腦膠質瘤可變剪接調控機制研究進展

呂俊杰, 王科俊, 熊新炎, 袁翠玲, 湯秀麗, 任付賓

(1.哈爾濱醫科大學 生物信息科學與技術學院, 哈爾濱 150081;2.哈爾濱工程大學 自動化學院, 哈爾濱 150080)

可變剪接(alternative splicing, AS)現象廣泛存在于真核生物基因中，調控眾多關鍵的基因后轉錄過程。由于可變剪接與多種人類重大疾病，尤其是癌癥，有著很大的相關性，越來越受到廣大科研工作者的關注，對可變剪接調控機制的研究層面也越來越廣泛。最初研究數據來源于表達序列標簽(expressed sequence tag, EST)，由于受測序深度不夠的限制，對可變剪接的研究只能停留在單個基因層面上[1]；后來隨著cDNA 微陣列(cDNA microarray)技術的出現，人們估計大約有 60%的人類基因可能包含至少一個能夠發生可變剪接的可變外顯子(alternative exon)，但是由于對微量mRNA亞型的敏感性設計不足等限制，仍然缺乏在全基因組范圍內對可變剪接的認識[2]。近年來，隨著二代測序技術的出現和生物信息學技術的不斷發展，不但使得在全基因組內對可變剪接事件的研究成為可能，而且通過各組學數據之間的相互整合，對可變剪接的研究更為全面，更為系統，最新的研究發現人類基因約95%的外顯子都能夠產生可變剪接[3]?？勺兗艚诱{控機制的異?？赡軙е掳┌Y[4]。腦膠質瘤是腦惡性腫瘤之一，致死率非常高，術后存活率低。已有的研究表明，多種與膠質瘤相關的基因、酶、離子通道等均受可變剪接的調控。本文綜述近年來腦膠質瘤可變剪接調控機制研究的進展，并對剪接層面的臨床治療進行了展望。

1 pre-mRNA可變剪接調控機制

可變剪接又稱選擇性剪接，是調節真核生物pre-mRNA為成熟mRNA的關鍵過程。 可變剪接調控機制復雜，剪接形式多樣，目前，經典的分類方法將可變剪接形式分為7種類型，如圖1所示。其中，外顯子跳過是哺乳動物中最常見的類型，約占人類可變剪接事件的38.4%，在這種模式中，外顯子與成熟的mRNA一起從側翼的內含子中切除；可變5′/ 3′剪接位點也是比較常見的類型，分別約占可變剪接事件的7.9%和18.4%； 內含子保留類型，顧名思義是指內含子保留在所得的成熟mRNA中，約占可變剪接事件的2.8%。 其他類型的可變剪接包括互斥外顯子，可變初始外顯子，可變終末外顯子，這些剪接模式約占可變剪接事件的32.5%[5]。

調節可變剪接機制的基本元素有順式作用元件和反式作用因子。順式作用元件是指剪接一致序列和一些輔助元件，它們共同決定剪接的最終結果[6]；反式作用因子由一群富含絲氨酸/富含精氨酸(SR)蛋白，以及一些核糖核蛋白(hnRNP)和小核糖核蛋白(snRNP)構成[7-10]。順式作用元件和反式作用因子相互作用，共同精確調節可變剪接的過程。關于各剪接調控元件及其作用機制的詳細介紹可以參考Black的綜述文章——Mechanisms of alternative pre-messenger RNA splicing[11]。

圖1可變剪接主要類型[11]Fig 1 Main patterns of alternative splicing[11]

2 腦膠質瘤中的可變剪接調控機制

2.1 癌癥與可變剪接

在正常組織分化期間，可變剪接調控精密，錯誤的可變剪接可能導致產生異常的蛋白質亞型，從而導致疾病甚至癌癥?；蚪M范圍內研究表明[12]:超過15 000種腫瘤相關的剪接變體廣泛存在于癌癥中。計算分析腫瘤相關的剪接變體揭示出可變剪接參與癌細胞生物學的幾乎每個方面，包括增殖、分化、細胞周期控制、代謝、凋亡、運動、侵入和血管生成。在所選擇的剪接變體的功能篩選中，發現乳腺癌和/或卵巢癌特異性10%(41個測試中的4個)可變剪接事件有助于癌細胞存活[13]。 盡管癌癥特異性可變剪接事件的功能意義還沒有被完全探索清楚，但是已有大量研究證實：異?？勺兗艚雍桶┌Y之間有著密切的聯系。

