miR-581對結直腸癌細胞增殖與侵襲的影響及機制

張紅，馮繼紅，丁婷婷，泮紅飛，羅軍敏

(遵義醫學院附屬醫院，貴州遵義563003)

結直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發病率和病死率較高[1]。超過三分之一的結直腸癌患者最終會發展成遠處轉移[2]。miRNA是一類小的非編碼RNA，含有約22個核苷酸[3]。 miRNA能部分結合3′UTR的特定靶mRNA，導致mRNA降解或抑制翻譯[4]。miRNA在細胞增殖、發育和分化等生物學進程中起重要作用[5]，且多種類型的miRNA可能參與調節腫瘤細胞行為[6]。miR-581是一類新近發現的miRNA分子，最近研究顯示，miR-581在肝癌組織中的表達低于癌旁組織[7]，但對于其在其他組織中的研究目前鮮見報道。我們在前期基礎實驗中發現，miR-581在發生轉移的結直腸癌組織中表達明顯低于未發生轉移的結直腸癌組織。2013年6月～2017年6月，我們探究miR-581對結直腸癌細胞生物學的影響，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結直腸癌細胞株SW620、HT29、LOVO和人正常結直腸細胞FHC，購于上海中科院，L-15培養基、McCoy′s 5 A、RPMI1640培養基和0.25%胰酶購于美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)和雙抗購于美國?？寺」?；PBS磷酸鹽緩沖液購于BOSTER。miR-581 mimics和pcDNA3.1-過氧化物氧化還原酶蛋白1(PRDX1)購于上海吉瑪有限公司。氯仿、乙醇、異丙醇購于重慶川東化工公司。TRIzol裂解液、Premix ExTaq Version2.0和SYBR Premix Ex Taq購于日本Takara 公司。PCR 引物由上海Sangon Biotech公司合成。CCK-8試劑盒購于日本DOJINDO公司。Matrigel基質膠購于美國BD公司；Transwell小室購于美國康寧公司。GAPDH小鼠抗人一抗、β-actin小鼠抗人一抗購于武漢三鷹生物技術有限公司；Western blotting凝膠試劑盒和全蛋白提取試劑盒購于碧云天公司；ECL發光液購于索萊寶生物科技有限公司。SW620、LOVO、FHC細胞均培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的L-15培養基中，HT29細胞培養于含10%胎牛血清和1%雙抗的McCoy′s 5A培養基中，均于5%CO2、37 ℃條件下培養，每隔3 d換液1次，待細胞鋪滿培養瓶底進行傳代，以下實驗均取處于對數生長期的細胞。

1.2 細胞分組及處理 PBS緩沖液將細胞清洗干凈，胰酶消化細胞2 min，轉移至無菌15 mL離心管，離心并計數細胞，以每孔4×105個細胞接種于6孔板中，待細胞融合率達70%左右時進行轉染。將細胞分為實驗組(加入miR-581 mimics)和對照組(加入vector)；無血清培養基將Lipofectamine2000按3 μL/L進行稀釋，37 ℃孵育20 min，用無血清培養基分別將miR-581 mimics和pcDNA3.1- PRDX1按50 μmol/L稀釋，常溫下孵育5 min，最后與Lipofectamine2000等體積分別混勻，分別加入兩組細胞中，37 ℃孵箱繼續培養；12 h后，觀察轉染細胞狀態，并將無血清培養基更換為完全培養基，繼續培養，48 h后，提取細胞RNA，驗證轉染效率。

1.3 不同結直腸細胞株中miR-581表達檢測 采用實時熒光定量PCR法。按照說明書提取人正常結直腸細胞FHC和人結直腸癌細胞株SW620、HT29、LOVO中的總microRNA并逆轉錄為cDNA，以U6為內參，利用熒光PCR儀檢測相應cDNA中miR-581的相對表達量，反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，45個循環，獲取熒光信號溫度為60 ℃。采用2-ΔΔCt方法計算，重復3次。普通cDNA qRT-PCR檢測以GAPDH為內參，采用2-△△Ct方法進行統計，反應條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。選擇miR-581表達最低的細胞進行后續實驗。

