水稻細菌性穗枯病菌分離條件的優化及產毒黃素觀察

徐以華 孫磊 王玲

摘要 水稻穗枯病是水稻生產上重要的細菌性病害，目前針對其病原菌快速高效分離的體系很少有報道。本文以水稻細菌性穗枯病菌Burkholderia glumae標準菌株LMG2196為研究對象，探討分析了B.glumae的生長溫度、培養基上的菌落形態及對抗生素敏感性等。結果表明，選用含50 μg/mL氨芐青霉素的KB平板劃線，25℃培養36 h，可以快速高效分離B.glumae。B.glumae主要通過分泌毒黃素對寄主產生致病性，本文利用分光光度法測定了LMG2196菌株在不同溫度以及營養條件下毒黃素的產生。LMG2196菌株在25～40℃之間均能產生毒黃素，在營養條件不同的LB和PPG液體培養基中，同一溫度下，總體上表現為在PPG中產生的毒黃素要比LB中的多；且LB的最適產毒黃素溫度是28～30℃，PPG的是37℃，表明毒黃素的產生與溫度和營養條件有關。

關鍵詞 水稻細菌性穗枯??； 病原菌； 快速高效分離； 毒黃素

中圖分類號： S 435.111.49

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018039

Abstract Bacterial panicle blight is one of the destructive diseases on rice crop. However， there are few studies on rapid and efficient isolation of the pathogenBurkholderia glumae. Growth temperature， colony morphology and antibiotic resistance of standard strain ofB.glumae LMG2196 were investigated in this study. The results showed that LMG2196 was rapidly and effectively isolated on KB medium with the concentration of 50 μg/mL ampicillin cultured 36 h at 25℃. Furthermore， the effects of temperature and nutrition on the production of toxoflavin from LMG2196 were also studied by spectrometry detection. The results confirmed that LMG2196 could produce toxoflavin at the temperature from 25℃ to 40℃ in both LB and PPG liquid medium. The level of toxoflavin production in PPG was higher than in LB at the same temperature. The optimal toxoflavin-producing temperatures were 28℃ to 30℃in LB medium and 37℃in PPG medium. All the above results showed that the production of the toxoflavin was correlated to temperature and nutrition.

Key words bacterial panicle blight of rice； pathogenic bacteria； fast and efficient isolation； toxoflavin

水稻細菌性穗枯?。╞acterial panicle blight of rice，BPBR）是由穎殼伯克氏菌Burkholderia glumae引起的一種細菌性病害。病原菌能產生毒黃素，毒害寄主植物。主要使水稻秧苗腐爛、谷粒以及葉鞘褐變[1-3]（故又被稱水稻苗腐病、谷枯病和穎枯?。4]，造成水稻減產，毒黃素還會嚴重影響稻米品質，危害人類以及其他動物的健康。

水稻細菌性穗枯病最先在日本報道，隨后在亞洲、美洲、歐洲以及非洲等各水稻種植區暴發流行，給全世界的水稻生產造成嚴重威脅，已引起人們的高度重視[5]。該病在我國早期已有報道，簡錦忠1984年在臺灣省中南部的稻田發現穗枯病[6]；王昌家等2006年在黑龍江省佳木斯地區發現該病，且處于零星初發生階段[7]；羅金燕等于2008年從2份浙江省稻種（來自海南的秈稻）上分離到了B.glumae，表明表面看似健康的稻種也可能帶有穗枯病菌[8]。近年，根據本實驗室調查（未發表的資料），全國北起黑龍江建三江南到海南三亞，西自四川東到臺灣，稻田中均有發現水稻穗枯病發生、危害，個別稻區、年份發生面積大、危害嚴重。據2017年10月在廣西容縣羅江鎮、石頭鎮等15個鄉鎮調查，‘犇優9901、‘晶兩優華占、‘y兩優1998、‘隆兩優1988、‘隆兩優黃莉占、‘隆兩優534等全縣大多數品種水稻穗枯病都有不同程度發生，發生面積約500 hm2，一般病穗率6.5%～20%，嚴重的30%～50%（實際調查結果，尚未發表）。因此，建立該病原菌的準確、快速、高效的分離體系尤為重要。PCR、real-time PCR、雙重PCR等分子生物學技術在病原菌分離鑒定中應用越來越廣泛[9-14]。但是，在運用分子生物學技術鑒定之前，通常由于雜菌太多，工作量大不容易分離到目標菌。為能夠快速準確分離到B.glumae，本文對B.glumae的特定生長溫度、菌落形態特點以及抗生素抗性進行了研究，優化了分離條件，建立了一套簡單、快速、高效的分離方法。

