益生菌聯合制劑預先灌胃對急性感染性腦損傷小鼠抑郁樣行為的改善作用

徐娜娜，李聰，潘智華，顧兵2,

(1徐州醫科大學醫學形態實驗學分中心，江蘇徐州 221004；2徐州醫科大學醫學技術學院；3徐州醫科大學附屬醫院)

急性感染性腦損傷為一種嚴重危害兒童和成人健康的感染性疾病，是由各種化膿菌引起的以腦膜炎癥為主的中樞神經系統感染性疾病，發病率與年齡有關，嬰幼兒多見[1]；革蘭陰性菌是其常見的病原體，脂多糖(LPS)是革蘭陰性桿菌產生的內毒素，進入機體后可以產生強烈的免疫炎癥反應，為此病的主要致病因子。腹腔或側腦室注射LPS，可以誘導動物出現厭食、疲勞、快感缺乏、體質量減輕和睡眠障礙等一系列抑郁樣行為[2]。目前，LPS誘導小鼠抑郁的動物模型已成為研究抑郁癥與免疫炎癥關系及評價抗抑郁藥物的重要動物模型[3]。隨著抗生素和糖皮質激素的廣泛使用，急性感染性腦損傷的發病率已明顯減少，但仍有較高的病死率和致殘率。抑郁癥是一常見的精神疾病，嚴重危害人類健康，隨著生活節奏的不斷加快和社會競爭的日益加劇，世界衛生組織預測到2020年抑郁癥將成為全球殘疾負擔的第二大原因[4]。近年越來越多的研究[5]發現，感染性腦損傷的炎癥反應與抑郁癥的發生發展密切相關。益生菌是一類主要定植于人體腸道、生殖系統內，對宿主機體健康有益的低致病性或無致病性微生物，可以是單一菌株制成，也可以是多種菌的復合制劑[6]。近年來以多種益生菌為基礎所制備的各種聯合制劑受到越來越多的關注。研究[7]發現，多種益生菌的聯合制劑具有很好抗炎、抗氧化、清除自由基等生物活性。此外，益生菌聯合制劑還可以調節一系列與精神疾病有關的行為，包括抑郁樣行為[8]。那么益生菌聯合制劑對LPS誘導的小鼠抑郁行為是否有保護作用，目前研究較少，且效應機制亦不十分明確。本研究觀察了益生菌聯合制劑預先灌胃對急性感染性腦損傷小鼠抑郁樣行為的改善作用，并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 益生菌聯合制劑、試劑及行為學實驗系統 益生菌聯合制劑(包括雙歧桿菌、乳酸菌、乳糖和酵母等成分的多種益生菌的混合制劑)，已申請國家專利，專利號為ZL2015104679586，購自南京伯恩立施生物科技有限公司。IL-6、TNF-α單克隆抗體及LPS購自美國Sigma公司。行為學實驗系統為ZH-ZFT型自主活動實驗視頻分析系統(淮北正華公司)，活動箱大小為500 mm×500 mm×300 mm，采用Anymaze system4.72軟件(Stoelting公司)記錄分析。

1.2 實驗動物及分組 清潔級雄性健康ICR小鼠36只，3周齡，體質量8～11 g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。36只小鼠隨機分為益生菌組、脂多糖組、對照組，每組12只。

1.3 益生菌聯合制劑應用方法及急性感染性腦損傷模型制備 各組小鼠適應性喂養后，益生菌組預先灌胃100 mg/(kg·d)的益生菌聯合制劑2周，末次給藥1 h后，益生菌組和脂多糖組均腹腔注射1 mg/kg的LPS制備急性感染性腦損傷模型(小鼠出現立毛、上瞼下垂或嗜睡等表現說明造模成功)；對照組腹腔注射等量生理鹽水。

