跨損傷合成途徑中真核生物DNA聚合酶δ轉換機制的研究進展

陳 煒，周亞竟

(江蘇大學 生命科學研究院，鎮江 212013)

每天細胞內僅因內源因素(如活性氧自由基、代謝產物等)就會引起高達數以萬計的DNA損傷，每個損傷均可導致復制叉進程受阻，這些阻礙可以通過各種損傷修復途徑得以克服，或通過損傷耐受機制激活跨損傷合成(Translesion synthesis, TLS)聚合酶，在損傷DNA加成物(adduct)對稱新鏈的相應位置加上核苷酸，或通過模板交換而旁路繞過這些損傷。相較于RNA、蛋白質、代謝物等，DNA位于信息傳遞的頂層，是細胞內唯一無法被取代的大分子，因此，損傷的DNA完全依賴于修復。如果這些損傷未能被及時修復或被不正確的修復，將引起基因突變、錯誤插入、刪除、或者染色體紊亂，最終導致人類多種疾病的發生。因此，準確的DNA復制和及時的損傷修復在真核生物維持其染色體穩定、防止遺傳變異和人類多種疾病，特別是癌癥的發生等方面起著極其重要的作用。

1 DNA聚合酶Pol δ與染色體DNA復制和損傷修復

生命的本質在于遺傳信息從上代到下代的正常傳遞，生物體在進化過程中發展出一套精確機制以保證“忠實”的DNA復制。真核生物染色體DNA復制主要由3種B-家族復制性聚合酶(Replicative polymerases)來完成，即：聚合酶α、δ和ε(Pol α、Pol δ和 Pol ε)，當雙螺旋親代DNA分子解鏈后，Pol α/primase分別在復制叉的前導鏈和滯后鏈上合成一小段低保真度的RNA/DNA引物而啟動DNA的合成，復制叉上的分工實驗表明，在前導鏈(Leading strand)上主要是由Pol ε來主導子代DNA的合成，而在滯后鏈(Lagging strand)上則是由Pol δ來完成[1]。但也有觀點認為，Pol δ可能均參與了兩條鏈上子代DNA的合成過程[2]，但是，目前還不清楚體內(in vivo)這兩種復制聚合酶在復制叉上的具體分工和明確的復制機制。

Pol δ作為一個同時擁有5′-3′聚合酶催化活性和3′-5′核酸外切酶活性(框架閱讀校對功能，prof-reading)的高保真聚合酶，除了通過它的高度復制保真特性在染色體結構穩定和避免遺傳變異方面扮演關鍵角色外，幾乎所有的DNA修復過程均涉及Pol δ的參與，如：Pol δ通過鏈上置換(Strand displacement)機制協同Fen-1在錯配修復途徑(Mismatch repair)中起重要作用，此過程需要p68亞基的參與[3]。在跨損傷修復途徑中，Pol δ和特定的TLS聚合酶通過一種聚合酶轉換機制(Polymerases switching mechanism)來完成跨損傷合成。一般觀點認為，X-家族聚合酶Pol β是負責堿基切除修復(Base excision repair, BER)最主要的修復聚合酶，但本實驗室和其他同行的研究表明，Pol δ在BER途徑中扮演著關鍵角色[4-5]。大量研究也表明，Pol δ通過DNA的重新合成和缺口填補在核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair, NER)以及雙鏈斷裂修復的同源重組(Homologous recombination, HR)途徑中也起著重要作用[6]。

2 真核生物DNA聚合酶Pol δ 的結構與功能

通過對人源、酵母(S.pombe和S.cerevisiae)Pol δ在遺傳學和生物化學等領域的大量研究，目前對真核生物Pol δ的結構和功能已有了較充分的了解。類似于S.pombe的Pol δ(各亞基分別為：Pol3、Cdc1、Cdc27、Cdm1)，人源Pol δ也是由4個亞基組成的異源四聚體(各亞基分別為：p125、p50、p68、p12)，而在釀酒酵母S.cerevisiae中尚未發現對應的第4亞基，由前3種亞基(Pol3p、Pol31p、Pol32p)構成異源三聚體。根據2001年發表的真核生物Pol δ亞基統一命名法，真核生物Pol δ的催化亞基被命名為A-亞基，其它3個輔助亞基分別為B-、C-、D-亞基[7]。

圖1 酵母S.cerevisiae Pol3p-DNA-dCTP三元復合物晶體結構卡通示意圖[8]Fig 1 Crystal structure of the Pol3p-DNA-dCTP ternary complex of S.cerevisiae

