鹽度脅迫對大竹蟶成活率與抗氧化酶活性的影響

張 雨， 陳愛華， 曹 奕， 吳楊平， 姚國興， 王 超,2

(1.江蘇省海洋水產研究所，南通 226007；2.連云港市海洋與漁業發展促進中心，連云港 222044)

鹽度作為水環境的一個重要理化因子，與水生動物的生長發育、滲透調節、繁殖孵化、能量代謝、免疫防御等生理過程密切相關[1-3]。當生物受到鹽度的脅迫時，機體會產生一系列的生理應激反應[4]，進而引發具有氧化性的活性氧ROS的瞬間過量產生[5]。對機體自身產生包括破壞細胞膜結構，降解DNA等的損害[6]。超氧化物歧化酶(SOD)具有特殊的生理活性，是生物體內清除自由基的首要物質。它可對抗與阻斷自由基氧化過程中留下的有害成分對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞[7]。過氧化氫是氧化酶催化的氧化還原反應中產生的細胞毒性物質，會對機體造成損害，過氧化氫酶(CAT)能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣，可對細胞起保護作用，使機體免受過氧化氫的危害，是防御系統的關鍵酶之一[8-9]。SOD和CAT是機體防御過氧化損害系統中的兩個關鍵酶，其能有效地消除活性氧，防止細胞膜系統過氧化作用的發生?？寡趸烙到y的成分可由于氧化污染的脅迫而發生改變，抗氧化酶的活性可能會發生增加或抑制兩種應激改變，一方面取決于遭受脅迫的強度和時間，另一方面與遭受脅迫的生物種類的敏感性有關[10]。許多研究表明當生物受到不利因素脅迫時，其自身的抗氧化酶活性會發生顯著變化[11-13]。

大竹蟶(SolengrandisDunker) 隸屬瓣鰓綱，異齒亞綱，簾蛤目，竹蟶科，竹蟶屬，廣泛分布于我國沿海各地，生活在潮下帶至-20 m水深的淺海區，是我國重要的經濟貝類。近年來，關于大竹蟶在生物學[14-15]、環境因子對稚貝影響[16]、濾水率[17]、分子生物學[18-19]以及大規模生產性人工繁育技術[20]等方面的基礎研究已有相關報道。但關于鹽度脅迫下大竹蟶體內生理響應機制的研究目前尚不多見。本研究分析了大竹蟶在不同鹽度脅迫下的存活狀況以及不同鹽度對抗氧化酶活力的影響，探索大竹蟶對低鹽的耐受范圍，以期豐富大竹蟶的生理生態學基礎理論，為大竹蟶養殖技術研究提供基礎數據和理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用大竹蟶為江蘇省南通呂四海域自然群體，平均殼長為(68.28±2.46) mm。實驗前暫養于江蘇省海洋水產研究所呂四基地，暫養海水鹽度為28。暫養期間，持續微充氣，每天換水1 次，換水量為養殖水體的1/2，以湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiang)、亞心形扁藻(Platymonassubcordiformis)和綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)為主要餌料進行投喂，每日投喂2次，投喂間隔12 h。

1.2 實驗設計

實驗于2016年5月在江蘇省海洋水產研究所呂四基地進行。實驗設置鹽度為10、16、22、28、34、40和46共7個鹽度梯度 ，各鹽度海水由自來水加鹽鹵配制而成。實驗期間水溫保持在18.8～21.4 ℃，pH值7.8～8.6，水中溶解氧6.2～7.2 mg·L-1。每個鹽度梯度處理設置3個平行。實驗在70 cm×60 cm×50 cm 的塑料水槽中進行，每個水槽放50個大竹蟶，塑料槽預先鋪有15 cm厚的海沙。大竹蟶暫養后直接轉到已配好預設鹽度的塑料槽中，實驗期間的養殖管理與暫養期間一致，實驗開始階段各組投喂量相同，隨后根據各組稚貝生長和數量的變化進行適當調整，以保持水體藻細胞密度一致。實驗開始后分別于3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和96 h 記錄各組大竹蟶行為、體征和存活情況，并在各采樣時間點于每組中隨機取出4個，用于抗氧化酶的測定。

1.3 樣品處理與酶活性測定

將大竹蟶去殼取其鰓絲、外套膜和肝胰腺，經預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS: 氯化鈉8.0 g，氯化鉀0.2 g，磷酸氫二鈉2.9 g，磷酸二氫鉀0.2 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2)涮洗后，于-80 ℃凍存。待所有樣品取完后，統一化凍，用于酶活測定。采集的組織化凍后剪碎，加入其組織重量9倍的PBS，用勻漿器冰浴研磨勻漿。鰓絲和外套膜勻漿液于4 ℃ 3 500 r·min-1條件下離心10 min，取上清；肝胰腺勻漿液于4 ℃ 3 500 r·min-1條件下離心10 min，上清液再于4 ℃ 8 000 r·min-1條件下離心10 min，取中層液(上層為油脂，下層為組織碎片液)；用于抗氧化酶活性測定。

