大鼠肺缺血再灌注損傷中阿米洛利的作用機制分析

劉偉存

[摘要]目的 探討大鼠肺缺血再灌注損傷中阿米洛利的作用機制。方法 選擇雄性實驗大鼠72只作為研究對象，隨機分成三組，每組24只，分別為IR組（缺血再灌注）、假手術組（C組）、阿米洛利組（A組），分別在缺血45 min、再灌注60 min和120 min 3個不同時點將各組實驗大鼠麻醉處死后取血漿和右肺組織，并對其進行檢測。結果 IR組再灌注60、120 min時，丙二醛（MDA）、凋亡指數（AI）較假手術組均有明顯升高，阿米洛利組在給予藥物后，MDA、AI與IR組比較均有明顯降低（P<0.05）。與假手術組相比，IR組各個時點的肺組織濕/干質量比（W/D）和髓過氧化物酶（MPO）活性均顯著增高（P<0.05），而阿米洛利給藥后肺組織W/D和MPO活性則顯著降低。結論 阿米洛利對肺缺血再灌注損傷具有很強的保護作用，這可能是通過減少鈣離子，從而清除體內過量的氧自由基，達成抑制中性粒細胞浸潤和減少細胞凋亡的目的。

[關鍵詞]肺缺血再灌注損傷；阿米洛利；氧自由基

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）3（b）-0021-03

Analysis on mechanism of effects of Amiloride on rats with pulmonary ischemia reperfusion injury

LIU Wei-cun

Department of Respiration，Kailuan General Hospital of Tangshan City in Hebei Province，Tangshan 063000，China

[Abstract]Objective To explore the mechanism of effects of Amiloride on rats with pulmonary ischemia reperfusion injury.Methods Seventy-two experimental male rats were selected and randomly divided into the IR group （the ischemia reperfusion group），the sham operation group （group C） and the Amiloride group （group A），24 rats in each group.After 45 min ischemia，60 min reperfusion and 120 min，rats in each group were anesthetized and killed，then plasma and right lung tissues were taken and detected.Results At 60 and 120 min reperfusion，malondialdehyde （MDA），apoptosis index （AI） in the IR group were significantly higher than those in the sham operation group.The Amiloride group was given drugs，MDA and AI were significantly lower，compared with the IR group （P<0.05）.Compared with the sham operation group，the lung wet/dry weight ratio （W/D） and myeloperoxidase （MPO） activity in the IR group at each time point were significantly increased （P<0.05），while Amiloride after administration，the W/D in lung tissue and MPO activity decreased significantly.Conclusion Amiloride on lung ischemia reperfusion injury has a strong protective effect，this may be by reducing calcium ion，so as to remove the body of excess oxygen free radicals and inhibition of neutrophil infiltration and reduce cell apoptosis of purpose.

[Key words]Lung ischemia-reperfusion injury；Amiloride；Oxygen free radicals

近幾年，由于藥物和醫術的精進使得患者心肺復蘇、肺栓塞和心臟轉流等都得到了改善，但是仍然有影響因素，其中最重要的就是肺缺血再灌注損傷[1]。阿米洛利是一種交換抑制劑，其主要是交換Na+/H+，國外很多文獻中都提到了交換劑在心肌缺血再灌注損傷中的作用，其主要作用就是能夠起到抗氧化和抗炎的作用，但在肺缺血再灌注損傷中是否有一定的保護作用目前沒有相關實驗和文獻的印證[2]。本研究對建立肺缺血再灌注大鼠進行模型建造，旨在研究阿米洛利在肺缺血再灌注方面的相關作用。

1材料與方法

1.1實驗藥品與試劑

阿米洛利粉劑購自美國Sigma公司；肝素鈉注射液購自上海生物化學試劑有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒和髓過氧化物酶（MPO）試劑盒購自南京生物工程研究所；戊巴比妥鈉注射液購自上海試劑三廠；凋亡檢測試劑盒購自北京生物有限技術公司。

1.2實驗動物與分組

72只健康雄性SPF級Sprague-Dawley（SD）大鼠由華北理工大學實驗動物中心提供，體重180～220 g，動物生產合格證號為SCXK冀20061026-0001795。給予充分飼料和飲水1周后進行實驗。SD大鼠隨機分為三組，每組24只。IR組（缺血再灌注）：先開胸游離右肺門，然后進行夾閉阻隔，之后繼續完成灌注。假手術組（C組）：先開胸游離右肺門后，但是對其不進行夾閉阻隔。阿米洛利組（A組）：使用5 mg/（kg·d）的阿米洛利連續灌胃，時間為1周，1周之后進行手術，剩余操作和IR組一致，無區別[3]。IR組和C組在相同時間點內注入等量的生理鹽水。

1.3大鼠模型的建立

選擇健康的SD大鼠（由華北理工大學實驗動物中心提供），腹腔注射3%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）對其進行麻醉。仰臥位固定，將器官切開后進行插管，然后連接動物呼吸機，幫助大鼠通氣，動物呼吸機的設置要求：呼吸頻率60次/min，在經胸骨右邊第3～5肋之間開胸，游離右肺門，穿入手術線，等待5 min，然后夾閉45 min，之后建成模型[4]。