酵母S.cerevisiaeA-亞基催化核心域的“手掌”“手指”“拇指”、核酸外切酶、N-端域分別以青、黃、橙、洋紅、深藍顏色表示，DNA以灰色表示；模板上G和即將加入的dCTP以紅色表示，鈣離子以綠色表示，催化(Pol)和核酸外切(Exo)活性中心如箭頭所指

目前還沒有人源A-亞基p125晶體三維結構分析信息的報道，但通過對S.cerevisiaePol δ的A-亞基(Pol3p)催化核心域(catalytic core)與模板/引物及嵌入dCTP核苷酸所形成的三元復制復合物晶體進行的三維結構分析如圖1所示[8]，其催化核心域具有如所有已知的DNA聚合酶所特有的右手型構象，在C-端域(C-terminal domain, CTD)的非結構化“拴繩”(an unstructured tether)末端含有一個富含半胱氨酸域和一個亞域，這個亞域對與B-亞基的互作反應至關重要[9]，也就是說，B-亞基與A-亞基CTD的亞域發生捆綁反應；而富含半胱氨酸域構成兩個鋅指基序ZnF1和ZnF2，其ZnF1對A-亞基與增殖細胞核抗原PCNA的捆綁及介導Pol δ的持續合成至關重要。

由人源B-亞基p50與C-亞基p68 N-末端殘基形成的復合物晶體三維結構分析顯示[10]，p50亞基顯示有較大的、約12 868 ?2磷酸二酯酶狀(Phosphodiesterase-like, PDE)的表面結構域，且含有許多突出部和柔性回路，這使得p50亞基特別適合作為對接平臺連接其它亞基和眾多調控蛋白；又由于構成p50亞基PDE結構域的雙β-折疊(β-sheet)之一通過平行的β-股(β-strands)與p68的β-折疊相連，形成擴展了的β-折疊，因此，p68 N-端可以看作是p50亞基的延伸。B-亞基p50作為一個理想的“腳手架”(Scaffold)，除了鏈接其它3個亞基外，還可以通過延伸的C-亞基介導Pol δ在復制調控、跨損傷修復、中斷復制(Break-induced replication, BIR)等過程中的功能[11]。

對人源p12亞基而言，它同時與p125的CTD域和p50亞基捆綁而形成穩定的三角結構，p12起到穩定Pol δ空間結構的功能[12]。因此，真核生物Pol δ復合體的結構被確定為：A-、B-、D-亞基相互“捆綁”形成穩定的三角結構，而C-亞基只能和B-亞基發生“捆綁”反應，形成B-亞基的延伸。

Pol δ作為染色體DNA復制功能的研究總是和PCNA相關聯，此時，3個PCNA分子形成三聚體的環狀滑行夾協同Pol δ的復制功能，同時，PCNA作為對接平臺功能，通過募集-離散相關蛋白(復合體)，在各種DNA的損傷修復過程也發揮著至關重要的作用。所有的Pol δ 4個亞基均被報道含PCNA捆綁反應域與PCNA發生捆綁反應，其中以p68與PCNA反應最強，而p50與PCNA的反應最弱[13]。在我們曾經提出過的(如圖2)Pol δ-PCNA復制復合體分子反應模型中，p125、p68和p12 3個亞基分別與三聚體PCNA中一個分子起反應，當缺失了p12亞基時，p50亞基有可能成為與PCNA反應的備選分子。但由于p50與PCNA的親和能力太過微弱以及Pol δ復合體空間結構的改變，p50亞基也可能無法與PCNA反應，使得三聚體中空出一個PCNA分子。在某些場合，如DNA的損傷應答，空出的這個PCNA分子是否可能作為對接平臺的功能，通過募集其它修復蛋白，如Y-家族聚合酶等，參與到DNA的損傷修復過程等，均有待進一步深入研究。

圖2 人源Pol δ-PCNA復制復合物的蛋白-蛋白互作反應模型Fig 2 A model of the network of protein-protein interactions for human Pol δ-PCNA complexes

A：由四亞基與PCNA構成的復制復合物Pol δ4-PCNA。Pol δ內部各亞基之間以及PCNA三聚體之間的反應以實線表示，而各亞基與PCNA之間的反應以三實線表示。B：由缺失了p12亞基的三亞基與PCNA構成的復制復合物Pol δ3-PCNA。p50可能提供一個與PCNA反應的備選分子，但也可能由于親和能力太過微弱而無法與PCNA發生互作反應，使得三聚體中空出一個PCNA分子以備他用。本圖源自文獻[13]并作相應修改

