常溫大氣壓等離子體對番茄種帶細菌的滅菌效果

王玲玲 尚慶茂 李倩

摘要 為了明確常溫大氣壓等離子體（atmospheric pressure room-temperature plasma，APRTP）在番茄種子消毒中的應用效果，以‘中雜302種子為材料，采用平板培養計數和16S rRNA拷貝數分析法，測定了APRTP處理對種子表面和內部細菌的滅菌效果。結果表明，APRTP處理對種帶細菌的滅菌效果顯著，在5～30 min處理時間內，滅菌率隨處理時間延長逐漸升高，處理25 min對種子表面和內部細菌的滅菌率達99%以上；番茄種子接種細菌性潰瘍病致病菌—密執安棒桿菌密執安亞種（Cmm）后，采用APRTP處理25 min可有效殺滅99.84%的種帶Cmm菌；種子活力檢測表明，APRTP處理可提高番茄種子活力，加快種子萌發速率，APRTP處理過的種子播種后，對幼苗早期生長不會造成傷害。綜上，APRTP處理可顯著殺滅番茄種帶細菌，提高種子活力、促進種子萌發，是一種安全、高效的番茄種子處理方法。

關鍵詞 常溫大氣壓等離子體； 番茄； 種帶細菌； 種子活力

中圖分類號： S 436

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018042

Abstract Cultivar ‘Zhongza 302 seeds were used as materials to evaluate the sterilization effects of atmospheric pressure room-temperature plasma （APRTP） on seeds during tomato seed treatment. The bacteria on seed surface and in the seed were determined by analyzing the number of culturable bacteria and the 16S rRNA copies. The results showed that the sterilization effects of APRTP on tomato seed-borne bacteria were significant. The sterilization rate increased with the APRTP processing time increased from 5 to 30 minutes， and the sterilization rate could reach to more than 99% after APRTP treatment for 25 min for both surface bacteria and internal bacteria in the seed. APRTP was used to eliminateClavibacter michiganensis subsp.michiganensis （Cmm） inoculated to tomato seeds， the sterilization rate to Cmm could reach to 99.84% when samples were processed for 25 min. Furthermore， detection of seed vigor showed that APRTP treatment could increase the seed vigor， and thereby improve the germination potential and accelerate seed germination. After sowing， the APRTP-treated seeds showed no significant damages for the seedlings growth and development. Taken together， APRTP treatment showed significant sterilization effects on seed-borne bacteria and increased the seed vigor， indicating that it was an efficient and safe method for tomato seed treatment.

Key words atmospheric pressure room-temperature plasma； tomato； seed-borne bacteria； seed vigor

番茄Lycopersicon esculentumMill.是世界主栽蔬菜作物之一。番茄種子在制種、采收、運輸、包裝、貯存等各個環節都可能受到多種病原菌的侵染，導致其表面和內部帶菌，帶菌的種子是番茄苗期和成株期病害的主要初侵染源[1-2]。常見的番茄種傳病害如早疫病、炭疽病、枯萎病等真菌性病害，以及細菌性潰瘍病、斑疹病、瘡痂病等細菌性病害對產量和品質造成了巨大損失[1-4]。由密執安棒桿菌密執安亞種Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis（Cmm）引起的番茄細菌性潰瘍病近年來在國內外頻繁發生，造成的產量損失最高達80%以上[5]。對番茄種子進行消毒處理，對于防治種傳病害、降低發病率具有重要作用。

常規種子消毒處理方法有物理消毒法（如溫湯浸種、干熱滅菌、輻照殺菌等）、化學藥劑消毒（浸種、拌種等）和生物防治法等[6-7]。然而，溫湯浸種和干熱滅菌對耐熱性強的微生物殺菌效果不佳，溫度過高會影響種子發芽[6]，輻射處理對種子發芽有顯著抑制作用，且易誘變[8]。藥劑浸種一般用藥量大，易產生藥劑殘留，既影響種子活力，又會對環境造成污染[9]，且殺菌劑僅對一種或幾種病原菌起作用，消毒不徹底，部分種帶病原菌甚至對殺菌劑產生抗藥性[10]。生物防治法雖然安全、環保，但防治效果十分不穩定[11]。因此，廣譜、高效、無毒、對種子無副作用的消毒技術是種子消毒處理的發展趨勢。

