生物活性玻璃治療牙本質過敏癥的長效性體外研究

史舒雅 武 瓊 許玉婷 陳亞明

牙本質過敏癥的定義是牙齒在受到外界刺激，如溫度、化學物質以及機械作用等引起的酸、軟、痛癥狀。它不是一種獨立的疾病，而是各種牙體疾病所共有的癥狀[1，2]。它與釉質缺失和（或）根面暴露所致的牙本質小管暴露密切相關[1，2]。多種因素可致牙本質小管暴露，如牙合面磨損、磨耗、食物酸蝕、副功能運動、牙齦萎縮、老齡化、慢性牙周疾病、牙列不齊、牙周手術、不正確的刷牙方法、冠橋修復牙體預備以及牙折[1，3]。

流體動力學理論認為牙本質過敏癥是由于暴露的牙本質小管內異常的液體流動造成的[4]。因此，封閉牙本質小管能阻斷管內液體流動，從而緩解癥狀[5]。多種材料、方法能達到良好的短期脫敏效果[6]。然而日常牙合面磨損、唾液或者酸性飲食能重新打開封閉的牙本質小管，使得治療效果維持時間較短[7，8]。一些體外實驗已經證實食物酸性會增加牙齒敏感的可能[9]。因此，理想的脫敏劑不僅需降低牙本質的滲透性，同時要經受酸性飲食及唾液浸泡的考驗[10]。

生物活性玻璃具備封閉牙本質小管和再礦化牙本質的能力。它最初用于刺激新骨形成，隨后被用作骨科植入物涂層以促進植入物與骨的結合[11，12]，后又用于充填牙周骨缺損[13，14]。最近，含有生物活性玻璃的脫敏劑被證實能有效緩解牙本質過敏癥狀[15]。此外，關于生物活性玻璃的細胞毒性研究表明這是一種高度生物相容性的材料[16～18]。盡管各種脫敏劑能在短期內減緩牙齒敏感的癥狀，但是關于其長期性的研究較少。

本體外實驗研究的目的是比較含有生物玻璃的脫敏劑與另外兩種脫敏劑治療牙本質過敏癥的長期效果，為臨床治療牙本質過敏癥提供理論參考。

資料和方法

一、樣本的制備

收集新鮮拔除的無齲、無裂紋、無修復體的人類第三磨牙50顆，徹底清潔后貯存于4℃的含有0.5%麝香草酚的去離子水中。平行于夾持板平面包埋固定，用低速切割機（Isomet Low Speed Saw，Buehler Ltd，美國）將牙體于釉牙骨質界上1.0mm處，垂直牙體長軸切成1.0mm厚的牙本質盤，用點標記近冠面和近髓面，在持續水流沖洗下，牙本質盤用600目的碳化硅砂紙打磨30秒。將樣本浸入0.5M 乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA）溶液（pH＝7.4）中2分鐘去除玷污層，隨后用大量蒸餾水沖洗3分鐘。

二、實驗步驟

1.將樣本按隨機數字表分為5組（N＝10）。組1、2、3、4分別用生物活性玻璃、冷酸靈、高露潔抗敏和蒸餾水每天上午9點和下午5點處理2分鐘；組5為對照組，不做任何處理。采用的是兩組軟毛電動牙刷（Colgate 360°，Colgate-Palmolive Co.），15日后更換。表1為三種脫敏劑的生產廠家和有效成分。每天脫敏處理樣本后于上午10點浸泡在咖啡（pH＝5.4）中5分鐘，下午6點浸泡在可樂（pH＝2.5）中5分鐘。每次脫敏處理和酸性飲料浸泡后，將樣本放于蒸餾水中超聲震蕩清洗。處理間隔期將樣本貯存于常溫（36±1.0℃）人工唾液中。使用的人工唾 液 配 方 為 1.5mM/L CaCl2，50mM/L KCl，0.9 mM/L KH2PO4and 20mM/L Tris（pH＝7.4）。