毒黃素是B.glumae的關鍵致病因子，在致病過程中起主要作用。在分子水平上毒黃素的合成和轉運分別由操縱子toxA、toxB、toxC、toxD、toxE、toxF、toxG、toxH和toxI負責，并依賴群體感應[15-17]。有研究指出，毒黃素的產生受溫度調控。Matsuda報道，在25～28℃時，B.glumae不產生毒黃素，28℃以上才能檢測到毒黃素的產生[18-19]。目前，有多種方法可以定性、定量分析毒黃素，主要包括薄層色譜法、分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜法和生物傳感測定法，其中分光光度法是最簡便的方法。毒黃素于393 nm存在紫外吸收峰[20-22]，故用分光光度計測定OD393峰值大小即可反映毒黃素的產生量。本文通過分光光度法對B.glumae產毒黃素與溫度以及培養基之間的關系進行了研究。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

B.glumae標準菌株LMG2196由浙江大學謝關林教授提供。

1.2 水稻細菌性穗枯病菌分離條件的優化

1.2.1 B.glumae的特定生長溫度篩選

將 LMG2196接種到LB液體培養基（酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0）培養至108 cfu/mL菌液后，按1∶1 000接種至3 mL LB液體培養基中，分別置于16、25、28、30、35、37、40和45℃，200 r/min振蕩培養48 h，每個溫度處理設3個重復。用分光光度計（Unico 4802 UV/VIS，中國）測定各培養菌液在不同時間段（0、4、8、12、24、28、32、36和48 h）的OD600。

1.2.2 B.glumae形成典型菌落形態培養基篩選

分別制備NA（聚蛋白胨5 g，酵母粉1 g，牛肉浸膏3 g，蔗糖15 g，瓊脂17 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0）、KB（蛋白胨 20 g，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，甘油 15 mL，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.2）、LB（酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，瓊脂16 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0）、PDA（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水定容至1 L）平板，用接種環劃線接種LMG2196，37℃培養箱培養24 h，觀察各平板上的菌落形態。

1.2.3 B.glumae對抗生素抗性篩選

將氨芐青霉素（ampicillin，Amp）、卡那霉素（kanamycin，Kan）、鏈霉素（streptomycin，Str）和利福平（rifampicin，Rif）分別加到融化并稍加冷卻的NA培養基中，使抗生素在培養基中的濃度均為50 μg/mL，倒平板。取100 μL LMG2196菌液分別涂布到上述制備的抗生素平板，各3次重復，以不加抗生素的NA平板為對照，同時置37℃培養箱中培養48 h，觀察 LMG2196抗生素抗性。

1.2.4 B.glumae分離條件篩選及優化條件驗證

供篩選和驗證的感病標樣來自全國不同稻區（包括浙江富陽、蕭山、寧波，福建南平、廣東韶關，廣西貴港、南寧、玉林、博白縣、興業縣等，共30份樣品），見圖1，用70%乙醇對感病標樣進行表面消毒15 s，無菌蒸餾水沖洗3遍，滅菌剪刀將病樣剪碎，加入1 mL無菌蒸餾水浸泡10 min，接種環蘸取菌懸液，分別在不含Amp的 NA（Amp-）、含Amp NA（Amp+）、不含Amp 的KB、含Amp 的KB平板上劃線，4個處理均分別置于25℃和40℃培養36 h后用全自動菌落計數器（Scan 1200，interscience，法國）計數，每處理重復3次。

RT-PCR鑒定分離菌。接種環劃線后在上述篩選的條件下培養，挑取相同數目且菌落形態疑似穗枯病菌的單菌落進一步培養，分離、純化，用B.glumae特異性引物glu1/glu2進行菌落PCR[11]。glu1：5′-CTCTGCAACTCGAGTGCATGAGC-3′；glu2：5′-CGGTTAGAC TAGCCACTTCTGGTAAA-3′，片段長度約139 bp。

