基于線粒體控制區的中國近海 綠鰭魚遺傳多樣性分析

盧麗鋒， 章 群， 楊喜書， 黃鎮宇， 唐楚林， 周 琪

(暨南大學生態系，廣州 510632)

綠鰭魚(Chelidonichthyskumu)隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)魴鮄科(Triglidae)綠鰭魚屬，俗稱綠翅魚、角魚、國公魚等，小眼綠鰭魚(Chelidonichthysspinosus)為其同種異名[1]。綠鰭魚是廣泛分布于印度洋-西太平洋河口至大陸架邊緣泥沙質海區的暖水性中小型底層魚類，能以胸鰭游離鰭條在海底匍匐爬行，春夏之交游近沿岸河口海灣產漂浮性卵，秋末冬初游向外海越冬[1]。綠鰭魚的背脊具有一定毒性，主要攝食蝦類、軟體動物和小魚，同時也是其它經濟魚類的餌料，在沿海生態系統中具有重要作用[2]。綠鰭魚在日本、韓國與中國近海均有分布，其肉質鮮美，蛋白質和脂肪含量高，有較高的營養價值和食用價值，適合養殖開發，是中國、日本、東南亞等地的經濟魚類之一。近年來，隨著大黃魚(Pseudosciaenacrocea)[3]、真鯛(Pagrusmajor)和黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)[4]等大中型經濟魚類資源衰退，綠鰭魚已成為中國沿海流刺網和底層拖網漁業的主要捕撈種類之一，也是游釣漁業重要的對象[5]。海州灣魚類資源調查[6]表明綠鰭魚是海州灣底棲生物食性類群中秋季優勢度最高的魚種，占秋季總生物量的28.61%；但長江口綠鰭魚資源有明顯波動[7]。

目前，國內外對綠鰭魚的研究局限于生理習性、種群數量及生長環境等方面[6]，研究表明[8]，在東亞，綠鰭魚有秋冬從渤海、黃海北部南下至濟州島西部海域越冬的黃渤海群，冬季在舟山外海越冬、翌年春夏至長江口北部后分散活動的東海群，以及周年棲息于九州近海、對馬南部和五島西南部魚群，但并未述及南海綠鰭魚種群，且迄今未見研究這些群體間是否存在遺傳差異的報道。動物線粒體DNA為母系遺傳，結構簡單無重組，進化速率快，是動物種群遺傳學研究的首選分子標記[9]；其中控制區的遺傳變異速率為3%～10%/百萬年[10]，是線粒體基因組中進化速率最快的區段，常用于研究動物遺傳多樣性和種群結構。本研究測定并分析了遼寧金石灘、遼寧東港、山東青島、江蘇呂四、浙江舟山、廣東南澳等中國沿海5省6個地理群體的線粒體控制區序列，旨在更全面的了解中國近海綠鰭魚的遺傳背景，為種質資源的管理保護和合理利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與方法

實驗所用野生綠鰭魚樣品由近海作業的漁民處直接購買所得，分別采集于：黃海遼寧丹東東港(LDG1～13)、遼寧大連金石灘(LJST1～18)、山東青島(LQD1～27)、江蘇呂四港(SLS1～12)；東海浙江舟山(ZZS1～28)和南海廣東南澳(YNA1～14)，采樣點見圖1。提取樣品肌肉保存于95%乙醇備用。PCR擴增引物為本實驗室自行設計的CrL: 5′-TCGGTCTTGTAATCCGAA-3′與CrR: 5′-AGTCAGGACCAAGCCTTT-3′。DNA提取和PCR擴增參照樂小亮等[11]方法，將電泳檢測為條帶清晰明亮的PCR擴增產物送至華大基因有限公司切膠純化并測序。

1.2 數據處理

利用MEGA 6.0[13]對測定序列進行校對與對位排列，計算堿基組成、多態位點、簡約信息位點、轉換與顛換比以及基于Kimura-2-Parameter模型的遺傳距離，構建鄰接樹。通過DnaSP 5.1[14]計算單倍型數、單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣性(π)，以及遺傳分化系數(Fst)和基因流(Nm)值。利用Network 5.0[15]構建單倍型網絡圖。使用Arlequin 3.5[16]進行分子方差分析(AMOVA)，檢驗群體遺傳變異；進行Tajima’sD和Fu’sFs中性檢驗獲得SSD值、Raggedness值，通過核苷酸不配對分析檢驗種群歷史動態[17]，根據公式τ=2ut和T=t×(代時)，估算種群擴張時間，其中τ是時間擴張參數；u=μk，μ為序列變異速率，k為序列長度；t表示種群自然擴張以來的時間。

圖1 綠鰭魚采樣地點分布圖(根據孫海平等[12]修改)Fig.1 Sampling sites of Chelidonichthys kumu(Modified from SUN et al.[12])注：LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’aoNote:LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

