東山島星座短腹海鞘共附生微生物多樣性研究

喬玉寶， 田曉清， 唐瑩瑩， 樊成奇， 馬麗艷， 陸亞男

(1中國水產科學研究院東海水產研究所，農業部東海與遠洋漁業資源開發利用重點實驗室，上海 200090； 2上海海洋大學，上海 201306)

星座短腹海鞘(Aplidiumconstellatum，也稱星座褶胃海鞘),原名星座美洲海鞘(AmarouciumconstellatumVerrill，也稱星座列精海鞘 )，屬脊索動物門(Chordata)尾索動物亞門(Urochordata)海鞘綱(Asciacea)三段海鞘科(Polyclinidae)短腹海鞘屬(或稱褶胃海鞘屬)，為復海鞘，在渤海、黃海、東海海域均有分布，是我國海鞘常見優勢物種之一[1-2]。此前已有文獻報道從該屬海鞘中分離出了具有多種骨架類型的生物堿、酚醌、環肽、大環內酯等成分，并顯示出抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[3-4]，提示其可能具有藥學或保健方面的應用價值。但迄今為止，尚未有關于星座短腹海鞘共附生微生物及其活性物質的報道。前期對星座短腹海鞘脂溶性提取物進行了研究，首次發現其具有降血脂功效，提示其可能具有進一步的開發利用價值，并開展了其脂溶性提取物提取工藝的初步研究[5-6]。

已有研究表明，海洋生物次生代謝產物的類型與多樣性與其共附生微生物的次生代謝產物類型與多樣性具有較強的相關性。海鞘中蘊含著豐富的微生物資源，其共附生微生物中可能存在著與海鞘生物中相類似的活性天然產物[7-8]。為進一步研究該海鞘及其共附生微生物的次生代謝產物，本文以福建東山島采集的星座短腹海鞘為研究材料，通過免培養微生物高通量測序技術和純培養技術對其細菌多樣性進行分析，一方面通過高通量測序技術首次解析了其共附生菌群的種類、豐度及多樣性信息，另一方面也積累了豐富的該種海鞘共附生微生物菌種資源，以期為進一步探索海鞘與微生物之間的共生、附生關系，并開展海鞘降血脂活性物質的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

星座短腹海鞘于2017年5月采自福建漳州東山島海域。采集后用大量海水沖洗并快速置于4 ℃冷藏保存，24 h內運回實驗室進行分析。

Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)；16 s引物(上海生工生物有限公司)；PCR擴增體系(北京康為世紀)。

1.2 實驗方法

1.2.1 高通量測序

星座短腹海鞘(20 g)樣品用無菌海水清洗3次，清洗干凈表面的泥沙，將清洗好的樣品用滅菌研缽研磨成漿，然后用適量無菌海水進行稀釋，備用。

DNA抽提：使用 Stool DNA Kit 試劑盒(OMEGA，美國)提取星座短腹海鞘樣品微生物的DNA。所有樣品的DNA 提取步驟均參照Stool DNA Kit試劑盒說明書。對提取到的樣品基因組DNA 用質量分數為1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測質量。

PCR擴增：針對細菌16S rRNA基因V3 + V4 區設計含 barcode 的特異引物338F /806R，引物序列為：338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG - 3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′。PCR擴增采用TransGen AP221-02：TransStart FastPfu DNA Polymerase，20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，Forward Primer(5 μM) 0.8 μL，Reverse Primer(5 μM) 0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，BSA 0.2 μL，Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。PCR條件：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27個循環；最后72 ℃ 10 min延伸(PCR儀：ABI Gene Amp? 9700型)。然后將獲得PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫； 2%瓊脂糖電泳檢測。

Miseq文庫構建及Miseq測序：構建測序文庫后在 Illumina Miseq平臺進行高通量測序(美吉生物公司，上海)[9]。

數據質控：MiSeq測序得到的是雙端序列數據，首先根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接(merge)成一條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向。數據去雜方法和參數：1)過濾reads尾部質量值20以下的堿基，設置50bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50bp以下的reads，去除含N堿基的reads；2)根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長度為10 bp；3)拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；4)根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2；使用軟件：FLASH、Trimmomatic。