1.4標本采集及檢測

缺血45 min及再灌注60 min和120 min后收集全血，3000 r/min離心10 min取上清，采集新鮮右肺組織，-80℃保存備用。

1.4.1血清MDA含量測定 腹主動脈抽血3 ml，3000 r/min離心10 min，分離血清用硫代巴比妥酸（thiobarbituric aci，TBAd）法對血清中的MDA進行檢測。

1.4.2肺組織MPO測定 獲取右肺上葉相同部位肺組織1 g，取得之后制備成勻漿，最后把制備好的勻漿進行離心，離心之后取上清液用比色法測MPO。

1.4.3對肺組織濕/干重比值（W/D）進行測定 獲取大鼠1 g右肺中葉組織，使用分析天平進行稱量，稱量得到的質量稱為濕質量，然后將其放在70℃電熱恒溫進行干燥，干燥之后得到的質量稱為干質量，其中濕質量和干質量的比例是W/D[5]。

1.4.4肺組織細胞凋亡指數（AI）的檢測 獲取一小塊右肺中葉進行固定，固定液選用10%的甲醛溶液，固定之后將其使用常規石蠟進行包埋，對大鼠右側肺中葉的凋亡細胞進行定量檢測。對細胞進行染色，細胞核染色之后呈現棕黃色，也是陽性細胞，除去細胞核之后，還會有部分細胞質也會著色顯示為黃色[6]。一些細胞質由于細胞核DNA碎片漏出導致出現陽性著染。對切片進行觀察，觀察使用工具是切片光鏡。

1.4.5病理檢查 獲取一定量的組織塊，以10%的甲醛溶液進行固定后再進行包埋，切片，HE染色，最后在光鏡下觀察切片的變化。

1.5統計學方法

采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1血漿MDA和肺AI在不同時點的變化情況

各組不同灌注時間點的MDA和AI值比較，差異無統計學意義（P>0.05）；各組缺血45 min時的MDA、AI比較，差異無統計學意義（P>0.05）。IR組灌注60、120 min時的MDA、AI明顯提升，且顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.2肺組織W/D和MPO活性在不同時點的變化情況

各組內不同灌注時間點上的肺組織W/D和MPO活性比較，差異無統計學意義（P>0.05）；在不同灌注時點，IR組與A組的肺組織W/D和MPO活性顯著高于C組，差異有統計學意義（P<0.05），且IR組的肺組織W/D和MPO活性顯著高于A組，差異有統計學意義（P<0.05）（表1）。

2.3肺組織經病理學驗證情況分析

正常對照組的肺組織形態無任何明顯變化，然后肺泡腔中會變得壁薄，無充血、水腫等情況。缺血再灌注發生45 min之后，就會出現一些癥狀，主要是血管出現充血，血管出現充血之后，肺泡之間會產生炎性細胞，炎性細胞增多，細胞的損傷程度也會加重。

3討論

肺缺血再灌注損傷的病理原因非常復雜，目前尚不明確，研究顯示，氧自由基增多，鈣離子量也變多，炎癥細胞也增多，這些物質增多之后就會聚集在一起，然后造成細胞凋亡，這些在肺缺血再灌注損傷的發展過程中起著非常關鍵的作用[7]，因此部分學者認為可以主要在這幾個方面進行干預，通過這些干預措施實驗對肺缺血再灌注損傷的保護[8]。

器官缺血出現再灌注損傷的重要因素是出現氧自由基，氧自由基可以分解患者體內細胞間質的酶和膠原，使得組織器官受到極大損傷，MDA是氧自由基在攻擊其他組織時產生的產物[9]，其含量可以直接決定到體內氧化負電荷的大小，是判斷產生氧自由基和組織受到損傷的主要指標，在實驗過程中也能觀察到。在IR組中，灌注時間越長，LVIDA值越大，提示肺缺血再灌注損傷出現在體內能夠破壞氧自由基，使得氧自由基平衡徹底被破壞，增加氧自由基，誘發肺水腫和出血癥。注射阿米洛利之后，MDA雖然也增多，但是增加的幅度沒有IR組大，其降低效果也比較明顯，提示阿米洛利具有很強的抗氧化能力，抑制自由基產生，減少肺缺血再灌注損傷。

肺缺血再灌注損傷情況的出現和繼續發展與中性粒細胞的激活和聚集有著非常緊密的聯系[10]。出現這種情況之后，經過呼吸作用釋放出極多的氧自由基和蛋白水解酶，出現的蛋白水解酶會損傷肺血管組織和肺血管組織周圍的器官，使得肺泡中的上皮細胞受到損傷。MPO是一種特異性酶，而且還是一種中性粒細胞，其含量可以用中性粒細胞來測定。實驗結果顯示，注射阿米洛利之后，MPO量明顯降低，提示注射阿米洛利能夠有效減弱肺缺血再灌注損傷時中性粒細胞的聚集情況。