表1 三種脫敏劑的生產廠家及主要成分

2.電化學阻抗檢測：在樣本處理2天后以及之后每隔7天進行一次樣本的電化學阻抗值測定。采用的是電化學工作站（IM6，ZAHNER-Elektrik GmbH&Co.KG，Kronach，德國）。將牙本質盤置于含有一對橡膠“O環”（直徑6㎜）的U型分裂腔裝置中，該裝置與Pashley等人提出的液壓傳導裝置相似[19]。玻碳電極（CHI104，CHI Instruments，Inc.，Austin，TX，USA）作為工作電極，鉑電極（CHI120，CHI Instruments，Inc.，美國）作為對電極分別放入兩個半腔中。樣本的合面朝向工作電極。Ag/AgCl電極（CHI111，CHI Instruments，Inc.，美國）用作參比電極。兩個半腔中充滿了0.1M KCl作為電解液。樣本在進行電化學阻抗值測定前需浸泡在電解液2日排除殘留的空氣，每次測定均需更換電解液。采用振幅為10mV的正弦電壓信號，頻率設為0.1Hz到60kHz之間，獲得奈奎斯特阻抗譜。影響阻抗值（kΩ）的因素包括電解液、樣本以及電極的電阻值。因此，樣本的阻抗值 R（d）等于總的阻抗值 R（t）減去電解液的阻抗值R（e）。同時，當Z值（交流阻抗矢量）最低時，它接近 R（t）。R（e）值是通過單獨測定0.1M KCl電解液的阻抗值獲得，其通常能穩定維持2～3小時。

3.原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）觀察：將5組樣本處理一個月后進行原子力顯微鏡觀察。實驗組（組1、2、3）各選取2個樣本。將樣本逐個包埋于丙烯酸樹脂中，然后依次用1.00μm，0.30μm和0.05μm的氧化鋁拋光粉拋光，超聲震蕩清洗后干燥備用。原子力顯微鏡（CSPM 5000，Ben Yuan Ltd，中國）采用敲擊模式（tapping mode），探針可周期性地接觸樣本表面獲得較少偽影的高清圖像[20，21]。本實驗使用AC160TS-C2型號的AFM探針（Olympus公司，日本），其共振頻率 ~300kHz，彈簧力常數~42N/m。圖像掃描速率為~1.5Hz，分辨率為512×512像素，其中最大垂直和橫向分辨率分別為0.1nm和0.2nm。采用AFM儀器制造商提供的數據分析軟件定量分析牙本質小管的直徑變化。

4.掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）觀察：樣本處理一個月后，大量蒸餾水沖洗、干燥器干燥，然后噴金以增加導電性。掃描電鏡（JSM6000，JEOL，日本）選取 20kV加速電壓。

三、統計學方法

電化學阻抗值采用SPSS17.0進行統計分析，各個時間段所測得的每組樣本的EIS值以及原子力顯微鏡觀察到的牙本質小管直徑用均數±標準差（±s）表示。Levene’s法測試方差齊性后，采用雙因素方差分析和Post hoc LSD確定各組值是否有統計學差異，檢驗水準α＝0.05。

結 果

一、電化學阻抗實驗結果

樣本EDTA脫礦、脫敏劑和酸性溶液處理2天，9天，16天，23天，30天的牙本質盤阻抗值見表2和圖1。

表2 EDTA脫礦、脫敏劑和酸性溶液處理2天、9天、16天、23天、30天后的牙本質盤阻抗值（kΩ）*

雙因素方差分析結果顯示時間（F＝7.42；P＜0.05）和分組（F＝12.07；P＜0.05）都有統計學差異。Post hoc LSD結果提示，使用生物活性玻璃處理與其他組相比能顯著降低牙本質的滲透性，差異有統計學意義（P＜0.05），但高露潔組除外（P＝0.324）。所有時段生物活性玻璃組產生的EIS值均最高。組4蒸餾水處理所獲得的EIS值較組5（對照組）低，但差異沒有統計學差異（P＝0.25）。組2使用冷酸靈處理所獲得的EIS值較組5略高，差異沒有統計學意義（P＝0.29）。