數據分析：按照97%相似性對非重復序列(不含單序列)進行OTU聚類，得到OTU的代表序列;將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(門)，class(綱)，order(目)，family(科)，genus(屬)，species(種)統計各樣本的群落組成。16S細菌比對數據庫：Silva、RDP、Greengene。

軟件及算法: Qiime平臺， RDP Classifier，置信度閾值為0.7。

1.2.2 可培養共附生菌的分離及鑒定

可培養共附生菌的分離：將1.2.1中剩余海鞘研磨樣品用適量無菌海水稀釋，置4 ℃冰箱過夜，次日取上清液用無菌海水進行梯度稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4，分別涂布于2216E培養基，28 ℃培養10 d。待平板菌落長成，挑取不同形狀、不同顏色的菌落平板劃線進行純化，最后挑取劃線平板上單菌落接到斜面上，保種備用。

可培養共附生菌的鑒定：1)細菌基因組DNA的制備：將已生長到對數期的斜面菌落，接種到5 mL 2216液體培養基中，置于搖床28 ℃培養3～5 d，根據細菌基因組DNA提取試劑盒說明書步驟提取目標基因組DNA。2)引物設計：海洋細菌16S rRNA基因擴增選用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。3)PCR擴增體系為50 μL∶2×TaqPCR MasterMix 25 μL，引物各1 μL，模板DNA 3 μL，重蒸水20 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min[10]。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳[11]。4)DNA測序和系統發生學分析：委托上海美吉生物公司完成測序。獲得的16S rRNA基因序列提交GenBank用BLAST 軟件與已知序列進行對比，利用MEGA 5.1軟件繪制系統發育進化樹。

2 結果與分析

2.1 樣品信息統計

星座短腹海鞘所獲得的37 911條序列長度分布在293～480(表1)，420～440范圍內序列最多，為30 325條，其次是441～460，為7 502條(圖1)。

圖1 序列長度分布Fig.1 Length distribution of trimmed sequences

從稀釋曲線來看，隨著測序量的增加，稀釋曲線斜率逐漸降低，曲線趨向平坦，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量的新的物種(圖2)。

圖2 稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curve

2.2 物種注釋與評估

可操作分類單元(OTU，operational taxonomic units) 是在系統發生學Greengene或群體遺傳學研究中，為了便于進行分析，人為給某一個分類單元(品系，種，屬，分組等)設置的統一標志。要了解一個樣本測序結果中的菌種、菌屬等數目信息，就需要對序列進行聚類。通過聚類操作，對各個樣品的有效序列進行系譜分類，以 97%相似性水平為標準劃分OTU[11]，使得星座短腹海鞘共附生微生物所獲得的37 911條序列分為310個OTUs，注釋到24個門，41個綱，84個目，124個科，197個屬，249個種。

從多樣性指數表來看，ace值和chao值分別為310.327和310.091，說明所測樣品中所含OTU數目為310；Simpson值為0.373，Shannon值為2.494，說明所測樣品群落多樣性較高；樣本覆蓋率(Coverage)為99.99%，說明本次測序結果可以代表樣本中微生物的真實情況(表2)。

2.3 物種組成分析

從門的水平來看(圖4)，星座短腹海鞘共附生微生物優勢門有7個，分別為變形菌門(Proteobacteria，78.86%)、放線菌門(Actinobacteria，6.01%)、擬桿菌門(Bacteroidetes，4.67%)、藍藻門(Cyanobacteria，2.62%)、厚壁菌門(Firmicutes,1.79%)、柔膜菌門(Tenericutes，1.76%)、螺旋菌門(Spirochaetae，1.33%)，其它的17個門占2.95%。

表1 樣本信息統計表Tab.1 Sample information statistics

圖3 星座短腹海鞘共附生菌門水平分布圖Fig.3 The phylum level distribution of Aplidium constellatum associated bacteria

從屬的水平來看(圖3)，星座短腹海鞘共附生微生物分屬于197個屬，優勢屬有10個，分別為Ruegeria(60.83%)、SAR116_clade科下未知屬(3.27%)、Rhodococcus(2.40%)、Cyanobacteria綱下未知屬(2.26%)、Candidatus_Hepatoplasma(1.76%)、PeM15目下未知屬(1.61%)、Spirochaetaceae科下未分類屬(1.33%)、Thalassobius(1.26%)、Rhodobacteraceae科下未分類屬(1.23%)、Rhodospirillaceae科下未分類屬(1.08%)。