1.4 小鼠抑郁樣行為評價 制模6 h后，應用ZH-ZFT型自主活動實驗視頻分析系統記錄與分析各組小鼠的抑郁樣行為。用Anymaze system軟件將活動箱空間平均劃分為9個區域。先將小鼠置于明亮的曠場活動箱中適應2 min取出，再從活動箱的中央位置放入，記錄其5 min的行為學指標，包括活動時間、總路程(總活動度)、軌跡、區域分布，對運動總路程和穿格次數進行統計分析。再將小鼠置于黑暗的閉場活動箱中，同樣方法記錄相應行為學指標。

1.5 海馬組織IL-6、核轉錄因子κB(NF-κB)表達檢測 采用蛋白質印跡法。各組小鼠抑郁樣行為評價完成后，每組取6只立即處死，取腦組織，在冰上分離出大腦皮質，存放于凍存管，-80 ℃冰箱保存備用。將腦組織中加入裂解液，勻漿后，以12 000 r/min在4 ℃條件下離心15 min，所得上清即為胞質蛋白提取液。胞質蛋白用4×蛋白處理液配制成等濃度的蛋白樣品。取等量蛋白樣品10%SDS-PAGE分離后，以濕轉移法轉至NC膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入抗體孵育后洗膜，顯色后條帶掃描、分析及打印。目的蛋白表達量以免疫印跡中各目的蛋白條帶的灰度值與內參β-actin的比值來表示。

1.6 海馬CA3區神經元計數 采用焦油紫染色法。取各組剩余6只小鼠，動物麻醉后多聚甲醛灌注，快速取腦后固定24 h。石蠟包埋，切片機切片(5 μm)。采用焦油紫染色，37 ℃下染色15 min，70%酒精分色，脫蠟后中性樹脂封片，觀察并計數海馬CA3區1 mm2區域中存活的神經元。

2 結果

2.1 各組小鼠抑郁樣行為比較 ①活動軌跡：對照組小鼠曠場和暗場實驗中活動軌跡復雜，多處于四角和四邊區中，中央區相對較少；脂多糖組小鼠活動軌跡簡單，基本沒有進入中央區；益生菌組小鼠活動軌跡的復雜程度居于前兩組之間，分布特點依然是周邊區多，中央區少。②活動距離、穿格次數：各組小鼠制模6 h后曠場、閉場實驗中自主活動路程和穿格次數比較見表1。

表1 各組小鼠制模6 h后自主活動路程和穿格次數比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與脂多糖組比較，△P<0.05。

2.2 各組小鼠大腦海馬組織IL-6、NF-κB相對表達量比較 益生菌組IL-6、NF-κB相對表達量分別為0.61±0.04、0.41±0.03，脂多糖組分別為1.03±0.06、0.68±0.07，對照組分別為0.04±0.08、0.38±0.01，益生菌組、對照組分別與脂多糖組比較，P均<0.05。

2.3 各組小鼠海馬CA3區神經元存活數比較 對照組小鼠CA3區神經元數目多，排列整齊、緊密，細胞形態飽滿，結構完整，邊緣清晰；而脂多糖組小鼠CA3區神經元數目相對較少，排列紊亂、疏松，細胞形態差，結構不完整，基質疏松及空泡形成，細胞存活數明顯低于對照組；與脂多糖組比較，益生菌組CA3區神經元存活數顯著提高。益生菌組、脂多糖組、對照組神經元存活數分別為(132±5.97)、(51±4.31)、(146±6.78)個，益生菌組、對照組分別與脂多糖組比較，P均<0.05。

3 討論

急性感染性腦損傷是由各種化膿菌引起的以腦膜炎癥為主的中樞神經系統感染性疾病，常會導致患者認知障礙和抑郁行為等，此病治療困難，嚴重影響患者身心健康[9]。目前，臨床上主要針對感染性腦損傷導致的后遺癥進行治療，主要包括高壓氧、康復訓練及營養腦神經等，但尚無特效藥提前干預[10]。因此，積極探索減輕腦損傷的藥物具有重要意義。關于感染性腦病導致抑郁樣行為的病因和發病機制至今沒有完全闡明。細胞因子是免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質，可調節細胞生理功能，根據其在炎癥反應中的作用不同可分為促炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子[11]。自Maes[12]提出抑郁癥的細胞因子假說后，大量研究論證了抑郁行為常伴有免疫激活，表現為炎癥細胞因子分泌增多；且免疫激活也會引起個體情緒和行為的改變。因此，細胞因子可被看作是抑郁癥的生物標記物[13]。