常溫大氣壓等離子體（atmospheric pressure room-temperature plasma，APRTP）是一種常溫非平衡等離子體，是氣體在大氣壓下由于受到外部強輻射、高電壓或高強度磁場的作用而形成的接近室溫（25～40℃）的等離子體，其中含有大量活性物質，包括帶電粒子、具有化學活性的亞穩態物質（如臭氧、OH-自由基、氧原子、H2O2等）[12]。APRTP與樣品密切接觸，可對樣品表面微生物進行殺滅和分解[13-15]，因此APRTP已成為近年來一種新型的消毒技術，并因其殺菌效率高、處理時間短、無殘留等特點，廣泛應用于醫用消毒、果蔬保鮮、農產品消毒等方面[16-17]。APRTP處理可以有效地減少蘋果、檸檬、萵苣等果蔬表面的大腸桿菌、沙門氏菌、單核增生性李斯特菌、酵母菌等的數量，果蔬保鮮時間顯著延長[18-20]。在APRTP種子處理方面，研究人員在小麥、大豆、油菜等農作物上也進行了一些嘗試。研究者發現，在100 W/cm3的處理強度下，APRTP處理60 s可將接種于小麥種子表面的致病性鐮刀菌Fusarium nivale、F. culmorum全部殺滅[21]。在油菜Brassica campestris種子表面接種黑腐病致病菌Xanthomonas campestris，APRTP處理5 min后，種子帶菌量由6.6 log cfu減少到2.7 log cfu，處理40 min時，種子所帶病原菌幾乎被全部殺滅[22]。此外，研究還發現，APRTP處理可一定程度上提高小麥、大豆等種子的發芽勢和活力指數[23-24]。然而，對于蔬菜種子，尤其是番茄種子，目前尚無APRTP處理效果的研究報道。

本試驗以番茄種子為材料，分析APRTP處理不同時間對種子表面和內部所帶細菌的滅菌效果以及對種子活力和幼苗生長的影響，以期為番茄種子處理提供更加安全、高效的消毒技術。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置及供試材料

APRTP裝置由南京克普醫療科技有限公司研發，工作電壓220 V，頻率50 Hz，功率100 W，進氣量20 L/min。該裝置由氣泵、等離子體發生系統和氣體管路等組成（圖1）。工作時將起泡石浸沒于水中，氣泵壓縮空氣進入等離子體發生系統內部的放電腔室中，生成的等離子氣體通過氣體管路進入水中，產生活性水。

試驗用電導儀選用雷磁DDSJ-308A型，多功能pH計選用SG23-FK-CN型（Mettler-Toledo，美國），配置LE438電極和LE501電極，分別用于測定pH和氧化還原電位（ORP）。

番茄品種‘中雜302由中國農業科學院蔬菜花卉研究所培育。番茄細菌性潰瘍病致病菌Cmm由中國農業微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China）提供，菌株編號01233。

1.2 APRTP處理番茄種子

稱取番茄種子15 g，去離子水浸種6 h后，置于裝有900 mL無菌水的燒杯中，將起泡石浸沒于無菌水中，通入APRTP進行處理。處理時間分別為5、10、15、20、25、30 min（依次記為P5、P10、P15、P20、P25、P30），以未經處理的番茄種子作為對照（CK），以5% NaClO溶液消毒10 min的種子[25]作為陽性對照。

1.3 番茄種帶細菌的分離培養

番茄種子表面所帶細菌的分離參照Links等[26]的方法，分別隨機選取不同處理的種子各1 000粒，置于50 mL無菌三角瓶中，加入20 mL無菌PBS溶液（NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、Na2HPO4 1.44 g/L、KH2PO4 0.24 g/L，pH 7.4），25℃、150 r/min振蕩2 h，振蕩液經5 000 r/min離心20 min，棄上清， PBS溶液重懸沉淀，即為種子表面所帶菌的菌懸液。

番茄種子內部細菌的分離參照已有的文獻報道[27-28]，并加以改進，種子表面經滅菌處理（依次為80%乙醇2 min，5% NaClO 10 min）后，置于無菌研缽中研磨，研磨物中加入無菌PBS溶液，150 r/min振蕩2 h，經無菌紗布過濾，濾液5 000 r/min離心20 min，PBS溶液重懸沉淀，得到種子內部帶菌的菌懸液。

