磨牙缺失對幼年大鼠海馬CA1區神經元及BDNF、TrkB表達影響的研究

李 想 李伯琦 于 璐 劉奕杉 周曉慧 迪麗努爾·阿吉

隨著口腔醫學的發展，關于口腔功能與腦功能的研究已成為該領域的研究熱點之一[1，2]。大量研究結果證實，大鼠的情感、行為、學習記憶和空間辨別等高級神經活動主要由海馬CA1區參與完成[3]。腦源性神經營養因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）是體內含量最多的神經營養因子，酪氨酸激酶 B受體（tyrosine kinases B receptor，TrkB）是BDNF的特異性受體，BDNF在靶細胞膜上與TrkB受體結合，形成配體-受體復合物，從而參與學習記憶功能[4]。研究顯示，大鼠海馬中BDNF的表達減少是由于成年小鼠的磨牙缺失或者進軟食導致的[5]。但磨牙缺失對幼年大鼠海馬CA1區BDNF與其受體TrkB的影響仍缺乏足夠的理論依據。本研究通過建立磨牙缺失的幼年大鼠模型，觀察大鼠海馬CA1區神經細胞結構及BDNF、TrkB表達變化，初步研究關于磨牙缺失對幼年大鼠學習記憶能力影響的神經生化基礎，并擬求為后期研究奠定理論基礎。

資料和方法

1.實驗動物及分組：SPF級健康雄性SD大鼠（4～5周齡）50只，體重50～70g，由新疆醫科大學動物實驗動物中心提供，動物倫理審查批號（IACUC20150709-05），所有動物在清潔、安靜的環境下籠內飼養，自由進食水。

SD大鼠進入實驗室適應性飼養1周后，按隨機數字表法分成A、B、C、D、E五組，每組10只。A組：正常對照組；B組：3顆磨牙拔除組；C組：6顆磨牙拔除組；D組：9顆磨牙拔除組；E組：12顆磨牙拔除組。

2.主要試劑和儀器：實驗過程中的主要試劑如下：一抗：腦源性神經營養因子多克隆抗體、酪氨酸激酶B受體多克隆抗體（武漢三鷹）；二抗：山羊抗兔IgG；DAB顯色試劑盒；抗體稀釋液（北京中杉金橋生物科技有限公司）；光學顯微鏡、顯微采片機、石蠟切片機、生物組織自動包埋機（德國萊卡公司）；注射水合氯醛（新疆醫科大學動物實驗室提供）。

3.模型的建立：所有實驗動物用水合氯醛（3.5mg/kg）腹腔注射麻醉。A組不進行牙齒拔除術，B組拔除左側下頜3顆磨牙，C組拔除左側上下頜6顆磨牙，D組拔除左側上下頜及對側下頜共9顆磨牙，E組拔除雙側12顆磨牙。

實驗組大鼠用小號止血鉗進行磨牙拔除術，術中盡量完整拔除牙齒，若牙冠折斷，則去除齦上可見的牙體組織，消除后牙咬合接觸，常規壓迫止血，處理術后常規顆粒飼料喂養，自由飲水。

4.標本制備：5組大鼠在干預后8周后，麻醉條件下快速斷頭，剝離腦組織，在冰冷的金屬平臺上迅速分離出海馬組織。將海馬組織標本置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1mol/l，pH＝7.4）中固定24小時后，常規石蠟包埋。定位海馬典型位置，參照《大鼠腦立體定位圖譜》進行連續冠狀切片，厚5μm。

5.檢測指標和方法：①HE染色觀察大鼠海馬CA1區神經細胞的改變：從各組大鼠中隨機抽取8只大鼠的海馬組織切片，每只取5張連續切片進行HE染色，在顯微鏡下觀察海馬組織CA1區神經細胞形態及細胞排列。②免疫組化法檢測海馬CA1區BDNF、TrkB蛋白的表達：從每組大鼠中隨機抽取8只海馬組織切片，采用親和素—生物素—過氧化物酶復合物法（ABC法）檢測BDNF、TrkB蛋白的表達。每只大鼠5張切片進行高壓修復抗原，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，兔抗鼠BDNF（1:200）、兔抗鼠TrkB（1:300）4℃孵育過夜，二抗37℃孵育45min，二氨基聯苯胺（DAB）顯色 3min，蘇木素復染，梯度酒精脫水，透明及中性樹膠封片。③圖像采集及分析：光學顯微鏡下觀察大鼠海馬CA1區神經元細胞并攝像。每個樣本取3張切片，每張切片各選擇5個高倍視野（×400），應用Image-pro-plus6.0圖像分析系統測定每個視野免疫反應陽性產物的積分光密度值，以平均光密度值作為大鼠海馬CA1區蛋白陽性細胞表達的最終數值。

6.統計學處理：應用SPSS22.0統計軟件進行統計分析，實驗結果以均數±標準差（±S）做統計描述。多組間比較應用單因素方差分析，且認為P＜0.05具有統計學意義。