1.3 影響B.glumae產毒黃素因素分析

1.3.1 溫度及營養條件對B.glumae產毒黃素的影響

將濃度為108 cfu/mL菌液按1∶1 000分別接種至300 mL LB和PPG液體培養基（馬鈴薯 50 g，多胨10 g，甘油20 mL，NaCl 3 g，蒸餾水定容至1 L，pH 7.0）[17]，置于不同溫度的培養箱培養至相同的OD600，12 000 r/min離心2 min，轉移上清至新的三角瓶，加入等體積的氯仿，充分混勻萃取，12 000 r/min 離心10 min，將氯仿層轉移到新的容器，通過旋轉儀蒸干所得提取物即為毒黃素[21-22， 24]，加入5 mL 80%甲醇溶解毒黃素，用分光光度計測量393 nm處的吸收值，分別以不接菌的空白LB和PPG為對照，每個處理3次重復。

1.3.2 平板法測定LMG2196產生的毒黃素

取20 μL LMG2196涂布在KB固體培養基上，置于各測定溫度（25、28、30、35、37和40℃）下倒置培養48 h，觀察平板上黃色色素（即毒黃素）的產生。

2 結果與分析

2.1 水稻細菌性穗枯病菌分離條件優化

2.1.1 B.glumae的特定生長溫度

B.glumae的生長溫度范圍較寬，在25～40℃均能生長（圖2～3），其最適生長溫度在35～40℃之間，是一種適合在較高溫度條件下生長的病原細菌。而一般的植物病原菌的最適生長范圍在28℃左右，不耐高溫且低溫不利于生長，故可以選用25℃或40℃作為分離溫度，這樣會抑制一些低溫不利其生長或不耐高溫的細菌和真菌生長，減少雜菌。

2.1.2 B.glumae在不同培養基上的菌落形態

B.glumae LMG2196能在多種培養基上生長，在不同培養基上其生物學特性有差異。在KB、LB、NA、PDA上的菌落均呈圓形、隆起、灰白色，邊緣光滑。在KB、LB、NA平板上生長較好，菌落相對較大（直徑在0.70 mm左右），其中在KB平板上菌落密集處的培養基呈黃色；在NA上LMG2196菌落聚集區域培養基呈淡藍色，對光觀察更為明顯；在LB上菌落聚集區域培養基顏色幾乎無變化。LMG2196在PDA平板上生長較慢，菌落較?。ㄖ睆綖?.15～0.39 mm），培養基顏色幾乎無變化（圖4，表1）。因LB是細菌的通用培養基，也比較利于其他病原細菌的生長，故選用NA和KB培養基作為分離培養基，可以提高分離的準確性。

2.1.3 B.glumae對抗生素的敏感性

通過分析LMG2196對抗生素的敏感性，發現該菌對Kan、Str、Rif比較敏感，而對Amp有抗性，能夠在含有Amp（工作濃度為50 μg/mL）的抗生素培養基中正常生長（表2），但很多植物病原菌（包括真菌和細菌）對Amp是敏感的，不能在含Amp培養基中生長。故在培養基中添加一定濃度的Amp，能進一步排除掉一些雜菌。

2.1.4 B.glumae分離條件篩選及驗證

在不同溫度、培養基以及抗生素條件下，接種環蘸取來源于感病樣品（圖1）的菌懸液劃線的平板上菌落數差異較大（表3，圖5）。40℃條件下，培養36 h，NA（Amp-）、NA（Amp+）、KB（Amp-）平板上菌落較多，且雜菌也多，有些菌落被長勢快的雜菌覆蓋，穗枯病菌形態的菌落較少；在KB（Amp+）平板上菌落總數較少，穗枯病菌形態的菌落也較少，故該條件不利于菌的生長。在25℃條件下，培養36 h，NA（Amp-）平板菌落總數及雜菌較多；NA（Amp+）、KB（Amp-）、KB（Amp+）平板上菌落數相似，但NA（Amp+）、KB（Amp-）雜菌落相對較多，只有KB（Amp+）平板上穗枯病菌形態的菌落最多且雜菌最少。故用含Amp的KB培養基在25℃條件下劃線培養36 h，分離效果最好。