2.4 星座短腹海鞘可培養微生物類群的多樣性

從星座短腹海鞘中共分離獲得15株可培養共附生菌，對這15株可培養共附生菌16S rRNA基因進行PCR擴增及測序，所得序列與GenBank數據庫進行同源性比對(表3)，結果表明，15株可培養共附生菌分屬于8個屬，分別為弧菌屬Vibrio(7株)、希瓦氏菌屬Shewanella(2株)，其余的屬Pseudomonas、Pseudovibrio、Thalassobius、Exiguobacterium、Flavobacterium、Thalassospira各1株。從相似度來看，15株可培養共生菌與GenBank數據庫中菌種相似度在98%以上?；?6S rRNA基因的系統發育分析見圖 5。

表2 多樣性指數表Tab.2 Table of alpha diversity indices

圖4 星座短腹海鞘共附生菌屬平分布圖Fig.4 The genus level distribution of Aplidium constellatum associated bacteria

屬 Genus菌株編號 Strain No.相近模式菌株 Similar strain相似度/% SimilarityVibrio XZDF-10Vibrio tasmaniensis LMG 21574T (AJ514912)99.24XZDF-11Vibrio atlanticus Vb 11.11T (EF599163)99.17XZDF-16Vibrio neocaledonicus NC 470T (JQ934828)99.22XZDF-20Vibrio hyugaensis 090810aT (LC004912)99.86XZDF-24Vibrio crassostreae LGP 7T (CCJW01000022)99.31XZDF-25Vibrio chagasii R-3712T (AJ316199)98.80XZDF-7Vibrio cyclitrophicus P-2P44T (U57919)98.34ShewanellaXZDF-14Shewanella loihica PV-4T (CP000606)98.07XZDF-23Shewanella aquimarina SW-120T (AY485225)99.10PseudomonasXZDF-8-1Pseudomonas zhaodongensis NEAU-ST5-21T(JQ762275)98.93PseudovibrioXZDF-8-2Pseudovibrio ascidiaceicola DSM 16392T (AB175663)99.57ThalassobiusXZDF-12Thalassobius aestuarii DSM 15283T (AY442178)99.12ExiguobacteriumXZDF-13Exiguobacterium aestuarii TF-16T (AY594264)98.90FlavobacteriumXZDF-15Flavobacterium rakeshii FCS-5T (JF830803)99.51ThalassospiraXZDF-26Thalassospira xiamenensis M-5T (CP004388)98.71

圖5 基于16S rRNA序列構建的星座短腹海鞘可培養共附生菌的系統發育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on neighbor-joining analysis of 16S rRNA sequences

3 討論

本文通過高通量測序技術首次解析了星座短腹海鞘共附生微生物種類、豐度及多樣性信息，此結果對于深化對海鞘共附生多樣性的認識，指導其可培養共附生微生物的分離具有重要意義。

從研究結果發現，通過純培養技術所得到的可培養共附生微生物種屬數量較少，可能是由于本實驗只使用了2216E一種海洋培養基的緣故。以往的研究結果表明，使用不同的培養基對于微生物的多樣性發現有較大影響。因此在后續研究中應當增加分離培養基的種類，以提高共附生微生物的分離效果[8]。

研究結果顯示，從星座短腹海鞘中分離出的細菌中有弧菌、希瓦氏菌這兩種致病菌，這可能與本實驗采集海鞘的地點為當地主要海水養殖區有關，樣本可能在生長過程中受到養殖水產病害的污染。雖然這兩種致病菌并不屬于優勢菌株，但仍然提示在后期的海鞘開發利用過程中，應注意原料來源；在原料采集或共附生微生物的規?；囵B中，要注意監測水產致病菌的存在情況，避免可能帶來的安全隱患。

以往對海鞘共附生微生物的研究多采用純培養方式，本實驗采用了高通量測序方法。這主要是由于海洋中有許多微生物是不可培養的，只靠純培養技術不能全面了解微生物多樣性，而Illumina MiSeq高通量測序技術打破了純培養技術的限制，使得人們可以更快捷、全面了解微生物多樣性。因此，在以后的共附生微生物多樣性的研究中，結合高通量測序技術與純培養方法來探討海洋微生物多樣性，將更有助于深化人們對微生物資源的認識。

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