結 果

1.HE染色觀察大鼠海馬CA1區神經細胞的改變：HE染色結果顯示：A組神經細胞結構清楚，細胞膜完整，核大而圓，染色均勻，呈藍紫色，細胞排列5～8層分布，構成顯著的帶狀，未見神經元變性，水腫及壞死，細胞形態結構正常。而實驗組中發現，B組的海馬CA1區細胞組織形態與A組相比較發現無明顯改變；C組的海馬CA1區組織中發現開始出現細胞膜不完整，部分細胞出現空泡狀，細胞核固縮，細胞層數的減少和細胞排列的紊亂；而D、E組的海馬組織CA1區則發現細胞核碎裂，細胞層數減少以及細胞排列稀疏、紊亂加?。▓D1）。

2.免疫組化法檢測海馬CA1區BDNF、TrkB蛋白的表達：免疫組化染色結果：陽性細胞為細胞膜及胞質內出現棕黃色顆粒，積分光密度值與免疫陽性細胞產物含量成正比。A、B、C、D、E五組在8周時，隨著磨牙缺失數目的增加，大鼠海馬CA1區的BDNF、TRKB的表達量呈現降低趨勢（圖4）。A組BDNF、TrkB蛋白表達量最高（370.0±14.56，367.8±13.99）。與A組相比，B組的BDNF、TrkB蛋白的表達量稍降低，表現為免疫陽性產物的積分光密度值降低，但差異無統計學意義（P＞0.05）。而C、D、E組的BDNF及TrkB蛋白的表達量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖2、3、表1、2）。

圖1 大鼠海馬CA1區組織結構的變化（HE染色×400）

表1 不同處理組大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB 陽性細胞 IOD值（±S）

表1 不同處理組大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB 陽性細胞 IOD值（±S）

組別 n 陽性細胞I O D值B D N F T r k B A組B組C組D組E組F P 8 8 8 8 8--3 7 0.0±1 4.5 6 3 6 2.0±1 2.6 3 3 3 4.9±1 9.6 8 2 5 0.5±1 8.3 2 2 4 1.8±1 1.8 0 1 5 3.1 1 7＜0.0 0 1 3 6 7.8±1 3.9 9 3 5 9.4±1 5.5 9 3 3 1.9±1 4.5 7 2 5 2.9±1 1.5 5 2 5 0.7±1 2.4 5 1 6 2.6 7 3＜0.0 0 1

圖2 各組大鼠海馬CA1區BDNF蛋白表達的情況（免疫組織化學染色 ×400）

圖3 各組大鼠海馬CA1區TrkB蛋白表達的情況（免疫組織化學染色 ×400）

圖4 不同處理組大鼠海馬CA1區BDNF及TrkB蛋白表達情況

表2 不同處理組幼年大鼠海馬CA1區BDNF、TrkB表達水平的比較

討 論

本課題組[6]在前期已經建立不同磨牙缺失的幼年大鼠模型，并通過行為學實驗證實，隨著磨牙缺失數目變化，大鼠出現不同程度的認知功能障礙。大鼠的海馬區是高級神經活動的重要部位，神經元是構成神經系統結構和功能的基本單位。神經元的缺失與認知功能的衰退密切相關，其大量缺失會導致空間記憶能力的減弱[7，8]。流行病學調查顯示牙齒缺失是阿爾茨海默病的危險因素之一[9]。磨牙缺失后口腔咀嚼效率降低甚至喪失，直接影響大腦的血流量和供氧水平，且減弱了大腦前葉區皮質的活躍程度，最終導致海馬神經元結構和功能的變化，從而對大腦學習、記憶產生不良影響。與此同時，研究表明BDNF及其受體TrkB在學習和記憶中扮演著關鍵角色。首先，應激可誘導大腦中樞BDNF及其受體TrkB蛋白水平表達明顯下降，進而可引起與焦慮等密切相關的大腦邊緣系統結構（如海馬、前額葉皮質）萎縮，最終導致抑郁的發生[10，11]；其次，在認知功能障礙性疾病中，BDNF及其受體TrkB合成和分泌過程及其功能都受到明顯影響[12]。在此基礎上，本實驗深入研究磨牙缺失對幼年大鼠海馬CA1區神經元及BDNF、TrkB蛋白表達的影響。