2 結果與分析

2.1 綠鰭魚線粒體控制區序列特征、遺傳多樣性和遺傳分化

在6個群體112條綠鰭魚線粒體控制區838 bp全序列中，A、T、C、G的平均含量分別是30.5%、30.3%、21.2%、18.0%，A+T的含量(60.8%)明顯高于G+C的含量(39.2%)，表現出典型的反G偏倚，吻合脊椎動物線粒體DNA特征[18]。共檢測到15個變異位點，10個簡約信息位點；轉換與顛換比1.97，表明序列變異未飽和，可用于種群遺傳分析。在22個單倍型中，共享單倍型11個。綠鰭魚整體呈現高單倍型多樣性(h=0.849±0.019)與低核苷酸多樣性(π=0.001 85±0.000 12)特點，其中江蘇呂四群體(h=0.818±0.096，π=0.002 33±0.000 59)遺傳多樣性最高；浙江舟山群體(h=0.794±0.042，π=0.001 60±0.000 23)遺傳多樣性最低，詳見表1。

K-2-P模型構建的鄰接樹和單倍型網絡圖(圖2)均顯示，不同地理來源的個體混雜分布，沒有明顯的地理聚群。群體間和群體內的遺傳距離(表2)為0.001 6～0.002 3；群體間的遺傳分化系數Fst(表2)為-0.034 61～0.038 28(P>0.05)；按照6個地理群體間、樣品采集地所屬海域及臺灣海峽南北兩側(即東海-黃海群組與南海群組)分組進行AMOVA分析，發現群體內的變異比例達到99%(表3)以上，6個群體間(Fst=0.000 5，P=0.45)、不同海域間(Fct=-0.013 2，P=0.79)及臺灣海峽南北兩側(Fct=0.011 9，P=0.49)均不存在顯著的遺傳結構，表明遺傳變異主要存在群體內的個體之間，不同地理群體間和不同海區間都不存在遺傳分化。

2.2 綠鰭魚的種群歷史動態

中性檢驗結果見表4：除東港群體Tajima’sD值為正值(0.009 2)外，其它群體(-0.945 1～-0.613 6)與中國近海綠鰭魚總體(-1.234 3)的Tajima’sD值均為負值，但都不顯著(P>0.05)。除呂四群體Fu’sFs值為負值(-1.176 6)且不顯著(P=0.125)外，其它群體(-5.798 1～-1.391 5)與中國近海綠鰭魚總體(-16.099 6)都為負值且顯著(P<0.05)。核酸不配對分析的SSD值均較小且不存在顯著差異，表明并未顯著偏離種群擴張模型。由于Fu’sFs檢驗比Tajima’sD檢驗對群體近期擴張更敏感[19]，東港、金石灘、青島、舟山、南澳等5個群體及綠鰭魚整體Fu’sFs值(表4)為顯著負值；核苷酸不配對分析峰圖(圖3)為明顯單峰分布；表明上述5個群體和綠鰭魚整體近期歷史上經歷了明顯的快速擴張事件[20]，根據整體擴張參數τ值為1.68，以線粒體控制區的遺傳變異速率(3%～10%)/百萬年[10]，由此估算出整體種群擴張發生在3.00萬年～10.00萬年前的晚更新世時期。

圖2 線粒體CR基因序列單倍型網絡圖Fig.2 Haplotype network using mtDNA CR sequence data showing geographic distribution of haplotypes注：圖中每個圖圈代表一個單倍型且其面積大小與所包含的個體數量成正比; 枝上短線表示突變步驟Note：Circles are unique haplotypes proportional to frequencies,short lines represent mutation steps

海域Sea region群體Population數量Number變異位點數Variable sites單倍型數Nh單倍型多樣性h±SD核苷酸多樣性π±SD黃海Yellow Sea東港 LDG13570.846±0.0850.001 93±0.000 33金石灘 LJST18680.830±0.0640.001 60±0.000 26青島 LQD27890.826±0.0550.001 99±0.000 23呂四 SLS12760.818±0.0960.002 33±0.000 57小計Subtotal7013170.863±0.0230.001 94±0.000 16東海East China Sea舟山 ZZS28780.794±0.0420.001 60±0.000 23南海South China Sea南澳 YNA14790.912±0.0590.001 95±0.000 27中國沿海China Sea總計Total11215220.849±0.0190.001 85±0.000 12

注：LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

Note:LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

表2 綠鰭魚群體內(對角線)和群體間遺傳距離(對角線下)及群體間 Fst(對角線上)Tab.2 Genetic distances within (along diagonal)and among populations (below diagonal), and Fst among populations (above diagonal) of Chelidonichthys kumu populations

注：表中所有Fst值均無顯著性差異(P>0.05)。LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

Note: AllFstvalues in the table have no significant difference(P>0.05).LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

表3 中國近海綠鰭魚種群結構的分子方差分析Tab.3 AMOVA analysis based on mtDNA differentiation of Chelidonichthys kumu in the coastal waters of China