將上述所得菌懸液按10倍梯度稀釋后，分別涂布于TSA培養基（胰蛋白胨15 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉15 g/L，pH 7.0）上，37℃倒置培養12～16 h后，觀察、計數。

1.4 番茄種帶細菌16S rRNA拷貝數分析

利用實時熒光定量PCR（Real-time PCR）法測定樣品中細菌的16S rRNA拷貝數[26]。

1.4.1 16S rRNA拷貝數標準曲線的繪制

提取大腸桿菌Escherichia coliDH5α的基因組DNA，采用細菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增16S rRNA序列，采用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（ZYMO， USA）對PCR產物進行切膠回收，并采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）測定其濃度。使用ddH2O稀釋DNA至濃度為1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 ng/μL（1 ng模板對應的16S rRNA拷貝數為6.14×108），并以此為模板，采用通用引物SRV3-1（5′-CGGTCCAGACTCCTACGGG-3′）和SRV3-2（5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）對16S rRNA的V3區進行Real-time PCR擴增。PCR反應體系（20 μL）為：2×Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）10 μL，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板1.0 μL，用ddH2O補足20 μL。PCR反應程序為：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，55℃復性10 s，72℃延伸10 s，45個循環。以模板中16S rRNA拷貝數的log10值為橫坐標，以Real-time PCR所得的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 番茄種帶細菌16S rRNA拷貝數分析

取番茄種子表面和內部所帶菌的菌懸液，利用FastDNATMSpin Kit for Soil試劑盒（MPbio，USA）提取基因組DNA，并采用普通DNA產物純化試劑盒（天根，北京）對提取的基因組DNA進行純化。采用NanoDrop 2000測定DNA濃度。以純化后的細菌基因組DNA為模板，利用細菌通用引物SRV3-1和SRV3-2進行Real-time PCR擴增，PCR反應體系和程序同1.4.1。根據Real-time PCR反應的Ct值，結合標準曲線計算出各處理番茄種子表面和內部帶細菌的16S rRNA拷貝數。

1.5 番茄種子人工接種Cmm菌與計數

1.5.1 番茄種子Cmm菌的人工接種

Cmm菌由中國農業微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China）提供，菌株編號01233。Cmm菌活化后，接種于少量NB培養基（蛋白胨10 g/L、牛肉提取物3 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0）中，在30℃、150 r/min下振蕩培養至數量級為109cfu/mL，以1%的接種量接種于300 mL NB培養基中繼續培養至OD600為0.3～0.5。培養物在4℃、3 000 r/min離心15 min，棄上清，將菌體沉淀用無菌水重懸至菌濃度為108 cfu/mL，4℃保存備用。

稱取番茄種子15 g，去離子水浸種2 h，5% NaClO溶液消毒10 min，無菌水沖洗5遍后，將種子浸沒于Cmm菌懸液（1∶20，體積比）中6 h，種子取出后無菌條件下晾干。

1.5.2 番茄種帶Cmm菌的計數

將人工接種Cmm菌的番茄種子分別用APRTP處理0（CK）、5、10、15、20、25、30 min，方法同1.2。不同處理的種子各隨機選取1 000粒置于無菌三角瓶中，加入無菌PBS溶液，150 r/min振蕩2 h，將菌懸液用無菌水按10倍梯度稀釋后，涂布于NA培養基上，30℃倒置培養48～72 h，觀察、計數。

人工接種Cmm菌的番茄種子經APRTP處理后，提取種帶微生物DNA，并以此為模板，采用Cmm菌特異性引物PSA-4（5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′）和PSA-R（5′-TACTGAGATGTTT-CACTTCCCC-3′）進行Real-time PCR擴增[29]。DNA提取以及PCR反應體系和程序同1.4.1。根據Real-time PCR反應的Ct值，計算種帶Cmm菌的相對數量，設定CK種子所帶Cmm菌的數量為1.0。

1.6 番茄種子萌發率和活力測定

取不同處理的番茄種子，置于鋪有三層無菌濾紙的培養皿中，加入10 mL無菌水使濾紙充分浸濕，每皿放置100粒種子，每處理設3次重復，于28℃恒溫催芽箱中進行萌發，每隔0.5 d（12 h）統計種子發芽數（以胚根破殼或露白作為種子發芽的標志），計算發芽勢、發芽率、發芽指數和活力指數[23]：

