參麥注射液對急性束縛性應激大鼠大腦皮質Bcl-2/Bax表達及炎癥因子的影響*

郟丹赟 王均爐 莫云長 耿武軍 戴勤學

（溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江 溫州 325000）

參麥注射液具有益氣固脫、養陰生津、生脈等功效，目前已廣泛用于治療心血管、呼吸、神經系統疾?。?-2]。參麥注射液作為一種急診用藥，大量研究表明其對神經元損傷和大腦皮質具有保護作用［2-3]。急性應激是機體在各種危重情況下導致的全身性非特異性適應性反應，會導致大腦皮質炎癥因子分泌的增加［4]。研究表明，急性應激會使大腦功能減退，造成神經元損害［5]?；蛘{控的自主性、程序性細胞死亡過程控制著神經細胞凋亡過程，Bcl-2基因對細胞凋亡發揮抑制作用，Bax基因則對細胞凋亡發揮促進作用，二者是一對比較成熟的基因［6]。本實驗通過建立急性束縛性應激大鼠模型，觀察參麥注射液預處理后大鼠大腦皮質Bcl-2/Bax和炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的表達，探討參麥注射液在急性應激方面的作用及其可能機制?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性 SD 大鼠 24只，體質量（250±10）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

1.2 試藥及儀器

參麥注射液（正大青春寶藥業有限公司，批號：）。束縛器 （ZH-TXQ，杭州雷琪實驗器材有限公司，中國）；大鼠皮質酮（CORT）和促腎上腺皮質激（ACTH）ELISA試劑盒和大鼠炎癥因子（TNF-α和IL-6）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；TRIzol試劑盒（15596，Invitrogen，USA），反轉錄試劑盒（BS-PCR005，Bio-Serve），PCR 擴 增 采 試 劑 盒 （BS-PCR003，Bio-Serve）；10%水合氯醛；酶標儀 （DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo，芬蘭）；0.9%氯化鈉注射液；定量PCR儀器 （ABI7500，ABI，USA）； 微量分光光度計（NanoDrop1000，Thermo，USA）。 BCA 蛋白質定量試劑盒（p0012，碧云天）。

1.3 分組與造模

SD大鼠按隨機數字表法分為正常對照組、參麥對照組、模型組、參麥預處理組，每組6只。模型組和參麥預處理組大鼠均行急性束縛應激模型制備［7]：采用ZH-TXQ型專業大白鼠固定器，抓住大鼠尾端，其本能的鉆入束縛器，然后調節束縛器的長度使大鼠制動2 h。參麥預處理組于制模前30 min腹腔注射參麥注射液15mL/kg，模型組與相同時間點腹腔注射0.9%氯化鈉注射液15mL/kg。正常對照組和參麥對照組不制模，僅于相應時間點分別注射等量0.9%氯化鈉注射液或參麥注射液［3，8]。本實驗中動物模型建立和處理方法符合動物倫理學標準。

1.4 標本采集與檢測

1.4.1 激素測定 于制模前和制模后腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉大鼠，取內眥靜脈血1mL，收集在冷凍過的肝素化小離心管（EP管）中，4℃下離心15min，取血漿于-20℃保存待測。用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測促腎上腺皮質激素（ACTH）和皮質酮（CORT）水平。

1.4.2 實時熒光定量反轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）測定Bcl-2、BaxmRNA表達 于制模后30min麻醉大鼠，活殺取大腦，冰上游離皮質組織，快速置于-80℃液氮中保存。用TRIzol法提取皮質RNA和甲醛變性，凝膠電泳測試完整性，在波長260 nm和280 nm處測定RNA吸光度（A）值，計算RNA的純度和濃度。反轉錄成cDNA，引物由GeneBank使用基因探索者軟件自行設計，引物序列見表1。反應條件：95℃、3min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35～40 個循環；最后72℃、15 min。以目的基因與內參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的A值比值表示目的基因表達量。