酶活性均采用南京建成試劑盒檢測，相應操作參照說明書進行。SOD 活性單位定義為每毫克組織蛋白在1 mL 反應液中SOD 抑制率達50%時所對應的SOD 量為1個活性單位；CAT 活性單位定義為每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol 的H2O2的量為一個活性單位。組織蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍G-250 法(Bradford，1976)，以牛血清白蛋白為標準蛋白繪制標準曲線，根據組織蛋白的OD590 nm的吸光值和標準曲線，計算出組織蛋白的含量(mg·mL-1)。

1.4 存活率的計算

在實驗開始后分別計算3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和96 h時各個試驗組的存活率，存活率=存活個體/個體總數×100 %。大竹蟶死亡界定：用針刺激大竹蟶足部，1 min內無反應即視為死亡。

1.5 數據分析

文中數據均以平均值±標準差(Mean±SD)表示，用Excel 2003作圖。使用SPSS 17.0進行統計分析，采用單因素方差(ANOVA)分析顯著性，使用LSD檢驗，顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同鹽度脅迫下大竹蟶的反應

鹽度為46時,大竹蟶在3 h內不潛沙，體色發黑，足僵直呈伸展狀態，處于一種近乎麻痹狀態，不活潑；6 h開始出現死亡，24 h全部死亡。鹽度為40時,大竹蟶不活躍，體色發黑，足僵直呈伸展狀態，96 h出現死亡。鹽度為22～34時，大竹蟶實驗期間無異常。鹽度為16時，大竹蟶在實驗開始階段，無明顯異常，隨著實驗的進行，3 h后大竹蟶蟶體潛沙較淺而有半截暴露在水中，至96 h時出現死亡個體，死亡的個體殼張開，足自然伸展，軟體部分呈水腫狀，有別于高鹽脅迫下死亡個體的體征。鹽度為10時，大竹蟶在實驗開始階段即表現出不適應，不潛沙，足呈伸展狀態，極度不活潑。3 h至12 h，大量大竹蟶不潛沙，至24 h時出現死亡。死亡的個體殼張開，足自然伸展，軟體部分呈水腫狀。48 h出現大量死亡，96 h全部死亡。

2.2 不同鹽度脅迫下大竹蟶存活率的情況

由圖1可見，鹽度為10時，大竹蟶24 h存活率為(94.74±5.27)%，48 h存活率僅為(20±5.77)%，96 h則全部死亡。鹽度為16時，大竹蟶96 h出現死亡，存活率為(86.67±3.34)%。鹽度為22～34時，大竹蟶96 h內存活率為100%。鹽度為40時，大竹蟶96 h出現死亡，存活率為(76.67±8.81)%。鹽度為46時，大竹蟶12 h開始出現死亡，存活率為(80.95±10.91)%，至24 h已全部死亡，存活率為0?？梢娺m合大竹蟶存活的海水鹽度在22～34。

圖1 各鹽度下大竹蟶的存活率情況Fig. 1 The survival of Solen grandis under different salinity stresses注：同一采樣時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)Note:Different letters at the same time mean significant differences among different salinity treatments (P<0.05)

2.3 各鹽度下大竹蟶的不同組織的過氧化氫酶(CAT)活力

由圖2可見，鹽度為16時，大竹蟶外套膜、鰓、肝胰腺組織中CAT活力在0-6 h無顯著變化，6 h時各組織的CAT活力均有顯著升高，其中肝胰腺的CAT活力為(15.84±2.13) U·mg-1prot，外套膜的CAT活力為(6.7±0.84) U·mg-1prot，鰓的CAT活力為(1.05±0.27) U·mg-1prot。而后，各組織的CAT活力漸漸降至平穩水平。鹽度為22時，CAT活力3 h出現了峰值。肝胰臟的CAT活力為(8.54±1.34) U·mg-1prot，外套膜的CAT活力為(6.26±0.88) U·mg-1prot，鰓的CAT活力為(2.83±0.46) U·mg-1prot。12 h后，各組織CAT活力漸漸降至平穩水平。鹽度28時，大竹蟶96 h各組織CAT活力基本維持穩定。鹽度34時，大竹蟶96 h各組織CAT活力有小幅波動，在3 h和24 h出現小的峰值，其它時間中基本維持穩定。鹽度為40時，大竹蟶各組織CAT活力在3 h時達到峰值，其中肝胰腺的CAT活力為(12.59±2.24) U·mg-1prot，外套膜的CAT活力為(14.66±3.21) U·mg-1prot，鰓的CAT活力為(1.88±0.17) U·mg-1prot。96 h各組織CAT活力漸漸降低，其中肝胰臟的CAT活力為(3.82±0.33) U·mg-1prot，外套膜的CAT活力為(3.04±0.51) U·mg-1prot，鰓的CAT活力為(0.40±0.13) U·mg-1prot，遠低于正常水平。