發芽勢=（3 d內正常發芽種子數/供試種子總數）×100%；

發芽率=（7 d內正常發芽種子數/供試種子總數）×100%；

發芽指數Gi=∑Gt/Dt（Gt表示第t天發芽種子數，Dt表示相應的發芽天數）；

活力指數Vi=Gi×S（Gi表示發芽指數，S表示種子發芽長度）。

種子活力的測定參照鄒琦[30]的方法，分別取萌發0、24、48 h的不同處理的番茄種子各50粒，沿種胚縱切，置于0.1%的氯化四氮唑（TTC）溶液中，38℃條件下黑暗染色4 h。利用丙酮提取種子中TTC的還原產物—三苯基甲臜（TTF），利用分光光度計（UV-1700，Shimadzu）測定480 nm波長下的吸光度，根據標準曲線計算種子活力。種子活力以每克種子每小時生成的TTF的量表示。

1.7 番茄幼苗生長指標的測定

將不同處理的番茄種子播種于裝有草炭、蛭石、珍珠巖（3∶1∶1，V/V）混合基質的72孔穴盤中，每穴孔一粒種子。播種后15 d，每處理隨機抽取20株幼苗測定株高、莖粗、根體積、地上部干重、鮮重和根干重、鮮重，計算壯苗指數，測定方法參照禇群等[25]。

壯苗指數=莖粗（mm）/株高（mm）×全株干重（mg）。

1.8 數據處理與分析

試驗結果采用3次重復的平均值±標準差（mean±SD）表示，采用Excel 進行數據處理和作圖，采用SPSS軟件進行方差分析，運用鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性（P<0.05）檢驗。

2 結果與分析

2.1 番茄種子APRTP處理液pH、EC和ORP的變化

APRTP處理番茄種子過程中，處理液的pH、電導率（EC）和ORP的變化如圖2所示。APRTP處理5 min即可引起水的pH顯著降低，由6.42降低至4.68，處理10 min時，pH為4.31，之后隨著處理時間的延長，pH持續降低，至處理30 min時，pH只有3.54。與pH的變化相反，APRTP處理后，處理液的EC和ORP顯著升高，處理5 min時，EC和ORP分別是0 min時的24.15倍（28.55 μS/cm）和1.30倍（394.0 mV）。隨著處理時間的延長， EC值和ORP逐漸增大，至處理30 min時， EC值和ORP分別為163.15 μS/cm和459.65 mV。

2.2 APRTP處理對番茄種帶細菌的滅菌效果

APRTP處理不同時間后，番茄種子表面帶細菌情況如圖3所示，NaClO處理和APRTP處理對種子表面細菌均具有滅菌效果。隨著APRTP處理時間的延長，種子表面所帶細菌數量逐漸減少，滅菌率逐漸升高（表1），處理5 min時，種子表面滅菌率為85.49%；處理20 min時，滅菌率達到99%以上，與NaClO溶液的滅菌效果相當。

APRTP處理對番茄種子內部細菌也有滅菌效果，與表面細菌的變化趨勢一致，處理時間越長，種子內部細菌數量減少，滅菌率升高，但相較于對種子表面所帶細菌的滅菌效率，APRTP對內部細菌的滅菌效率較低（表1）。APRTP處理5 min時，滅菌率僅為19.08%；處理20 min時，滅菌率為50%左右；處理25 min時，滅菌率達到99.72%，與NaClO溶液的滅菌效果（99.73%）相當。

為了更加準確地測定APRTP處理對番茄種帶細菌的滅菌效果，采用16S rRNA拷貝數進一步表征種帶細菌數量的變化情況。結果如圖4所示，APRTP處理后，16S rRNA拷貝數顯著減少，且處理時間越長，拷貝數越少。對于種子表面細菌，處理時間低于10 min時，16S rRNA拷貝數仍保持在107/g數量級，滅菌率低于70%；處理15 min時，16S rRNA拷貝數降低至106/g數量級，滅菌率達到90%以上，至處理25 min時，滅菌率高達98%以上，滅菌效果與NaClO相當（圖4a）。

番茄種子內部細菌16S rRNA拷貝數隨APRTP處理也呈逐漸下降趨勢，但滅菌效果顯著低于種子表面細菌（圖4b）。所有處理后，16S rRNA拷貝數仍保持在106/g數量級。 處理5、10、15、20 min時滅菌率分別為10.12%、12.80%、18.23%和30.78%；處理25 min滅菌率顯著升高，達到了54.04%，與NaClO消毒處理的效果相當（56.76%）；至處理30 min時，滅菌率達到64.07%，優于NaClO的處理效果。