3 跨損傷修復途徑中Pol δ 與TLS聚合酶轉換機制的激活

盡管復制性DNA聚合酶Pol δ具有緊湊縝密的催化活性中心和3′-5′核酸外切酶活性的框架閱讀功能以保證DNA復制的高度持續合成能力和高保真性，DNA還是易受到各種內源或外源因素導致的損傷，據估計每天僅因內源因素就會產生數以萬計的損傷[14]。為維護染色體DNA結構的完整性和遺傳穩定性，細胞被賦予一整套如前面所提及的各種復雜的修復途徑，以便在復制啟動前消除這些損傷，但是，還是有相當數量的損傷會逃逸這些精確設計的修復途徑而存在于基因組中，使得細胞S-期復制叉進程“熄火”、染色體異常甚至細胞死亡，因此，細胞進化出一種“旁路通過”(by-pass)受損DNA的損傷耐受機制(或稱為復制后修復機制，DNA damage tolerance, DDT)來恢復DNA的正常復制，避免這些逃逸了的損傷所致的影響。一種損傷耐受機制涉及模板交換的無錯(error-free)途徑，即：利用無損的姐妹鏈，而不是損傷鏈作模板繼續DNA的復制[15]；另一種被廣泛深入研究的是有錯的(error-prone)TLS修復途徑，TLS聚合酶在模板的損傷點對面加入核苷酸以延伸引物，但不修復這些損傷，即所謂的“旁路通過”，這雖然增加了復制錯誤的頻率，卻能夠使S-和G2-期的復制叉進程得以恢復[16]。

哺乳動物介導跨損傷合成的主要聚合酶包括Y-家族的4個成員(REV1、Pol η、Pol ι 和Pol κ)以及B-家族成員之一的Pol ζ，有別于復制聚合酶，這些TLS聚合酶的催化活性中心比較松弛，能夠容納畸變了的損傷堿基，且持續合成能力低，不含3′-5′核酸外切酶活性的框架閱讀能力[17]。當復制進程遇到損傷點(域)時，復制暫停，TLS聚合酶被募集并取代復制體(replisome)中Pol δ，在完成跨損傷合成后離開，Pol δ重新被募集回到引物末端繼續新的合成，這就是有錯TLS修復途徑的一個關鍵步驟——聚合酶轉換機制，但對在損傷點(域)聚合酶如何進行轉換的機制存在爭議。有觀點認為，在Pol δ和Pol ζ介導的跨損傷修復中是通過催化亞基共享輔助亞基在損傷點(域)進行了轉換[18]，但這種模型無法解釋其它TLS聚合酶在損傷點(域)與Pol δ是如何進行交換的。

通過對PCNA泛素化修飾及修飾后調控真核細胞應對DNA損傷的深入研究，另外的觀點認為，是PCNA的泛素化-去泛素化修飾介導了TLS修復途徑的聚合酶轉換。酵母中，PCNA在K164殘基位點被Rad6/Rad18綴合酶-連接酶(E2/E3)泛素反應調控系統單泛素化修飾(這里，以PCNA-Ub1表示被單泛素化修飾了的PCNA)，在Pol η 和Pol ζ介導的跨損傷修復途徑中扮演重要角色[19]，PCNA-Ub1特異性地與Pol η發生親和結合，但未經修飾的PCNA則不能[20]，PCNA-Ub1能夠特異性激活Pol η和REV1，促進跨損傷合成[21]。所有的TLS聚合酶C-末端存在高度進化保守的泛素結合域UBM(Ubiquitin-binding motif)或泛素結合鋅指UBZ(Ubiquitin-binding zinc finger)，TLS聚合酶通過UBM和UBZ與單泛素化了的PCNA-Ub1親和結合被募集到損傷區的復制點，在沒有DNA損傷情況下，PCNA的單泛素化修飾被去泛素化酶USP1所抑制，復制性聚合酶Pol δ和TLS聚合酶之間的轉換被阻止，一旦發生DNA損傷，TLS途徑被激活，PCNA的單泛素化修飾調控TLS聚合酶在損傷點(域)的募集[22]。