文獻顯示，細胞凋亡情況主要和缺血灌注損傷有關系，當處于肺缺血再灌注損傷情況下，患者體內會快速出現大量的氧自由基和鈣離子，這兩種物質增加，細胞凋亡情況就會加重[11]。本研究結果顯示，在缺血情況出現多于30 min時，IR組與C組比較，差異無統計學意義；隨著灌注時間的延長，IR組內AI會快速增長，2 h達到最高值，這一結果和國內相關報道的內容一致。本研究結果還顯示，A組也升高，但是和IR組比較，數值還是比較低，提示阿米洛利能夠抑制肺缺血再灌注損傷，減輕細胞凋亡情況，減少患者損傷情況。

Na+/H+交換體屬于一種抑制交換體，也稱為NHE（Na+/H+ exchanger），在缺血灌注中體現出了陽離子的作用，表明在患者處于一種缺血狀態時，患者體內的酸中毒情況會逐漸加重，隨機NHE也會被激活[12]。但是在血液轉運過程中卻因為細胞出現酸中毒情況而被抑制發展，當再次灌注之后，患者體內的血流會恢復正常，細胞中毒情況也會得到改善，糾正細胞內酸中毒，而且還能聚集鈉離子[13]。這是因為ATP量開始減少，Na泵不能排除鈉離子，使得Na+/Ca2+交換體從反方向開始轉出，轉出鈉離子的同時還會攝入鈣離子，使得鈣超量，由此造成了氧自由基增多、出現多種炎癥反應和患者體內細胞凋亡情況，從而加重了患者的病癥。阿米洛利是一種抑制劑，屬于Na+/H+交換抑制劑，主要作用是推測患者體內的氧自由基是否得到抑制，患者細胞凋亡情況是否得到改善[14]。

目前評價肺水含量和微血管損傷的治療是肺組織W/D，本研究主要是對IR組灌入W/D，灌入之后其性能還是非常高，提示阿米洛利對于干預患者體內的病癥是非常有作用的；同時，也在檢查的切片中觀察到患者注射阿米洛利之后肺水腫和體內炎癥的變化情況，和IR組比較，患者的癥狀得到了明顯的改善，提示阿米洛利的作用是清除患者體內的氧自由基，從而從根本減少患者體內的中性粒細胞[15]。

綜上所述，阿米洛利對肺缺血再灌注損傷有著很強的保護作用，這可能與其抑制作用有關，由此來減少鈣離子，繼而減少人體內分解出的氧自由基，實現抑制患者體內中性顆粒細胞的浸潤和減少人體內細胞的凋亡。

[參考文獻]

[1]杜旭升，白潔，李建英，等.阿米洛利對肺缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響[J].陜西醫學雜志，2014，43（6）：656-658.

[2]蔡燚，李慶節，林爽，等.阿米洛利與白藜蘆醇對肝缺血再灌注損傷的保護作用[J].臨床和實驗醫學雜志，2010，9（8）：561-563.

[3]王峰，王培，盧才義，等.Na+/H+交換阻滯劑對離體鼠心缺血后再灌注損傷的保護作用[J].空軍總醫院學報，1993，9（1）：9-12.

[4]張三妹.阿米洛利對大鼠腦缺血再灌注損傷保護作用的實驗研究[D].太原：山西醫科大學，2008.

[5]杜旭升.阿米洛利對大鼠肺臟缺血再灌注損傷保護作用的研究[D].太原：山西醫科大學，2008.

[6]李雪卿.阿米洛利對大鼠全腦缺血/再灌注損傷的影響[D].石家莊：河北醫科大學，2008.

[7]杜旭升，趙卉，李建強.阿米洛利對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護作用[J].中國藥物與臨床，2008，8（2）：100-102.

[8]張三妹，李光來.阿米洛利對大鼠腦缺血再灌注損傷后ATP酶的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6（2）：186-188.

[9]張三妹，李光來.阿米洛利對大鼠腦缺血再灌注損傷后線粒體SDH的影響[J].臨床醫藥實踐雜志，2008，4（1）：17-19.

[10]胡若愚，邵宏濤，董國華，等.阿米洛利同系物對老齡大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用[J].實用醫學雜志，2007，6（1）：40-43.

[11]朱萬琴，柳松.阿米洛利同系物和心肌缺血預處理對再灌注心肌的影響[J].中國醫科大學學報，2002，3（3）：45-46.

[12]王紅杰，馬青，張達仁，等.Na+/H+交換抑制劑對離體鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用[J].中華麻醉學雜志，2000， 4（4）：36-39.

[13]程嵐，姚偉星，夏國瑾.阿米洛利對大鼠缺血-再灌注損傷心肌的保護作用[J].同濟醫科大學學報，1998，23（5）：403-404.

[14]王峰，盧才義，劉宣力，等.Na+-H+交換阻滯劑對離體鼠心缺血后再灌注損傷的保護作用[J].中國病理生理雜志，1993，7（3）：63-66.

[15]莫顯剛，王蘭，洪偉，等.阿米洛利抑制載脂蛋白A1誘導小鼠巨噬細胞ABCA1的降解[J].中國動脈硬化雜志，2016， 24（3）：234-238.

（收稿日期：2017-12-15 本文編輯：祁海文）