1.4 結直腸癌細胞SW620增殖能力檢測 采用CCK-8實驗分別檢測miR-581 mimics組和對照組細胞增殖能力。消化并計數結直腸癌SW620細胞，以5 000個/孔細胞數接種于96孔板中，每組3個復孔，37 ℃孵箱培養；待細胞貼壁，觀察細胞狀態，吸出培養基，避光條件下，將CCK-8試劑和完全培養基按1∶10比例混勻，分別加入每孔細胞中，37 ℃孵育1 h；將miR-581 mimics和mimics vector 分別轉染入SW620細胞，48 h后收集細胞,酶標儀檢測490 nm波長處每孔細胞的吸光度值，并統計分析。

1.5 結直腸癌細胞SW620侵襲能力檢測 采用Transwell侵襲試驗。將5×104個SW620細胞置于上室，并加入Matrigel基質膠(BD Bioscience，Woburn，MA，USA)。將具有10%FBS和HGF(20 ng/mL)的培養基置于下室中。37 ℃孵育24 h，小心去除上膜表面上的細胞。用95%乙醇固定20 min后，用0.5%結晶紫溶液染色10 min，自來水沖洗干凈，于倒置顯微鏡下計數。

1.6 熒光素酶報告基因測定 構建含 PRDX1 基因野生型 3′UTR(含 miR-581 識別位點/wt)、突變型 3′UTR(miR-581 識別位點點突變/mut)片段，兩端均設計 XbaⅠ酶切位點，插入熒光素酶報告基因質粒(pGL3-promoter，Promega)構建 pGL3-3′UTR wt、pGL3-3′UTR mut。取生長狀態良好的HEK293細胞，將PRDX1與miR-581共轉染到HEK293細胞中，質粒轉染后48 h據Promega公司操作說明，裂解細胞，加入熒光素酶底物，檢測熒光素酶活性，驗證miR-581能否與PRDX1 3′UTR結合，證明miR-581是否能直接調控PRDX1。

1.7 SW620細胞中PRDX1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。根據PRDX1蛋白相對分子質量大小，配制凝膠，根據所測蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μL的蛋白Marker；跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加至120 V；切膠，根據所需條帶大小，對照蛋白Marker進行切膠，并準備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)；按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序按序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進行轉膜；轉膜結束后，PBST洗膜1次，并放入脫脂奶粉中封閉1 h;一抗，PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4 ℃過夜；二抗，PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光，并分析。

1.8 SW620細胞共轉染miR-581 mimics和PRDX1質粒后的增殖能力檢測 將SW620細胞分為miR-581 mimics組、miR-581+PRDX1組，前者轉染miR-581 mimics，后者將miR-581 mimics與pcDNA3.1- PRDX1共轉染，轉染方法同方法1.2，待轉染48 h后，消化細胞，同方法1.4通過CCK-8檢測細胞增殖能力。

1.9 SW620細胞共轉染miR-581 mimics和PRDX1質粒后的侵襲能力檢測 將SW620細胞分為miR-581 mimics組、miR-581+PROX1組，前者轉染miR-581 mimics，后者miR-581 mimics與pcDNA3.1- PRDX1共轉染，轉染方法同方法1.2，待轉染48 h后，消化細胞，同方法1.5通過Transwell檢測細胞侵襲能力。

2 結果

2.1 miR-581在不同結直腸癌細胞株中的表達比較 miR-581在人正常結直腸細胞FHC和人結直腸癌細胞株SW620、HT29、LOVO的相對表達量分別為1.02±0.13、0.50±0.12、0.47±0.21、0.65±0.09，miR-581在SW620細胞中的表達低于其他結直腸癌細胞株(P均<0.05)。

2.2 miR-581對結直腸癌細胞SW620增殖能力的影響 miR-581 mimics組、對照組中miR-581相對表達量分別為8.81±0.42、1.25±0.37,P<0.05。miR-581 mimics組細胞增殖能力弱于對照組(P<0.05)。

圖1 miR-581對SW620細胞增殖能力的影響

2.3 miR-581 對結直腸癌細胞SW620侵襲能力的影響 對照組通過Matrigel基質膠的細胞數量為(174.5±12.8)個/HP，miR-581 mimics組為(87.1±11.4)個/HP，兩組比較，P<0.05。