綜合細菌平板計數和16S rRNA拷貝數分析結果，APRTP處理對番茄種子表面和內部帶細菌均具有很好的滅菌效果，在5～30 min范圍內，隨著處理時間延長，滅菌率逐漸升高，且處理15～25 min時，滅菌率可達到NaClO溶液的處理效果。

2.3 APRTP處理對番茄種帶Cmm菌的滅菌效果

番茄種子人工接種細菌性潰瘍病致病菌Cmm后采用APRTP處理，分別采用平板計數和Real-time PCR分子方法檢測APRTP處理對種帶Cmm菌的滅菌效率，結果如圖5所示。APRTP處理對Cmm菌的滅菌效果十分顯著，處理5 min時滅菌率即可達到60%以上，處理15 min時滅菌率大于90%，至處理25 min時，對Cmm菌的滅菌率可達99.84%。

2.4 APRTP處理對番茄種子活力的影響

由圖6可知，APRTP處理對番茄種子活力具有促進作用，隨著APRTP處理時間的延長，種子活力呈先升高后降低的趨勢，以處理15 min（P15）和20 min（P20）的種子活力最高。萌發0 h時，P15和P20種子活力分別是CK的1.58倍和1.31倍；萌發48 h時，P15和P20種子活力是CK的1.81倍和1.69倍。當處理時間超過25 min時，種子活力略有降低，但仍高于CK。NaClO消毒處理后，番茄種子的活力較CK顯著降低。

APRTP處理后番茄種子的萌發速率顯著提高（圖7），萌發第2.5天時，CK種子的萌發率僅為13.51%，處理5、10 min的種子的萌發率顯著高于CK，分別為23.02%和28.13%，處理15～30 min種子的萌發率更高，達到55%以上；在萌發第4 天時，CK的萌發率僅為40.1%，APRTP處理后的種子萌發率均達到65%以上，處理時間超過15 min的種子，其萌發率達到75%左右，且萌發已趨于平臺期。

計算不同處理的番茄種子的發芽勢、發芽率、發芽指數Gi和活力指數Vi等參數，結果如表2所示。APRTP處理后，種子的發芽率未發生顯著變化。對于種子發芽率、Gi、Vi，APRTP處理后，各項參數均顯著升高，尤其是處理15～20 min時，種子的上述各項參數最高。NaClO處理后，種子的各項指數與CK相比無顯著差異?？梢?，APRTP處理可以顯著提高種子萌發速率，從而縮短萌發時間，提高萌發整齊度。

將APRTP處理的番茄種子播種于育苗基質中，并于播種后15 d測定幼苗的形態指標，如表3所示，APRTP處理的種子在出苗后，幼苗的株高、莖粗、地上部和地下部的鮮質量、干質量以及壯苗指數等與CK相比無顯著差異（P> 0.05），表明APRTP處理種子不會對番茄幼苗早期的生長發育造成傷害。

3 討論

在液體環境中，APRTP發生時產生大量帶電粒子、活性氧化物、活性氮化物等，使液體理化性質發生改變，導致液體酸化，同時產生NO-3、NO-2、H2O2等活性物質和離子[14-15， 31-32]。與上述報道結果一致，本研究發現，APRTP處理番茄種子過程中，處理液的理化性質發生了顯著變化，pH降低，EC和ORP升高，表明通過水對番茄種子進行APRTP處理是可行的。在傳統的APRTP處理作物種子時，多是將樣品放入等離子體發生裝置中直接處理，然而由于樣品形狀的不規則性，使得樣品表面的電場強度不均勻，進而導致處理效果不均一[33]。本研究中，水經APRTP處理后呈現較強的酸性和氧化性，且水的均勻性和流動性可以使APRTP的殺菌效果更加均一[34-35]。