表4 中國近海綠鰭魚中性檢驗、不配對分布Tab.4 Neutrality tests and mismatch distribution of Chelidonichthys kumu

注：LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

Note:LDG:Donggang; LJST:Jinshitan; LQD:Qingdao; SLS:Lvsi; ZZS:Zhoushan; YAN:Nan’ao

圖3 綠鰭魚線粒體控制區序列核酸不配對分析圖Fig.3 Nucleotion mismatch distribution of Chelidonichthys kumu mtDNA control region sequences

3 討論

3.1 綠鰭魚的遺傳多樣性、種群結構和歷史動態

中國近海綠鰭魚整體的線粒體控制區單倍型多樣性(h=0.849)和核苷酸多樣性(π=0.001 85)，與西北太平洋同域分布的黑鯛(h=0.994，π=0.007 4) 、平鯛(Rhabdosargussarba) (h=0.999，π=0.007 3)[4]、花鱸(Lateolabraxmaculatus) (h=0.96，π=0.003)[21]等一樣具有高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性分布模式[22]。推測是線粒體序列在短時間內出現的少量核苷酸變異即可提高單倍型多樣性，但不能明顯增加核酸多樣性[23]。但綠鰭魚遺傳多樣性遠低于黑鯛、平鯛、花鱸等魚類[4,21]，表明中國近海綠鰭魚的遺傳多樣性相當低，推測可能經歷過嚴重的瓶頸效應，這個推論與曹艷[4]對中國近海黑鯛的研究結果相似。

綠鰭魚6個地理群體間的遺傳分化系數Fst值為-0.034 61～0.038 28(P>0.05)，遺傳距離為0.001 6～0.002 3，表明群體間不存在遺傳分化；AMOVA分子方差分析結果也顯示，不同地理群體間、不同海域群組間、臺灣海峽南北兩側群組內的遺傳變異比例達99%以上，這與呂金磊等[24]對中國南海卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)的研究結果相似，表明綠鰭魚遺傳分化主要在群體內的個體之間；在單倍型網絡圖中，不同地理來源個體相互混雜，不能形成明顯地理聚群，表明沒有明顯的地理結構，推測原因如下：綠鰭魚能進行大范圍的越冬洄游[1]；卵具有漂浮性，受向北的南海暖流和黑潮以及沿岸流的影響，可進行較遠距離的傳播，導致不同地理群體間頻繁的基因交流，不能形成明顯的地理結構。這個推論與SONG等[25]對西北太平洋斑尾復蝦虎(Synechogobiusommaturus)等研究結果相似。黃渤海群、東海群以及南海綠鰭魚群體之間幾乎沒有遺傳分化，這與大黃魚情況相似。依據大黃魚形態學和生態學特征的差別，中國沿海大黃魚由北至南分成岱衢族、閩-粵東族和硇洲族 3 個地理種群，但線粒體序列分析同樣未能檢測到明顯遺傳分化[3]。

中國近海綠鰭魚核苷酸不配對峰圖為單峰分布；除呂四群體之外，其它5個地理群體中性檢驗Fu’sFs為顯著至極顯著負值(表4)，均表明這些群體在近期歷史上出現過種群快速擴張事件，推算出中國近海綠鰭魚整體擴張時間發生在3.00萬年～10.00萬年前，即中國近海綠鰭魚可能在受晚更新世的倒數第二次盛冰期海平面下降導致大陸架出露而急劇減少了分布范圍導致的種群瓶頸后，在隨后的間冰期至末次盛冰期前的相對高海平面時期因分布范圍擴大而出現種群擴張。中國近海綠鰭魚在末次盛冰期間前發生種群擴張，這一推論與銀鯧(Pampusargenteus)等結果相似[26]，即更新世晚期冰期與間冰期循環導致的海平面升降變化是影響大部分中國近海魚類的種群快速擴張的關鍵因素。

3.2 綠鰭魚種群資源保護

中國近海綠鰭魚不同地理群體間與不同組群間幾乎不存在母系遺傳分化，故可作為一個管理保護單位。中國綠鰭魚相較其它同域分布的魚類遺傳多樣性明顯偏低，需要引起漁業管理部門重視。江蘇呂四群體遺傳多樣性高于其它群體，建議優先保護[27]；浙江舟山群體多樣性最低，應采取措施避免遺傳多樣性的下降造成種群適應性下降而衰退。

由于線粒體僅為母系遺傳，不能反映雙親的遺傳信息，以線粒體控制區為分子標記并不不一定能完整地反映綠鰭魚的遺傳分化，在將來的研究中，可在本研究的基礎上，運用微衛星和AFLP等分子標記技術從核基因遺傳多樣性角度進行研究，并結合其生理習性、生態環境以及形態特征進行更全面的分析，同時擴大綠鰭魚采樣群體的地理范圍，以更好地揭示中國近海綠鰭魚的遺傳結構，為其種質資源的保護、合理利用提供科學依據。

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