本實驗中利用HE染色法觀察對比海馬神經細胞組織形態。在6、9、12顆磨牙缺失組（C組、D組、E組）中大鼠海馬CA1區神經細胞皆出現嚴重的病理性改變，而3顆磨牙缺失組（B組）并未發生明顯改變，將C組、D組、E組實驗結果與正常對照組（A組）對比后，得出結論較多數目的磨牙缺失會造成大鼠海馬神經元損傷，此結論與其他學者[7，8]的研究結果一致。觀察實驗結果可知，海馬對磨牙缺失較敏感。在磨牙缺失因素的作用下，一方面海馬神經元數量減少、形態異?；蚬δ苁д{，種種變化直接影響中樞神經遞質的合成、釋放和信息的傳遞，從而影響神經系統功能；另一方面磨牙缺失致使發育期的大鼠海馬神經組織細胞發生凋亡，神經細胞的凋亡或壞死會導致海馬神經元大量丟失。據此分析，海馬神經元結構和功能的變化將會造成大鼠空間學習記憶功能的損害[13，14]。實驗過程同時采用免疫組化法觀察BDNF及其受體TrkB蛋白的表達量。實驗得出數據：正常對照組（A組）的表達量最高，隨著磨牙缺失數量的增加，BDNF及其受體TrkB蛋白的表達量逐漸減少，而在6、9、12顆磨牙缺失組（C組、D組、E組）中，其表達量的減少尤為顯著（P＜0.01），這與其他學者的描述[5，15]基本一致。由此可見，磨牙缺失會引起大鼠的咀嚼功能減弱甚至消失，同時對大鼠海馬的咀嚼刺激減弱，引起海馬神經元萎縮凋亡，導致BDNF及其受體TrkB合成分泌減少。這兩種因子的缺乏或功能異常是導致焦慮、學習記憶功能障礙等神經系統疾病的原因之一，研究顯示改變小鼠磨牙區長期咀嚼的刺激會增加小鼠焦慮情緒[16]。大鼠海馬神經組織形態學上的此種損傷及BDNF、TrkB蛋白表達的變化，與磨牙缺失后大鼠海馬區神經組織細胞發生凋亡以及大鼠行為學的變化是一致的[6，14]。

綜上所述，本研究發現較多數目的磨牙缺失會對幼年大鼠海馬CA1區神經元損傷及BDNF、TrkB蛋白的表達會產生明顯的影響，同時也證實了磨牙缺失對腦部物質代謝的影響。這些神經元及BDNF、TrkB蛋白表達的異?？赡苷T導與學習記憶功能障礙相關的多種神經系統疾病。筆者通過磨牙缺失對幼年大鼠海馬組織影響的研究結果發現，磨牙缺失對于情緒和學習記憶能力的影響是顯著的。加強磨牙缺失的預防和修復對于人類的焦慮、阿爾茲海默癥等神經系統疾病的影響尚未可知，仍需后續研究。

1 Ohkubo C，Morokuma M，Yoneyama Y，等.咬合與腦功能相關性研究進展.實用口腔醫學雜志，2013，29（6）:870-877.

2 龐倩，江青松.咬合支持喪失對認知功能的影響及其機制研究進展.北京口腔醫學，2014，22（2）:115-118.

3 Kondo H，Kurahashi M，Mori D，et al.Hippocampus-dependent spatial memory impairment due to molar tooth loss is ameliorated by an enriched environment.Archives of Oral Biology，2015，61:1-7.

4 Zhang HH， Zhang XQ， Xue QS，et al.The BDNF/TrkB signaling pathway is involved in heat hyperalgesia mediated by Cdk5 in rats.Plos One，2014，9（1）:e85536.

5 Takeda Y，Oue H，Okada S，et al.Molar loss and powder diet leads to memory deficit and modifies the mRNA expression of brain-derived neurotrophic factor in the hippocampus of adult mice.Bmc Neuroscience，2016，17（1）:81.

6 徐彬，李伯琦，劉佳怡，等.磨牙缺失對幼年大鼠空間學習記憶能力的影響.口腔醫學研究，2014，30（5）:403-406.

7 蘇少晨，成子祿，祁濤，等.牙齒缺失對小鼠空間學習記憶能力及海馬結構的影響.中華行為醫學與腦科學雜志，2009，18（9）:784-785.

8 Kubo KY，Murabayashi C，Kotachi M，et al.Tooth loss early in life suppresses neurogenesis and synaptophysin expression in the hippocampus and impairs learning in mice.Archives of Oral Biology，2017，74:21-27.

9 Kondo K，Niino M，Shido K.A case-control study of Alzheimer's disease in Japan-significance of life-styles.Dementia and Geriatric Cognitive Disorders，1994，5（6）:314-326.

10 花晴，李春暉，談誠，等.右美托咪定和米非司酮對創傷后應激障礙大鼠恐懼記憶的影響及機制.中華行為醫學與腦科學雜志，2017，26（3）:204-209.

11 喬卉，安書成，徐暢.BDNF與抑郁癥的研究現狀及進展.生理科學進展，2011，42（3）：195-200.

12 Zhang F， Kang Z， Li W， et al.Roles of brain-derived neurotrophic factor/tropomyosin-related kinase B（BDNF/TrkB）signalling in Alzheimer's disease.Journal of Clinical Neuroscience，2012，19（7）:946-949.

13 江青松，呂亞林，吳敏節，等.磨牙缺失對大鼠海馬氨基酸類神經遞質含量的影響.北京口腔醫學，2008，16（4）:185-187.

14 于璐，李伯琦，李宇，等.磨牙缺失對幼年大鼠海馬神經元凋亡及Caspase-3蛋白表達的影響.口腔醫學，2017，37（1）:10-14.

15 Yamazaki K，Wakabayashi N，Kobayashi T，et al.Effect of tooth loss on spatial memory and trkB-mRNA levels in rats.Hippocampus，2010，18（6）:542-547.

16 顧佳妹，蘇儉生，韓雯斐，等.小鼠磨牙區咀嚼刺激的改變對焦慮情緒的影響.口腔頜面外科雜志，2013，23（5）:341-346.