通過對番茄種帶細菌的培養計數和16S rRNA拷貝數分析發現，APRTP處理對番茄種子表面細菌具有顯著的滅菌效果，這與對鷹嘴豆、小麥、油菜等種子的處理效果一致[21-22， 36]。APRTP處理20 min時，對種子表面細菌的滅菌率可達99%以上，與傳統的NaClO消毒處理的效果相當；此外，APRTP對番茄主要的種帶細菌性病害潰瘍病的致病菌Cmm的滅菌效果也十分顯著，表明APRTP處理可以作為一種有效的番茄種子消毒方法。分析APRTP的滅菌機理，存在以下幾個方面：首先，APRTP處理致使水酸化，改變了種子表面微生物的生存環境，引起細菌死亡。Ikawa等[37]發現當水的pH小于4.7時，細菌可被有效滅活。另外，APRTP處理后產生的活性氧等分子可直接氧化細胞壁的主要組分肽聚糖和細胞膜的主要組分磷脂雙分子層，破壞這些分子中的C-C、C-N和C-O鍵，導致細胞壁和細胞膜破裂和分解，細胞通透性改變，胞內物質流失，細胞死亡[38]?；钚匝趸镞€可直接與細菌的蛋白質和核酸大分子發生反應，導致蛋白質變性、DNA損傷而失活[39]。此外，APRTP發生過程中產生大量的帶電粒子吸附在細胞表面，同性電荷之間產生的靜電斥力也會破壞細菌外層的細胞壁或細胞膜，導致細胞死亡[14]。

本試驗進一步研究發現，APRTP處理對番茄種子內生細菌也有顯著的滅菌效果，這在傳統的以氣體為媒質進行的APRTP種子處理中尚無報道。盡管在相同處理時間下，APRTP對種子內生細菌的滅菌率較種子表面細菌低，處理25 min時，對種子內生細菌的滅菌率也可達到NaClO處理的效果。分析APRTP對種子內生細菌的滅菌原理，主要是在水中進行APRTP種子處理時，酸性水導致種子表面的細胞膜透性增加，種子吸水能力增強[40]，帶電粒子和活性氧等活性成分可隨種子吸水進入種子內部，破壞內生細菌的細胞壁、細胞膜、核酸等組分，從而殺滅細菌。

APRTP處理能顯著提高種子活力。有報道表明，APRTP處理后，大豆、小麥等種子的發芽勢顯著提高，種子發芽指數和活力指數顯著增加[23-24]。與已有的報道結果一致，本研究發現，APRTP處理后番茄種子活力顯著升高，發芽勢、發芽指數和活力指數顯著增加，種子萌發和出苗時間縮短。APRTP處理提高種子活力的原因是多方面的。首先，APRTP處理后水質酸化，酸化的環境可促進種皮蠟質皮層的破裂，增加種子表面膜透性，提高種子吸水性，種子內部有關酶活性升高，儲藏物質的分解代謝加快，從而提高種子活力，促進種子萌發[32， 36， 40]。其次，APRTP產生的活性成分在提高種子活力中也發揮重要作用。研究發現APRTP產生的H2O2是促進綠豆種子萌發的一個主要因素，其促進效果與0.01% H2O2處理效果相當[41]。對黃瓜種子的研究發現，APRTP處理產生的臭氧可以增加種皮透性，促進種子萌發[42]。此外，種子表面寄生的大量致病性微生物是阻礙種子萌發的主要原因之一，APRTP處理可以殺死種子表面微生物，凈化種子，從而有助于種子的萌發[43]。

APRTP處理可以顯著殺滅番茄種帶細菌，提高種子活力，縮短萌發時間，且對播種后幼苗的早期生長發育不會造成傷害，為番茄種子處理提供了一種安全、高效的處理方法。APRTP處理對番茄種帶細菌的滅菌效果是否具有選擇性？對番茄的其他種帶病原菌如尖孢鐮刀菌F. oxysporum等細菌以及番茄疫霉菌Phytophthora infestans（Mont.） de Bary等真菌是否具有滅菌效果呢？APRTP處理對番茄種子活力提高的原理和物質基礎是什么？對上述這些問題的解答和探索，將是下一步工作的重點。

參考文獻

[1] LOUWS F J， WILSON M， CAMPBELL H L， et al. Field control of bacterial spot and bacterial speck of tomato using a plant activator [J]. Plant Disease， 2001， 85（5）： 481-488.

[2] DE LEON L， SIVERIO F， LOPEZ M M， et al. Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis， a seedborne tomato pathogen： Healthy seeds are still the goal [J]. Plant Disease， 2011， 95（11）： 1328-1338.

[3] 楊文才. 番茄瘡痂病抗性遺傳研究和基因定位最新進展[J]. 園藝學報， 2013， 40（9）： 1731-1740.