表1 引物序列

1.4.3 蛋白質免疫印跡試驗（Western Blot）測定Bcl-2、Bax蛋白表達 取大鼠大腦皮質組織，提取蛋白質，用BCA法定量蛋白質，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉膜、封閉，抗體孵育，將膜置于反應液中，室溫孵育，X線曝光膠片。掃描圖片，用AlphaEaseFC 4.0軟件分析特異條帶的灰度值并數字化，以Bcl-2或Bax蛋白與內參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白表達量。

1.4.4 炎癥因子測定 于制模后30 min麻醉大鼠，活殺取大腦，冰上游離皮質組織，按按照ELISA試劑盒說明書上操作方法檢測大腦皮質炎癥因子TNF-α、IL-6水平。

1.5 統計學處理

應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，制模前后兩組數據比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 模型組大鼠造模前后激素水平比較

見表2。大鼠急性束縛應激后血漿ACTH和CORT水平均明顯高于應激前（均P＜0.01）。

表2 模型組大鼠急性束縛性應激前后血漿ACTH和CORT 水平比較（分，±s）

表2 模型組大鼠急性束縛性應激前后血漿ACTH和CORT 水平比較（分，±s）

與造模前比較，*P＜0.01。

時 間 n ACTH（pmol/L） CORT（nmol/L）造模前 6 547.397±13.538 2.921±0.490造模后 6 957.697±52.776* 8.982±0.970*

2.2 各組大鼠大腦皮質Bcl-2、Bax mRNA表達水平比較

見表3。與正常對照組和參麥對照組比較，模型組Bcl-2 mRNA表達明顯降低，BaxmRNA表達明顯增高（均P＜0.01）。與模型組比較，參麥預處理組Bcl-2 mRNA表達明顯增高，Bax mRNA表達明顯降低 （均P＜0.01）。參麥對照組與正常對照組Bcl-2、BaxmRNA表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠大腦皮質Bcl-2、BaxmRNA表達水平及蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠大腦皮質Bcl-2、BaxmRNA表達水平及蛋白表達水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01；與正常對照組和參麥對照組比較，△P＜0.01。下同。

組 別 mRNA表達（A值）蛋白表達（灰度值）正常對照組 Bcl-2 2.48±0.14 0.83±0.04（n＝6） Bax 0.83±0.07 0.89±0.02參麥對照組 Bcl-2 2.79±0.13 0.83±0.03（n＝6） Bax 0.81±0.03 0.85±0.02模型組 Bcl-2 1.76±0.07△ 0.81±0.03（n＝6） Bax 2.72±0.13 1.05±0.04△參麥預處理組 Bcl-2 2.68±0.06* 0.82±0.03（n＝6） Bax 0.82±0.08* 0.85±0.02*

2.3 各組大鼠大腦皮質Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

見表3，圖1。模型組Bax蛋白表達較正常對照組和參麥對照組明顯增高（均P＜0.01）；而參麥預處理組Bax蛋白表達較模型組明顯降低 （P＜0.01）。各組間Bcl-2蛋白表達差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 蛋白質免疫印跡試驗（Western Blot）檢測各組大鼠大腦皮質組織Bcl-2、Bax蛋白表達

2.4 各組大鼠大腦皮質炎癥因子TNF-α、IL-6表達水平比較

見表4。模型組炎性因子TNF-α、IL-6表達較正常對照組和參麥對照組明顯增高（均P＜0.01）；而參麥預處理組炎性因子TNF-α、IL-6表達較模型組明顯降低（均P＜0.01），與正常組和參麥對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠大腦皮質炎癥因子TNF-α、IF-6表達水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠大腦皮質炎癥因子TNF-α、IF-6表達水平比較（pg/mL，±s）

組 別 n TNF-α IF-6正常對照組 6 38.50±0.52* 50.31±1.75*參麥對照組 6 38.48±0.66* 49.62±2.17*模型組 6 84.41±7.44 145.62±7.03參麥預處理組 6 44.66±2.04* 53.68±2.44*

3 討 論

急性應激是現代生活中的社會常態。應激時糖皮質激素會增加（人體為皮質醇，大鼠為CORT），而激素長期增加會產生一系列生理病理變化［9-10]。應激時，應激性代謝反應會激活下丘腦-垂體軸，這個反應過程會使ACTH和CORT的量上升，從而觸發后續炎癥、免疫及行為改變［10]。本研究顯示，制模后血漿ACTH和CORT水平明顯高于制模前，表明急性束縛性應激動物模型制備成功。