對不同組織CAT活力進行比較，發現各鹽度試驗組的CAT活力以肝胰腺最高，外套膜次之，鰓最低。鹽度為16的試驗組中，肝胰腺的CAT活力顯著高于其它組織(P<0.05)，外套膜48 h前的CAT活力顯著高于鰓(P<0.05)，48 h后則無顯著性差異。而在其它試驗組中，鰓的CAT活力均顯著低于其它組織(P<0.05)，而外套膜的CAT活力則與肝胰腺相近，在鹽度為40試驗組3 h CAT活力出現了高于肝胰臟的情況。

2.4 各鹽度下大竹蟶的不同組織的超氧化物歧化酶(SOD)活力

各鹽度下大竹蟶不同組織的超氧化物歧化酶(SOD)活力的變化情況見圖3。鹽度為16時，大竹蟶的SOD活力在實驗過程中變化幅度較大。3 h和12 h時，SOD活力均較其它時間有明顯降低，24 h至96 h則穩定在較高水平。鹽度為22時，大竹蟶SOD活力變化平緩，6 h和24 h時有小幅下降，其它時間維持穩定水平。鹽度為28時，大竹蟶96 h內各組織SOD活力基本維持穩定。鹽度為34時，大竹蟶SOD活力12 h達到最高值，其中肝胰腺的SOD活力為(63.80±10.32) U·mg-1prot，外套膜的SOD活力為(44.63±8.36) U·mg-1prot，鰓的SOD活力為(17.72±6.14) U·mg-1prot，12 h至24 h SOD活性維持在較高水平，48 h至96 hSOD活性則接近初始水平。鹽度為40時，3 h時SOD活性迅速升高出現峰值。肝胰腺的SOD活力為(57.09±13.34) U·mg-1prot，外套膜的SOD活力為(36.90±8.62) U·mg-1prot，鰓的SOD活力為(16.14±6.23) U·mg-1prot，隨后顯著降低，至96 h時，肝胰腺的SOD活力為(10.63±2.91) U·mg-1prot，外套膜的SOD活力為(12.71±2.64) U·mg-1prot，鰓的SOD活力為(4.92±0.98) U·mg-1prot，達到最低。

對不同組織的SOD活力進行比較分析，發現各鹽度試驗組的SOD活力高低排序同CAT活性排序結果一樣，即肝胰腺﹥外套膜﹥鰓。在不同鹽度試驗組中，鰓的SOD活力均顯著低于其它組織(P<0.05)，而外套膜的SOD活力雖略低于肝胰腺，但并無顯著性差異(P﹥0.05)。

圖2 各鹽度下大竹蟶的CAT活性變化Fig. 2 CAT activity dynamics under different salinity stresses注：(A)鹽度16下CAT; (B)鹽度22下CAT; (C)鹽度28下CAT; (D)鹽度34下CAT (E)鹽度40下CAT;同一采樣時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)Note: (A) CAT activity under salinity 16; (B) CAT activity under salinity 22; (C) CAT activity under salinity 28; (D) CAT activity under salinity 34; (E) CAT activity under salinity 40; Different letters at the same time mean significant differences among different salinity treatments (P<0.05)

圖3 各鹽度下大竹蟶的SOD活性變化Fig. 3 SOD activity dynamics under different salinity stresses注：(A)鹽度16下SOD; (B)鹽度22下SOD; (C)鹽度28下SOD; (D)鹽度34下SOD; (E)鹽度40下SOD;同一采樣時間點字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05)Note: (A) SOD activity under salinity 16; (B) SOD activity under salinity 22; (C) SOD activity under salinity 28; (D) SOD activity under salinity 34; (E) SOD activity under salinity 40; Different letters at the same time mean significant differences among different salinity treatments (P<0.05)