[4] MANCINI V， ROMANAZZI G. Seed treatments to control seedborne fungal pathogens of vegetable crops [J]. Pest Management Science， 2014， 70（6）： 860-868.

[5] SEN Y， VAN DER WOLF J， VISSER R G F， et al. Bacterial canker of tomato： Current knowledge of detection， management， resistance， and interactions[J]. Plant Disease， 2015， 99： 4-13.

[6] 孟姍姍.四種帶菌蔬菜種子的干熱處理技術研究[D].北京：中國農業科學院，2014.

[7] 劉圣明，海飛，車志平，等.4種殺菌劑及其復配劑對番茄灰霉病菌的毒力[J].植物保護，2017，43（2）：230-234.

[8] 馬雅敏.西瓜種子細菌性果斑病菌檢疫性消毒技術研究[D].長沙：湖南農業大學，2014.

[9] 馬輝，廖國雄.5種藥劑的不同質量濃度處理對小麥陳種子發芽及田間成苗的影響[J].西北農業學報，2012，21（12）：43-47.

[10]劉圣明，高續恒，張艷慧，等.河南省番茄灰霉病菌對3種殺菌劑的抗藥性檢測[J].植物保護，2014，40（4）：144-147.

[11]彭麗莎，袁天成，李成瓊，等.十字花科作物根腫病生防菌研究進展[J].植物保護，2015，41（4）：16-22.

[12]喬長晟，趙男，石漫漫，等.基于核糖體工程理論的常壓室溫等離子體誘變篩選多殺菌素高產菌[J].中國生物工程雜志，2014，34（1）：74-78.

[13]LAROUSSI M. Nonthermal decontamination of biological media by atmospheric-pressure plasmas： Review， analysis， and prospects [J]. IEEE Transactions on Plasma Science， 2002， 30（4）： 1409-1415.

[14]DOBRYNIN D， FRIDMAN G， FRIEDMAN G， et al. Physical and biological mechanisms of direct plasma interaction with living tissue [J]. New Journal of Physics， 2009， 11： 26.

[15]LU Xinpei， YE Tao， CAO Yingguang， et al. The roles of the various plasma agents in the inactivation of bacteria [J]. Journal of Applied Physics， 2008， 104（5）： 1632.

[16]ALKAWAREEK M Y， ALGWARI Q T， LAVERTY G， et al. Eradication ofPseudomonas aeruginosa biofilms by atmospheric pressure non-thermal plasma[J]. PLoS ONE， 2012， 7（8）： e44289.

[17]BERARDINELLI A， PASQUALI F， CEVOLI C， et al. Sanitisation of fresh-cut celery and radicchio by gas plasma treatments in water medium [J]. Postharvest Biology and Technology， 2016， 111： 297-304.

[18]BHIDE S， SCHAFFNER D W， SALVI D， et al. Effect of surface roughness in model and fresh fruit systems on microbial inactivation efficacy of cold atmospheric pressure plasma[J]. Journal of Food Protection， 2017， 80（8）： 1337-1346.

[19]MIN S C， ROH S H， NIEMIRA B A， et al. In-package inhibition ofE. coli O157： H7 on bulk Romaine lettuce using cold plasma [J]. Food Microbiology， 2017， 65： 1-6.

[20]NIEMIRA B A. Cold plasma decontamination of foods [J]. Annual Review of Food Science and Technology， 2012， 3： 125-142.

[21]ZAHORANOVA A， HENSELOVA M， HUDECOVA D， et al. Effect of cold atmospheric pressure plasma on the wheat seedlings vigor and on the inactivation of microorganisms on the seeds surface[J]. Plasma Chemistry and Plasma processing， 2016， 36： 397-414.

[22]NISHIOKA T， TAKAI Y， MISHIMA T， et al. Low-pressure plasma application for the inactivation of the seed-borne pathogen Xanthomonas campestris[J]. Biocontrol Science， 2016， 21（1）： 37-43.

[23]LI Ling， JIANG Jiafeng， LI Jiangang， Et al. Effects of cold plasma treatment on seed germination and seedling growth of soybean [J]. Scientific Reports， 2014（4）： 5859-5865.

[24]MENG Yiran， QU Guangzhou， WANG Tiecheng， et al. Enhancement of germination and seedling growth of wheat seed using dielectric barrier discharge plasma with various gas sources [J]. Plasma Chemistry and Plasma Processing， 2017， 37（4）： 1105-1119.