應激是多種神經系統疾病的危險因素，其可以通過改變大腦的神經營養因子，導致神經損傷。本研究小組早期用急性束縛性應激，發現大鼠海馬組織里的腦源性神經營養因子（BDNF）的表達明顯下降［7]。在神經損傷過程中，Bcl-2和Bax家族在調控細胞凋亡中占據重要地位，Bcl-2蛋白是存在于細胞線粒體、核膜等處的一種膜合蛋白，可中斷減弱凋亡信號的傳遞，具有抑制細胞凋亡和延長細胞壽命的作用；Bcl-2的同源蛋白Bax蛋白可以加速細胞凋亡，并且抑制Bcl-2的效應［11-12]。Bcl-2和Bax蛋白微量存在于正常細胞中，處于一種平衡狀態，當細胞受到損害時，這種平衡相應改變，發動一系列損害效應［6]。本實驗顯示，給予急性束縛性應激時，大腦皮質組織中Bcl-2mRNA表達明顯降低，而Bax的mRNA和蛋白表達明顯增高，Bcl-2蛋白表達有一定降低，但差異無統計學意義，也間接地佐證了急性應激對Bcl-2/bax的調節作用，表明在急性應激情況下細胞Bcl-2/Bax平衡發生改變，啟動腦損傷作用。但本實驗為短期急性實驗，因此缺少神經細胞形態、損傷和凋亡的觀察，仍有待進一步深入研究。

應激同時會觸發炎癥反應，大量文獻表明應激會使大腦皮質中的炎癥因子表達發生改變。其中有研究表明炎癥因子TNF-α和IL-6的增加使應激所致的病理生理改變的重要因素。本實驗同時研究的大鼠皮質的炎癥因子TNF-α和IL-6的改變，實驗發現急性應激會使這兩種炎性因子表達上升，這也佐證了炎癥因子在應激反應中的重要性［4]。

參麥注射液有效成分為麥冬皂苷、人參皂苷、麥冬黃酮、麥冬多糖和人參多糖等。人參大補元氣，麥冬養陰，五臟六腑皆賴其充養［13]?，F代快步伐的生活狀態，導致心悸氣短，神疲頭暈，失眠多夢等氣陰兩虛的狀態，而參麥就有益氣養陰的作用［14]。參附注射液是以溫陽救逆為主，以及丹紅注重于活血化瘀，均與本病不符，故而采用參麥注射液［14]。實驗研究同時顯示，參麥注射液可發揮多種多樣的生物學功能，特別是在神經保護方面，能有效減輕腦水腫、調節興奮性氨基酸遞質的釋放、抑制細胞凋亡、清除自由基［13，15]。 有實驗研究發現給予腹腔注射參麥注射液15 mg/kg可以起到積極有效的腦保護作用［3，8]。本實驗給予參麥注射液15 mg/kg預處理后再行急性束縛性應激，發現大鼠大腦皮質組織Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6的表達基本保持平衡，與正常對照組大鼠相一致；而未予以急性束縛性應激的大鼠，在單純給予參麥注射液后大腦皮質Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6表達也基本與正常對照組保持一致，這就排除了參麥注射液本身對Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6表達影響的干擾，同時表明正常機體狀態下給予參麥注射液對Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6無影響。

參考大量關于急性束縛性應激的實驗研究，目前沒有明確有效的藥物對這類急性應激有效。因此本實驗沒有設立陽性藥物對照組，這使實驗存在略微不足，但對最終的結果影響不大。后續研究會進一步多角度地研究參麥注射液在急性應激的作用。

綜上所述，急性束縛性應激可使大鼠大腦皮質Bcl-2mRNA表達明顯下降，BaxmRNA和蛋白表達明顯增高，炎癥因子TNF-α和IL-6表達的增加，從而產生腦損害作用。參麥注射液預處理可通過維持大腦皮質Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6的平衡來實現對急性束縛性應激大鼠的腦保護效應，這為臨床上預防性使用參麥注射液提供了理論基礎和科學依據。

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