3 討論

3.1 大竹蟶對鹽度耐受性

鹽度對貝類的生理代謝活動有著重要影響。當環境鹽度超過其所適應的范圍時，機體會進行調節。當鹽度脅迫超過貝類自身生理調節所能承受的范圍時，其生理活動就會出現紊亂，進而死亡[21]。自然界的大竹蟶生活在潮下帶至水深20 m的淺海區，生活區域的海水環境受到雨水、河口淡水沖擊小，海水的鹽度相對穩定，使得大竹蟶對鹽度適應范圍窄，屬于窄鹽性貝類。綜合本實驗結果可見，大竹蟶較適宜的鹽度范圍約為 22～34。這與陳愛華等[16]的研究結果基本一致，接近海洋貝類墨西哥灣扇貝(Argopectenirradiansconcentricus)的23.6～35.7[22]，施獺蛤(Lutrariasieboldii)稚貝的19.8～33.8[23]，有別于河口貝類文蛤(Meretrixmeretrix)的7.3～38.7[24]。本實驗顯示，當大竹蟶受到低鹽脅迫時，其不潛沙或潛沙淺，蟶體松弛，足呈伸展態，活躍度低；解剖死亡的大竹蟶時，發現肝胰腺腫大，色澤發白，體內組織液增多。當大竹蟶受到高鹽脅迫時，其不潛沙體色發黑，足僵直而呈伸展態，處于一種近乎麻痹狀態，活躍度低；解剖死亡大竹蟶時，發現軟體部分收縮，肝胰腺色澤變深。

本研究表明大竹蟶屬于窄鹽性貝類，對低鹽和高鹽均存在不適應性。一般情況下，大竹蟶的養殖環境遭遇鹽度突然升高的可能性小，而遭遇低鹽的可能性較大。因為多雨易引起海水鹽度的大幅度波動，特別是暴雨季節，短時間內大量淡水的注入導致海水鹽度迅速下降，可能造成稚貝大量死亡。因此，在大竹蟶育苗過程中要密切關注鹽度變化情況，遇到連續雨天時要提前蓄水。在大竹蟶養殖池塘選址時，應選擇鹽度較穩定的區域以減少鹽度變化給大竹蟶養殖造成的損失。

3.2 不同鹽度對大竹蟶抗氧化酶的影響

已有研究表明，肝胰腺是貝類免疫的主要功能器官，貝類外套膜分泌的粘液亦有抑制和殺滅病原體的作用[25]，鰓在貝類受到外界鹽度脅迫時并具有重要調節作用，而抗氧化酶在生物體的自我保護系統中起著至關重要的作用，在免疫系統中也極為重要。

許多研究表明，生物在遇到不利因素脅迫時，抗氧化酶的活性可能會發生增加或抑制兩種應激改變。李子牛等[26]在研究青蛤(Cyclinasinensis)在不同鹽度海水中SOD和CAT活性的變化情況時發現，青蛤受鹽度脅迫時其抗氧化酶的波動基本于脅迫后的24 h內完成，青蛤對低鹽脅迫的耐受性高于高鹽環境；鹽度高于35時青蛤抗氧化酶波動劇烈，其活性水平反應免疫系統的活動情況。莊平等[27]以點籃子魚(Siganusguttatus)為對象，研究其在鹽度脅迫下SOD、CAT的活性變化趨勢，發現受到鹽度脅迫后酶活性均呈現出不同程度的先升高后降低的變化趨勢。鄭萍萍等[28]探索了三疣梭子蟹(Portumustrituberculatus)在高鹽和低鹽脅迫下免疫系統的變化情況。結果表明，在短時的高鹽和低鹽脅迫下SOD和CAT活力均隨時間呈現有升有降的變化趨勢。姜令緒等[29]在探討鹽度、溫度、金屬離子等環境因子脅迫對甲殼類動物的抗氧化酶活力的影響時發現酶活力與取樣時間、脅迫強度等因素均有相關關系。

本研究表明，鹽度為28的實驗組CAT、SOD活性趨于平緩，變化起伏小，說明在該鹽度下，機體的生理活動正常，不需要免疫系統進行過多的調節。鹽度為16時，CAT活力在6 h出現峰值，這可能與機體免疫系統在低鹽脅迫時進行應答有關；SOD活性則波動較大，96 h時仍維持在較高水平；大竹蟶在鹽度為16時，96 h出現死亡。表明鹽度16已超出其自身所能調節的范圍，生理活動處于紊亂狀態，進而出現死亡。鹽度為40時，CAT、SOD活性在3 h時出現升高，說明此時大竹蟶免疫系統對高鹽脅迫做出反應，然后兩種酶活力慢慢降低，至96 h時降至低于初始水平，說明脅迫強度過大時，會抑制免疫酶活力。不同組織的抗氧化酶活性比較結果表明，各鹽度下大竹蟶CAT及SOD活性均為肝胰腺﹥外套膜﹥鰓。這也驗證了肝胰腺在貝類免疫中起著主要作用。除鹽度為16時肝胰腺的CAT活力顯著高于外套膜 (P<0.05)外，其它鹽度下外套膜的CAT及SOD活力與肝胰腺相比雖略低，但并未出現顯著性差異(P﹥0.05)。這說明隨著鹽度的升高，外套膜在貝類免疫調節過程中所起的作用得到了顯著的加強。

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