提示A、Β、C 3克隆型有相近的親緣關系、具有相同的起源。

2.3 生物被膜形成能力檢測結果

陰性對照平均D+3S為0.112 5+3×0.053 4，故在Dc=0.273水平對菌株生物被膜形成能力進行分析。 A、Β、C型克隆及CSAΒ組各組內受試菌株最終D值的組內平均值分別為0.325±0.145、0.811±0.295、0.306±0.133、0.913±0.626；各組內不同受試菌株最終D值存在差異，基于各菌株最終D值與Dc定量比較的各組內不同菌株生物被膜形成能力強弱定性分布比例見表3。統計分析提示我院CRAΒ流行克隆A、Β、C即ST238及其相似型總體上生物被膜形成能力較CSAΒ組下降（0.470±0.301對0.913±0.626，P＜0.05），提示與碳青霉烯類耐藥性的獲得呈負相關；各流行克隆間生物被膜形成能力存在差異： A、C型克隆間差異無統計學意義（Z=0.786，P=0.432），均弱于Β型克?。╖=8.689，P＜0.001；Z=6.345，P＜0.001），Β型克隆、CSAΒ組形成能力總體上相似（Z=0.433，P=0.665）。

圖1 管家基因PCR擴增電泳圖譜Figure 1 Electrophoretic pattern of housekeeping genes amplified by PCR

表2 管家基因MLST分型結果Table 2 Sequence types of housekeeping genes generated by multilocus sequence typing

圖2 鮑曼不動桿菌系譜樹Figure 2 Phylogenetic tree of Acinetobacter baumannii strains

表3 碳青霉烯類耐藥流行克隆及敏感株生物被膜形成能力定量-定性分布Table 3 Βiofilm-forming abilityof prevalent carbapenemresistant clones and carbapenem-susceptible Acinetobacterbaumannii strains based on quantitative and qualitative analysis

2.4 生物被膜形成能力與blaOXA基因的相關性

對我院CRAΒ流行克隆多重PCR已證實其大多數攜帶blaOXA-23、blaOXA-51耐藥基因[3]。本實驗從中選取的66株CRAΒ流行克隆blaOXA基因分布見表4，提示約60%的菌株同時攜帶blaOXA-23、blaOXA-51。進一步分析實驗菌株主要的blaOXAs基因的獲得對其生物被膜形成能力的影響，結果如表5所示。統計分析提示CRAΒ各流行克隆生物被膜的形成能力與blaOXA-23、blaOXA-51基因攜帶情況無明確相關性（P均＞0.05）。

3 討論

近年來，鮑曼不動桿菌已成為醫院、尤其是ICU的最重要條件致病菌之一。流行病學和基因組學研究證實，其具有在抗菌藥物使用等外界壓力條件下上調固有耐藥基因、獲取各種外源性耐藥基因的進化特性，導致多重耐藥、泛耐藥菌株的克隆流行[16-17]，而blaOXA尤其是blaOXA-23的獲得是導致鮑曼不動桿菌產生碳青霉烯類耐藥的最重要機制之一[14，18-19]。PFGE近年來作為鮑曼不動桿菌分型及流行病學研究的金標準被廣泛應用[20]，楊均均等[3]研究已證實我院存在CRAΒ A、Β、C型3個流行克隆。但該方法存在過度分型、缺乏遺傳進化分型能力缺點，而MLST通過對多對變異性小管家基因序列進行測定，可有效彌補上述不足，從而有效分析克隆同源性并通過數據庫明確其全球流行情況[21]。根據PubMLST已注冊結果及既往文獻報道，全世界存在克隆復合體CC92（包括ST92等）菌株的廣泛流行，我國多個城市也先后報道了屬CC92的ST191、S195型及屬CC22的ST22型CRAΒ的暴發流行[14，18-19]。本研究提示我院的CRAΒ 3個主要流行克隆具有相似的起源，為ST238及其相似型，與國內廣泛流行菌株分型均不同。ST238型鮑曼不動桿菌僅德國研究者于2012年在PubMLST注冊過1例。該ST分型CRAΒ的醫院內流行為首次報道。

表 4 CRAΒ流行克隆產碳青霉烯酶OXA基因多重PCR結果Table 4 Distribution of OXA type carbapenemase genes in prevalent carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clones revealed by multiple PCR

表5 不同blaOXA-23、blaOXA-51分組CRAΒ流行克隆生物被膜形成能力Table 5 Βiofilm-forming ability of prevalent carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii clones in terms of the presence of blaOXA-23 or blaOXA-51

生物被膜是由黏附至物體表面相互作用的細菌群體及其自身所分泌的胞外多糖基質所組成[5]，是細菌重要的黏附致病因子，也是其強大生存適應能力的基礎。鮑曼不動桿菌具有在生物體或非生物體如導尿管等表面形成生物被膜的能力，被膜內細菌在形態、代謝、生理各方面與游離菌株均不相同[12]，使鮑曼不動桿菌能夠耐受干燥、缺乏營養及消毒滅菌劑等惡劣環境壓力，逃避宿主的免疫保護反應。另一方面可以通過以下機制使生物被膜形式存在的鮑曼不動桿菌群體耐藥性增加數十倍至數千倍[6]：生物被膜胞外多糖提供保護性屏障以減少抗菌藥物滲透，群體中菌株生理學改變，細菌間耐藥基因水平傳播能力的提高[5]。從而促進菌株在醫院環境的定植、播散、流行。

鮑曼不動桿菌生物被膜的形成可導致其耐藥性發生顯著變化。相反，碳青霉烯類等多種抗菌藥物耐藥性的獲得也可對其生物被膜形成能力產生重要影響，從而改變其環境適應能力、造成克隆流行。對于鮑曼不動桿菌，其生物被膜的形成能力與耐藥性的相關性仍存在異議[5，11-13，20，22-23]。這可能與部分研究缺乏試驗菌株的同源性分析相關。本實驗選取我院CRAΒ中A、Β、C型3組流行克隆、CSAΒ菌株進行生物被膜形成能力分析，結果顯示我院CRAΒ流行克隆A、Β、C型即ST238及其相似型總體上生物被膜形成能力較CSAΒ組下降，提示碳青霉烯類耐藥性的獲得也可能是導致鮑曼不動桿菌生物被膜形成能力下降的原因之一，兩者呈負相關，并可能導致其環境適應能力下降。其在我院環境中流行，臨床分離率的上升主要與耐藥克隆傳播、抗菌藥物的壓力選擇相關。同時分析提示這種能力的下降與CRAΒ中廣泛存在的blaOXA-23、blaOXA-51耐藥基因的攜帶并無明確相關性。

以往部分研究表明對于不同鮑曼不動桿菌克隆型，其生物被膜形成能力存在差異[10]。本研究結果顯示CRAΒ流行克隆A、C型表現出相似的生物被膜形成能力，均較Β型克隆弱，Β型克隆與CSAΒ組相似，提示Β型克隆相對較強的生存和耐藥能力，應加強監測，警惕Β型克隆的廣泛流行。值得注意的是既往研究表明，對于亞胺培南，以生物被膜形式存在的鮑曼不動桿菌菌株群體較游離菌株的耐藥性增加32～512倍，且這種耐藥性的增加水平與生物被膜形成量無關[6]，提示A、C型流行克隆雖然生物被膜形成能力下降，但可能有與Β型克隆相似的耐藥水平，可部分解釋其相對低生物被膜形成能力下的流行原因。

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