異常的可變剪接事件經常反映出剪接調控機制的異常，前體mRNA剪接一般由初級轉錄物中的順式作用剪接序列(順式作用元件)和結合這些RNA序列的反式剪接因子來調控[14]。蛋白質水平的改變和剪接調節因子活性的改變，順式作用元件中的點突變以及剪接調控機制本身的核心組分中的突變，都可導致異?？勺兗艚拥陌l生，從而導致癌癥以及許多癌癥表型[15]。研究腫瘤中的pre-mRNA 可變剪接調控機制對腫瘤的臨床診斷及治療都非常重要。

2.2 腦膠質瘤的可變剪接調控機制的復雜性

人類腦膠質瘤是最常見的顱內類型惡性腫瘤，發病率占所有原發性腦腫瘤的60%以上，根據世界健康組織對神經系統腫瘤的分類，腦膠質瘤被分為6類[16]：彌漫性星形細胞瘤(II級)、少突膠質細胞瘤(OD，II級)、間變性星形細胞瘤(III級)、間變性少突膠質細胞瘤(III級)、間變性少突星形細胞瘤(III級)和膠質母細胞瘤(GBM，IV級)，其中，GBM是最常見，最有侵襲性的原發性腦腫瘤，占惡性星形細胞瘤的80%。膠質母細胞瘤可原發于腦實質內，亦可呈繼發性。繼發性膠質母細胞瘤多數由間變性星形細胞瘤進一步惡變而來，少部分可由混合性膠質瘤、少突膠質瘤或室管膜瘤演變而成。雖然GBM被認為主要是星形膠質細胞的神經膠質瘤，但是也有少部分GBM表現出OD樣腫瘤細胞分化。OD是在成人中觀察到的高分化，生長緩慢，呈彌漫性浸潤的腫瘤，并且通常位于腦半球中。盡管近年來神經外科，化療和放射治療技術方面取得了快速的進展，但是膠質瘤通常預后效果不好。 因此，明確膠質瘤發生發展的基因通路十分必要。

已有研究表明：腫瘤特異性可變剪接在癌癥的發生發展過程中對基因表達和相關的蛋白質功能起著重要的調控作用，已經發現多種具有腫瘤特異性，同一腫瘤不同級別特異性的異?？勺兗艚愚D錄體，這些轉錄物已被作為疾病進程的標志物。多項研究表明[17-20]：腦膠質瘤的發生和/或發展受異常剪接亞型的影響，例如：表皮生長因子受體，磷酸酶和張力蛋白同源物，腫瘤蛋白p53(TP53)，增殖相關的Ki-67抗原，鼠mutS同源物，血小板衍生生長因子α等這些剪接亞型的異常都和腦膠質瘤有關?？勺兗艚拥漠惓：湍[瘤發生之間的關系已經作為癌癥生物學的研究新方向。膠質瘤中可變剪接基因的識別可以為膠質瘤的診斷和治療提供新的分子標志物。然而，可能導致膠質瘤的發生和發展的可變剪接相關的分子機制仍然不是十分清楚。所以，研究腦膠質瘤的pre-mRNA 可變剪接調控機制對于臨床治療有著劃時代的意義。

腦膠質瘤中發生可變剪接的基因數量很多，其調控機制受多種因素的影響，所以，想要基于單一數據對不同類型的膠質瘤發生過程，甚至從同一種腫瘤的原發瘤和繼發瘤發生過程中分析研究腦膠質瘤可變剪接，得出的結果中必然存在很大的假陽性。要想對腦膠質瘤的可變剪接調控機制進行深入細致的研究，需要整合多組學數據，系統地將可變剪接調控過程分析與定量分析結合起來，篩選出腫瘤形成中可變剪接的變化。隨著多組學數據的產生以及生物信息技術的不斷發展，我們對各類型膠質瘤的發生以及轉移的分子機制將得到深層次的了解，為膠質瘤的診斷治療提供更好的依據。

3 腦膠質瘤可變剪接調控機制的研究策略

3.1 組學時代的可變剪接調控機制

目前，對于可變剪接調控機制的研究，已不局限于單個基因、單個細胞和單個器官的分析研究。隨著實驗與計算生物技術的發展，尤其是高通量測序技術的發展，對可變剪接的研究已進入組學時代。對可變剪接與基因組、轉錄組、蛋白質組等組學的相互整合分析，可多方位系統研究可變剪接調控機制[21]?？勺兗艚涌墒筽re-mRNA產生不同的轉錄體，這些轉錄體經過翻譯成為結構、功能各不相同的蛋白亞型(isoform)。蛋白質是機體功能的最終執行者[22]，這樣可變剪接現象極大地擴增了生物體內的蛋白質數量，同時也產生了很多原來蛋白質不具備的功能，這些功能涉及細胞增殖與凋亡、免疫調節、急性炎癥響應、轉錄調節、細胞再生及分化、膽固醇運輸等，這迫使人們不得不以更加深入的眼光看待可變剪接這一過程，今后對于蛋白功能的研究必須從基因層面向亞型層面進行深化。