益生菌是一組寄生于人體腸道的正常菌群，通過生物拮抗改善宿主腸道菌群生態平衡、刺激腸黏膜內皮細胞分泌的分泌型免疫球蛋白而發揮免疫增強作用，從而達到提高寄生宿主健康狀態的微生物[14]。臨床常用的益生菌有乳酸桿菌、糞鏈球菌、枯草桿菌、嬰兒雙歧桿菌、酪酸梭菌、酵母菌、腸球菌和蠟樣芽孢桿菌等菌株[15]。雖然不同種屬的菌株效果并不完全一致，但大多數的研究表明益生菌對人類和動物有廣泛的影響，且多種益生菌聯合使用效果更為突出。有研究[16]發現，含有瑞士乳桿菌和長雙歧桿菌的益生菌聯合制劑降低了動物和人類的焦慮性行為，同時也逆轉了大鼠心肌梗死后的抑郁樣行為[17]。此外，嬰兒雙歧桿菌可以減輕外周血中促炎細胞因子和色氨酸濃度，從而發揮抗抑郁樣行為作用[18]。研究[19]發現，添加益生菌的早期腸內營養可在一定程度上減少重型顱腦損傷所致炎癥反應，降低患者血清中NF-κB、IL-6水平。

曠場、閉場實驗是反映大鼠在新環境中探究行為及情緒的方法，可用來測試動物中樞神經系統的興奮或抑郁狀態[20]。穿格數及直立次數表示小鼠的探究行為，動物實驗結果顯示，脂多糖組小鼠空間認知能力降低，對新環境的適應能力減弱，緊張程度增高，小鼠在陌生環境中的自主活動和探究行為減少，表現為抑郁樣。在本實驗中，腹腔注射LPS可以引起小鼠抑郁樣行為，表現為小鼠曠場自助活動減少，穿格次數較少，而益生菌可顯著改善小鼠曠場的自主活動。閉場實驗中，雖然自主活動距離沒有顯著差異，但脂多糖組穿格次數明顯減少，說明注射LPS后，小鼠有抑郁樣溜邊的表現，探究行為明顯減少，而益生菌對這種現象有明顯的改善作用。

LPS是革蘭陰性桿菌產生的一種內毒素，進入機體后可以通過激活NF-κB，誘導產生各種炎癥細胞因子，IL-6是該過程中產生的一種關鍵促炎癥細胞因子[21,22]?，F有研究表明，IL-6在抑郁癥的發病過程中發揮了重要作用。臨床抑郁患者常表現出IL-6升高，常用的抗抑郁藥氟西汀可明顯降低小鼠腦組織與血清IL-6的表達[23]。NF-κB是細胞中重要的轉錄調節因子，其在機體中通常以p50-p65二聚體形式與抑制性蛋白IκB結合，呈非活化狀態[24]。當機體受到外界刺激(如LPS)后，NF-κB與抑制蛋白解離，變為活化狀態，活化的NF-κB可促使IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌增加，引起免疫炎癥反應,進而可能導致抑郁癥的發生[25]。本研究顯示，小鼠腹腔注射LPS后，大腦海馬組織中IL-6和NF-κB表達較對照組升高；而益生菌聯合制劑可顯著降低LPS引起的小鼠海馬組織IL-6和NF-κB表達升高。本研究還顯示，益生菌能夠提高小鼠海馬神經元的存活率，證明益生菌可減輕LPS導致的小鼠抑郁樣癥狀與保護海馬神經元損傷有關。

總之，益生菌聯合制劑可改善急性感染性腦損傷小鼠的抑郁樣行為，機制可能與其可降低IL-6、NF-κB表達及抑制海馬神經元損傷有關。