二、原子力顯微鏡結果

圖2顯示的是組1、2、3樣本經過脫敏處理1個月后的AFM圖像。組1圖像可以看到樣本表面有顆粒狀的管間沉積物，牙本質小管徑縮小最明顯。組1（生物活性玻璃）、組2（冷酸靈）、組3（高露潔抗敏）測得的牙本質小管徑分別為817±156μm，1231±277μm和 944±230μm。其中，組2與組1（P＜0.01）和組3（P＜0.05）均有統計學差異，后兩者之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 樣本EDTA脫礦、脫敏劑和酸性溶液處理2天，9天，16天，23天,30天的牙本質盤阻抗值

圖2 組1、2、3樣本經過脫敏處理1個月后的AFM圖像

三、掃描電子顯微鏡結果

圖3顯示的是組1、2、3樣本經過脫敏處理1個月后選取的SEM圖像。使用生物活性玻璃處理后（圖3-A，3-B）呈現出類似于玷污層的較均勻的顆粒狀牙本質表面，極少數牙本質小管仍開放但管徑已顯著縮小，呈現出最佳的小管封閉效果。 使用冷酸靈（圖3-C，3-D）和高露潔抗敏（圖3-E，3-F）處理后的表面牙本質小管凸度降低、管徑縮小，可見小顆粒沉積在牙本質表面、部分封閉牙本質小管，高露潔組封閉效果更明顯。蒸餾水組（圖3-G，3-H）和對照組（圖3-I，3-J）呈現出擴大的牙本質小管徑，其中蒸餾水組樣本表面可見少量牙本質碎屑，部分進入管內。

圖3 組1、2、3樣本經過脫敏處理1個月后選取的SEM圖像

討 論

治療牙本質過敏癥的方法可分為物理和化學兩類[22]?；瘜W方法包括氯化鍶、氟化鈉、福爾馬林溶液[23]、草酸鐵[24]、氫氧化鈣、氫氧化錫、草酸鈣、磷酸鐵[25]以及硝酸鉀[26]；物理方法包括釋放氟的樹脂[27]和激光[28～30]。這些材料脫敏效果理想，但維持時間相對較短。日常刷牙、咀嚼以及口內唾液和酸性飲食的接觸，會使這些材料逐漸磨損或溶解，最終失去封閉效果[6]。因此，評價治療牙本質過敏癥的材料時，必須將其長期脫敏效果考慮在內。根據解釋牙本質過敏癥疼痛的液體動力學理論[4，31]，生物活性玻璃的小管封閉能力成為近年來研究關注的熱點。

電化學阻抗法是一種靈敏且非破壞性的方法，可用于評價牙本質小管的封閉情況。它已經被用于評價酸引起的牙本質滲透性改變[19，32]、樹脂-牙本質粘結的有效性[33]、樹脂復合物修復體的微滲漏[34]以及根管治療后臨時性修復體的封閉[35]。采用電化學阻抗法測量牙本質盤滲透性需先浸泡樣本使電解液滲入從而導電。所獲得的電化學阻抗波常與樣本微結構的改變有關，牙本質樣本的電化學阻抗值取決于樣本兩側半腔內的電勢差，以及貫穿牙本質小管的電流[19]。牙本質小管的封閉會降低液壓傳導性、增加電阻抗值，即小管開放多阻抗值低、小管開放少阻抗值高[19]。

電化學阻抗結果表明含有生物活性玻璃的脫敏劑處理后樣本的滲透性最低。處理第2天，所有樣本的EIS值均有上升趨勢，其中生物活性玻璃組上升最顯著，提示生物活性玻璃與冷酸靈和高露潔相比能迅速起效，見表2。作為一種生物相容性材料，生物活性玻璃能在體內形成磷灰石晶體封閉開放的牙本質小管，抑制溫度或觸覺刺激的傳導從而緩解或消除牙本質過敏癥。磷灰石的形成是通過一系列相互依賴的序列反應而得到：生物活性玻璃逐漸溶解后表面形成Si-OH基團[11]、隨后聚合生成Si-O-Si基團、無定形沉積物吸附于玻璃表面后晶化為碳酸羥基磷灰石層（hydroxy carbonate apatite，HCA）、組織液中的生物成分（膠原纖維等）吸附在HCA層上、巨噬細胞及成骨細胞的附著及活動、基質的生成及結晶化，最終形成磷灰石[36]。