4 跨損傷修復途徑中可能存在未知的聚合酶轉換激活機制

盡管“Pol δ-TLS聚合酶之間進行轉換是跨損傷修復途徑的核心”已成目前為被廣泛接受的觀點，但對“PCNA單泛素化-去泛素化修飾介導了聚合酶的交換”存在爭議。相反的研究表明，組成分子環狀滑行夾的3個PCNA分子能夠同時被單泛素化修飾，值得注意的是，單泛素化了的PCNA-Ub1并不影響復制聚合酶Pol δ的活性，也未破壞Pol δ-PCNA的捆綁結構，對TLS聚合酶Pol η的活性無增強作用；無論是未經修飾的PCNA還是泛素化了的PCNA-Ub1，它們對TLS聚合酶Pol ζ 和REV1的活性均并無任何刺激作用，因此，這些研究指出，在損傷點(域)，Pol δ并不是通過PCNA被TLS聚合酶取代，PCNA的單泛素化修飾并不是構成聚合酶轉換的核心，而可能是通過其它的某些未知功能而影響著TLS進程，推測可能是某個Pol δ相關的未知因子介導了TLS聚合酶在損傷點的募集[22-24]。

人源和酵母PCNA-Ub1晶體三維結構的X-衍射分析均顯示PCNA和泛素的結構與它們結合前的游離形式幾乎沒有太大區別。人源PCNA結構卡通模型如圖3所示，被Rad6/Rad18介導單泛素修飾的賴氨酸殘基K164位于PCNA環狀滑行夾的背面，而DNA合成則是在滑行夾的正面發生，即沿著引物的5′→3′前進方向進行。

所有的真核Y-家族聚合酶均含有非規范的(non-canonical)PIP盒(REV1除外，它通過自身BRCT域與PCNA發生反應)，TLS聚合酶通過它們的PIP盒與PCNA發生親和反應。TLS聚合酶PIP盒肽段與PCNA捆綁的晶體結構分析表明，Pol η的PIP盒與PCNA的親和能力要比其UBZ域與PCNA-Ub1上泛素分子的親和能力要強得多[22,26]。因此，在遇到損傷時，TLS聚合酶不太可能通過親和能力較弱的UBM或UBZ域與環狀滑行夾背面的泛素發生親和而被募集到PCNA環狀滑行夾正面朝向的損傷點(域)與Pol δ發生交換。這也從另一個側面證明了由PCNA的泛素化修飾激活聚合酶轉換機制的可能性較低。

圖3 人源PCNA三維結構的卡通模型Fig 3 Crystal structure of human PCNA

A：單分子PCNA由N-端(灰色)和C-端(綠色)的兩個獨立域組成，兩個獨立域之間通過域間連接環(interdomain connecting loop，IDCL)相連(洋紅)，164位的賴氨酸殘基(K164)以紅色球狀表示。B和C：分別表示三聚體PCNA的正視圖和側視圖，3個PCNA單分子頭尾相連，構成顯著不同的兩個面，由C-端凸出部構成的一面被稱為正面(Front side)，或稱C-端面(C-terminal face)。側視圖顯示這兩個面的顯著不同，右向的正面(C-端面)含IDCL，在正常DNA合成過程負責與復制性聚合酶的反應，而發生單泛素化修飾的K164位于左向的背面。本圖源自文獻[25]并作相應修改

5 展望

前期的研究表明，在人源細胞幾乎所有的、由各種因子誘導產生的DNA損傷中，Pol δ均以缺失了p12亞基的三聚體形式Pol δ3以應對，且鑒定出兩種能夠介導p12經多聚泛素化-蛋白酶體途徑降解的E3連接酶RNF8和CRL4Cdt2[27-29]。我們的最新研究還發現，RNF8還能夠介導Pol δ的p50亞基被單泛素化修飾(未發表的數據)。然而，細胞內的p50亞基通過什么E2/E3泛素化修飾調控系統被單泛素化修飾？修飾后的p50在缺失了p12亞基的Pol δ三聚體中扮演什么角色？與TLS聚合酶的互作關系？在跨損傷合成途徑中如何調控Pol δ與TLS聚合酶之間的轉換？這些問題將成為我們今后需要進行研究的重點。

癌癥是一種由遺傳和表觀遺傳改變、以細胞異常增殖及轉移為特點的一大類疾病，DNA修復功能缺陷是許多自發性腫瘤和遺傳性癌癥的主要特征之一；與早(衰)老癥相對應的轉基因鼠模型研究還表明，未修復的DNA損傷積累也與早(衰)老癥及老年性疾病密切相關，最終闡明跨損傷合成途徑聚合酶Pol δ與TLS聚合酶交換機制，將為今后以Pol δ作為一種小分子抑制劑潛在的新靶標、設計新的腫瘤診斷方法和治療手段來抗擊癌癥、防治衰老等相關疾病提供理論依據。

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