[25]褚群， 董春娟， 尚慶茂. γ-聚谷氨酸對番茄穴盤育苗基質礦質養分供應及幼苗生長發育的影響[J]. 植物營養與肥料學報， 2016， 22（3）： 855-862.

[26]LINKS M G， DEMEKE T， GRAGENHAN T， et al. Simultaneous profiling of seed-associated bacteria and fungi reveals antagonistic interactions between microorganisms within a shared epiphytic microbiome onTriticum andBrassica seeds [J].New Phytologist， 2014， 202： 542-553.

[27]鄒媛媛， 劉琳， 劉洋， 等. 不同水稻品種種子固有細菌群落的多樣性[J]. 植物生態學報， 2012， 36 （8）： 880-890.

[28]MIDHA S， BANSAL K， SHARMA S， et al. Genomic resource of rice seed associated bacteria [J]. Frontiers in Microbiology， 2016， 6： 1551-1558.

[29]PASTRIK K H， RAINEY F A. Identification and differentiation ofClavibacter michiganensissubspecies by polymerase chain reaction-based techniques [J].Journal of Phytopathology， 1999， 147： 687-693.

[30]鄒琦.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農業出版社，2000.

[31]SHEN Jin， TIAN Ying， LI Yinglong， et al. Bactericidal effects againstS.aureus and physicochemical properties of plasma activated water stored at different temperatures[J]. Scientific Reports， 2016（6）： 28505.

[32]SIVACHANDIRAN L， KHACEF A. Enhanced seed germination and plant growth by atmospheric pressure cold air plasma： combined effect of seed and water treatment[J]. RSC Advances， 2017， 7：1822-1832.

[33]BUTSCHER D， ZIMMERMANN D， SCHUPPLER M， et al. Plasma inactivation of bacterial endospores on wheat grains and polymeric model substrates in a dielectric barrier discharge [J]. Food Control， 2016， 60： 636-645.

[34]KAMGANG-YOUBI G， HERRY J M， MEYLHEUC T， et al. Microbial inactivation using plasma activated water obtained by gliding electric discharges [J]. Letters in Applied Microbiology， 2009， 48（1）： 13-18.

[35]ERCAN U K， WANG H， JI H F， et al. Nonequilibrium plasma-activated antimicrobial solutions are broad spectrum and retain their efficacies for extended period of time[J]. Plasma Processes and Polymers， 2013， 10（6）： 544-555.

[36]MITRA A， LI Y F， KLAMPFL T G， et al. Inactivation of surface-borne microorganisms and increased germination of seed specimen by cold atmospheric plasma[J]. Food and Bioprocess Technology， 2014， 7： 645-653.

[37]IKAWA S， KITANO K， HAMAGUCHI S. Effects of pH on bacterial inactivation in aqueous solutions due to low-temperature atmospheric pressure plasma application [J]. Plasma Processes and Polymers， 2010， 7（1）： 33-42.

[38]YUSUPOV M， BOGAERTS A， HUYGH S， et al. Plasma-induced destruction of bacterial cell wall components： a reactive molecular dynamics simulation [J].Journal of Physical Chemistry C， 2013， 117（11）： 5993-5998.

[39]MONTIE T C， KELLY-WINTENBERG K， ROTH J R. An overview of research using the one atmosphere uniform glow discharge plasma （OAUGDP） for sterilization of surfaces and materials [J]. IEEE Transactions on Plasma Science， 2000， 28（1）： 41-50.

[40]BORMASHENKO E， GRYNYOV R， BORMASHENKO Y， et al.Cold radiofrequency plasma treatment modifies wettability and germination speed of plant seeds[J]. Scientific Reports， 2012， 2： 741-748.

[41]ZHOU Renwu， ZHOU Rusen， ZHANG Xianhui， et al. Effects of atmospheric-pressure N2， He， Air， and O2 microplasmas on mung bean seed germination and seedling growth [J]. Scientific Reports， 2016（6）： 32603.

[42]丁明， 鄒志榮， 黃丹楓. 臭氧水浸種對黃瓜種子萌發及幼苗生長的影響[J]. 植物生理學通訊， 2004， 40（6）： 686-688.

[43]SINCLAIR J B.Control of seedborne pathogens and diseases of soybean seeds and seedlings [J].Pesticide Science，1993，37（1）： 15-19.

（責任編輯：田 喆）