2.4 雙熒光素酶報告基因結果 野生型質粒與miR-581 mimics共轉染HEK293細胞后，顯著降低相對熒光素酶活性(1.04±0.12 vs 1.53±0.03，P<0.05)，而突變型質粒與miR-581 mimics共轉染HEK293細胞后，熒光素酶活性無明顯改變(1.64±0.04 vs 1.59±0.06，P>0.05)。miR-581能與PRDX1 3′UTR特異性結合。

2.5 miR-581對結直腸癌細胞SW620中PRDX1蛋白表達的影響 對照組、PRDX1組、miR-581 mimics組、miR-581+PRDX1組PRDX1蛋白相對表達量分別為1.15±0.34、2.87±0.28、0.40±0.09、1.95±0.37，四組間兩兩比較，P均<0.05。

2.6 PRDX1逆轉miR-581 對結直腸癌細胞SW620增殖能力的影響 第5天，miR-581+PRDX1組細胞增殖能力較miR-581 mimics組強，見圖2。

圖2 PRDX1干預后miR-581 對結直腸癌細胞

2.7 PRDX1逆轉miR-581 對結直腸癌細胞SW620侵襲能力的影響 SW620細胞共轉染miR-581 mimics和PRDX1質粒后的侵襲能力，較單獨轉染miR-581 mimics更強，但弱于單獨轉染PRDX1質粒的SW620細胞，細胞穿膜數分別為259.2±23.3、94.2±17.1、202.1±27.5，P<0.05。

3 討論

多種在腫瘤中異常表達的miRNAs分子，在腫瘤進展過程中起關鍵的調節作用[8]，miRNAs可靶向調控多種基因參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉移等生物學過程，與各種臨床腫瘤的發生發展密切相關[9]。本研究結合前期試驗基礎微陣列實驗及實時熒光定量檢查結果，發現miR-581在結直腸癌組織中的表達低于癌旁組織，且在轉移性癌組織中表達明顯降低，因此，我們推測miR-581在結直腸癌的發生發展中起到一定作用。

為進一步驗證miR-581是否在結直腸癌的增殖、侵襲和轉移中發揮重要作用，我們首先通過轉染miR-581 mimics上調SW620細胞中miR-581的表達，CCK-8實驗證實細胞增殖能力減弱，同時，Transwell侵襲實驗顯示miR-581能降低其侵襲能力。說明miR-581可能是潛在的抑癌基因，但miR-581在結直腸癌中的作用機制尚需進一步深入研究。

氧化應激在多種癌癥的發病機制中起重要作用。主要是由于活性氧(ROS)的過度產生導致DNA的結構損傷，如插入、缺失、堿基對突變或重排[10]。另外，ROS可直接激活細胞核與惡性轉化相關的細胞質信號轉導通路[11]。過氧化物毒素(PRDX)是具有復雜寡聚體的蛋白質家族結構的一類巰基過氧化物酶，哺乳動物有六種不同的PRDX ，各種類型的PRDX具有多種甚至相反的功能[12]。已證明PRDX1在乳腺癌[13]、惡性間皮瘤[14]和肺癌[15]組織中過度表達。此外，PRDX1與致癌基因的產物c-Abl和c-Myc相互作用，從而抑制c-Abl激酶活性[16]和c-Myc介導的轉化作用[17]。

而我們前期的研究發現，PRDX1可促進人結腸癌SW480細胞EMT的發生，從而增強結腸癌 SW480 細胞的侵襲、轉移能力[18]。我們通過Targetscan網站發現PRDX1與miR-581具有相似的結合位點，兩者可能有內在調控關聯。故我們選擇雙熒光素酶實驗驗證miR-581和PRDX1的相關作用關系。結果與我們的猜測一致，野生型質粒與miR-581 mimics共轉染HEK293細胞后，熒光素酶活性顯著降低，而突變型質粒與miR-581 mimics共轉染HEK293細胞后，熒光素酶活性無明顯改變。此外，我們還發現PRDX1的過表達顯著逆轉了miR-581對SW620細胞中增殖和侵襲的抑制作用。因此，PRDX1是miR-581的直接靶標，并且參與miR-581對結直腸癌細胞調控的影響。

綜上所述，miR-581可抑制結直腸癌細胞的增殖和侵襲，其機制可能與靶向調控PRDX1有關。