冷酸靈的有效成分為氯化鍶和硝酸鉀，兩者都被廣泛應用于牙膏治療牙本質過敏癥。由于鉀離子能夠降低敏感牙齒的神經興奮性，另體外實驗證實鍶鹽能增加脫礦牙本質的礦物密度[37]、也能與氟化物協同起效[38]。然而，本實驗中冷酸靈處理后牙本質滲透性的改變與空白對照組無統計學差異（P＝0.29）。研究證實含有8%精氨酸和1450ppm氟化物的高露潔脫敏牙膏能顯著緩解牙本質過敏癥[39]。這種Pro-Argin配方的牙膏能有效地封閉牙本質小管，含有精氨酸的牙本質沉積物能有效低抵抗酸蝕[40]。在本體外實驗中，生物活性玻璃組和高露潔組所造成的牙本質滲透性改變無統計學差異（P＝0.32）。

本實驗證實，蒸餾水組和空白對照組在經過EDTA脫礦和人工唾液浸泡后，都能在短期（2天）內使牙本質的滲透性降低，隨后升高，見表2。曾有研究證實使用蒸餾水刷牙能在牙本質小管內保留部分玷污層殘余物[15]，本實驗中，純可樂浸泡樣本后使用去離子水刷牙也能在牙本質小管內保留部分玷污層殘余物。而空白對照組沒有觀察到顯著的形態學改變[9]。人工唾液能溶解牙本質小管內的顆粒物，增加牙本質的滲透性[10]；而再礦化時，人工唾液中礦物鹽成分可能在牙本質表面沉積晶體，降低牙本質的滲透性[7]。牙本質滲透性的改變除與脫敏處理有關，也能反應脫礦和再礦化的循環過程。

原子力顯微鏡不止能提供樣本表面的形態改變，同時能提供精確的定量信息，諸如尺寸、粗糙度和周期[41]。與掃描電鏡相比，原子力顯微鏡具備偽影更少，無需物理或化學固定、樣本表面無需涂層來獲得更好的對比度和導電性等優點。但是，和掃描電子顯微鏡相比，原子力顯微鏡的缺點在于成像范圍太小，速度慢，受探頭的影響太大[20，21]。因此，本實驗中既采用了原子力顯微鏡觀察小管的封閉情況，又采用了掃描電子顯微鏡獲得成像范圍更大的圖像來觀察樣本的表面形態。觀察生物樣本時，采用輕敲模式有助于避免探針摩擦造成的表面損傷[42]。由于本實驗中使用的精細拋光粉末直徑（1.00μm，0.30μm和0.05μm）小于人年青第三恒磨牙的平均牙本質小管直徑（1.21±0.08μm）[43]，必須將樣本放入蒸餾水中超聲振蕩30分鐘后再進行原子力顯微鏡觀察。處理1個月后，組1、2、3牙本質小管平均直徑分別為 817±156μm，1231±277μm，944±230μm。組2的小管徑顯著大于組 1（P＜0.05）或組 3（P＜0.05），差異有統計學意義。與人年青第三恒磨牙的平均牙本質小管徑相比，組1和組3的管徑明顯縮小。

三種脫敏劑都能不同程度地長期降低牙本質小管滲透性。日常刷牙所沉積在牙本質小管內的材料能在1個月內有效低抵抗酸性溶液和人工唾液的浸泡。生物活性玻璃能夠迅速降低牙本質的滲透性，降低程度比高露潔高，但不具有明顯的統計學差異（P＝0.32），兩者與冷酸靈相比都有統計學差異（P＜0.05）。因此，無效假設僅對高露潔成立。

體外實驗的局限性在于活髓牙與牙本質模型存在一定差異，活髓牙中牙本質小管內充滿牙本質小管液并存在液體靜壓力（14.1cm H2O），因此推測對活髓牙牙髓壓力的存在也可能影響脫敏劑封閉牙本質小管的長期有效性。因此，還需進一步臨床實驗來證實本體外實驗研究結果。

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