3.2 多組學數據整合分析腦膠質瘤可變剪接調控機制

以往的蛋白質組質譜技術對于同一種蛋白的不同亞型間的細小差別不能很好地區分，隨著組學時代的到來，以及測序技術的不斷發展，尤其是二代測序技術的出現，使得大量針對蛋白亞型特異性研究成為可能[23]。但是面對如此海量的信息，單分子或多分子研究顯然不能滿足研究的需要。為了在亞型層面上對蛋白質的功能進行深入、系統、全面和大規模地研究，需要對多組學數據進行整合分析來建立大規模、高通量的蛋白質亞型功能的研究方法。隨著深度測序技術的發展，整合 RNA-Seq 數據與金標準數據集的研究方法由于具有較高的準確性和易行性而逐漸成為一種新興的研究手段，特別是海量 RNA-Seq 數據的不斷產出，為其提供了豐富的數據資源。未來多組學數據整合分析將成為分析研究方法的主流。

疾病的發生與發展往往涉及多個層面的因素，包括基因表達、后轉錄調控、表觀遺傳學、蛋白質以及各種代謝網絡等不同層面的病理生理過程[24]。一個層面數據的改變很難解釋疾病的整個發生過程，通過多組學數據的整合分析，可以有效去除單個層面的隨機事件，將有助于人們對疾病形成更加系統全面的認識。不再局限于 RNA-Seq 數據，外顯子芯片、Chip-Seq數據，轉錄后調節、單核苷酸突變、蛋白的翻譯后修飾等大規模組學數據均可通過它們之間線性或非線性關系進行相互整合，這將大大提高分析的精確性與準確性，最終建成經濟、穩健的分析模型。在分子層面上解釋疾病的發生發展過程，同時也在亞型的水平上，對蛋白質-RNA互作網絡，蛋白質-DNA互作網絡以及蛋白質互作網絡等進行全面的分析研究，并且對如長非編碼 RNA(long non-coding RNA，lncRNA)領域的研究也有重要的借鑒意義。

目前，在多組學數據整合分析研究重大疾病，尤其是癌癥已經取得初步進展。Fang等通過整合ChIP-seq技術，微陣列表達數據以及microRNA 數據對膠質母細胞瘤中的重要調控元件SOX2的反應機制進行了分析研究，取得了很好的效果[24]；Kmin-seok等整合mRNA數據與microRNA 數據，建立支持向量機模型(SVM)識別出診斷胰腺癌的多種生物標記(biomarkers)[25]；Ping等通過整合多維基因組數據，包括DNA突變、拷貝數、甲基化、基因表達和miRNA表達譜，以及調節網絡和蛋白質相互作用網絡，確定基于多因素介導的失調網絡的驅動模塊及其失調基因，識別出膠質母細胞瘤中17種基因及其失調基因的核酸模塊[26]。Agyeman 等將轉錄組數據與蛋白組數據進行整合，分析乳腺癌的潛在化學預防劑萊菔硫烷(SFN)的作用機理[27]；Szklarczyk等研究發現糖酵解過程和代謝組、蛋白組和基因組都相關[28]。這些研究都表明了疾病的發生發展過程涉及眾多的細胞調控過程，是一個系統的、多方面因素相互影響協調的復雜過程。腦膠質瘤的生物學發生十分復雜，存在pre-mRNA 可變剪接的基因較多[29]，單組學數據很難分析其可變剪接調控過程，通過基因組、轉錄組和表觀組等多個層面的數據之間線性或非線性關系等將它們聯系到一起，進行多組學數據的整合分析，這將是未來對腦膠質瘤可變剪接調控機制研究的新方向。

4 展望

最后，由于數據來源的多樣性，可將來源于不同年齡、不同類型的膠質瘤，或不同病理分型的膠質瘤數據進行整合分析，研究基因亞型水平的表達模式，進而探求在特定狀態下基因亞型的表達差異及其所可能具有的功能及意義[30]。利用多組學數據整合分析研究，可以找出導致膠質瘤的異?？勺兗艚影l生的生理病理過程，例如，細胞凋亡相關基因、細胞周期調控蛋白、腫瘤抑制基因、各種酶、離子通道、細胞表面受體等[31]。所幸的是，這些關鍵基因所發生的可變剪接除了作為膠質瘤的誘發因素外，同時能夠作為臨床上的診斷或治療靶點，為膠質瘤在可變剪接層面的治療提供新的思路。

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