接種環蘸取病樣菌懸液分別在KB（Amp+）和KB（Amp-）平板上劃線，25℃培養36 h，挑取13個光滑凸起、灰白色的單菌落做RT-PCR檢測分離菌。結果顯示，不含Amp的KB培養基對B.glumae分離率為23.1%，含Amp的KB培養基的分離率為61.5%（圖6），是優化前分離率的3倍左右，分離效率得到較大提高。故分離B.glumae時可選用含Amp的KB培養基，25℃培養36 h，挑取灰白色、光滑凸起的單菌落進行RT-PCR鑒定能更快速、準確地分離到B.glumae。

2.2 B.glumae產毒黃素與溫度的關系

在B.glumae能正常生長的溫度25、28、30、35、37、40℃條件下，B.glumae均能產生毒黃素。在菌體密度相同（OD600=3.5）條件下，不同溫度下的B.glumae產生毒黃素的量存在差異，且在相對較低的溫度25、28℃下也有毒黃素產生，與早期報道的低于28℃不產毒黃素[15]結果不一致，猜想早期研究中不產毒可能原因是B.glumae群體密度不同，群體感應影響了B.glumae毒黃素的產生[22]，其次可能是由于B.glumae的菌種不同，造成產毒黃素的能力不同。在相同溫度下，培養至相同菌體密度的B.glumae在不同的培養基產毒黃素的量不同，LB作為細菌的通用培養基，在相對低溫時易產毒黃素，28、30℃產毒黃素的量最多。PPG培養基作為B.glumae的產毒培養基更利于B.glumae產毒黃素，且在37℃產毒黃素最多（圖7）。

2.3 平板測定LMG2196產生毒黃素

B.glumae在KB培養基上能產生呈黃色的毒黃素，可用肉眼觀測到。LMG2196接種在KB平板上培養48 h后，各測定溫度下包括25℃的KB平板上均能觀測到毒黃素產生（圖8），與液體培養基培養條件下結果一致。運用平板接菌培養雖然不能定量描述毒黃素產生，但能直觀地呈現出毒黃素在不同溫度下的產生情況，充分證明LMG2196在25℃下能產毒黃素。

3 討論

本研究通過測定水稻細菌性穗枯病菌B.glumae標準菌株LMG2196在不同溫度條件下的生長曲線，發現該菌在相對較低的溫度25℃也可生長，但25℃卻不利于其他病原細菌和真菌生長，故選擇25℃作為水稻細菌性穗枯病樣的分離溫度可排除許多雜菌的干擾。另外，本研究首次證實B.glumae對氨芐青霉素（Amp）具有抗性。結合B.glumae在不同選擇性培養基上的菌落形態特征、對抗生素的敏感性以及生長溫度條件，建立了優化的B.glumae的分離方法：含50 μg/mL氨芐青霉素的KB培養基，25℃培養36 h。運用此優化的分離方法，可準確、快速、高效地從全國各地采取的感病標樣中成功分離到穗枯病病原菌，證實穗枯病已經在我國發生，做好該病的防治準備刻不容緩。

毒黃素作為B.glumae的主要致病因子，其合成受多種因素影響，至今報道影響B.glumae產毒黃素的因素主要有溫度和群體感應等[15， 22]。本文探究了溫度以及營養條件對B.glumae產毒黃素的影響。發現只要B.glumae達到一定群體密度，在低于28℃下也能產生毒黃素。在相同的培養時間內，B.glumae在不同的培養基中培養其產生毒黃素的量不同，表明其產毒黃素的能力與營養條件有密切關系。B.glumae產生毒黃素是一個非常復雜的過程，受多種因素調控。探明B.glumae產生毒黃素的復雜途徑，在實踐中通過阻斷B.glumae產毒黃素的任一途徑，可作為靶點篩選防治藥物，為今后防治該病害提供了新的思路。另外，有研究報道毒黃素具有抑菌、殺菌和抗腫瘤功效，掌握適宜產毒黃素的條件，為今后研究毒黃素在抑菌、殺菌和抗腫瘤方面的基礎和應用研究提供可能。

此外，還發現LMG2196是一種較耐高溫的細菌，在高達40℃培養條件下亦可生長。在當今全球變暖的情況下，B.glumae能在高溫下生長的特性無疑會對水稻生產造成越來越嚴重的危害。目前，由B.glumae引起的水稻穗枯病在我們的鄰國韓國、越南、日本大面積暴發流行，我國有著類似的環境，且在我國已有發生，對我國水稻生產也是一種威脅，需引起高度重視。

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（責任編輯：田 喆）