廣西壯族顱內動脈瘤患者血管內皮素受體A基因rs6841581位點多態性觀察

魏曉勇，葉子明，周瑜，秦超

(1武漢大學人民醫院，武漢 430060；2廣西醫科大學第一附屬醫院)

顱內動脈瘤(IA)破裂所導致的蛛網膜下腔出血(SAH)是一種極為兇險的腦血管疾病，是腦卒中主要亞型之一[1]。研究[2]表明，人群中有2%～5%患有無癥狀性IA，其中約1/4的IA患者會發生SAH。約50%動脈瘤相關蛛網膜下腔出血(aSAH)患者死亡，另有25%遺留嚴重神經功能障礙[3]。目前認為種族、性別、遺傳及一些獲得性因素是IA形成和發展的危險因素。Alg等[4]發現，rs6841581是與IA相關性最穩定的單核苷酸多態性位點(SNP)之一。rs6841581位于常染色體4q31.23，在血管內皮素受體A(EDNRA)基因轉錄子(NM001957.3)5′端調節功能區域內。由于疾病易感基因在不同地域和種群間可能具有遺傳差異，故仍需要對在不同種群中進行相關研究。目前，尚未見有EDNRA基因及其相關SNP位點與廣西壯族IA相關性研究報道。本研究采用PCR-RFLP方法檢測87例廣西壯族囊狀IA患者和111例健康查體對照者的EDNRA基因rs6841581位點基因型和等位基因頻率分布，并對其進行比較。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年11月～2015年10月廣西醫科大學第一附屬醫院收治的囊狀IA患者87例(觀察組)，男31例，女56例；年齡(58.76±12.28)歲。均經全腦血管數字減影造影(DSA)檢查確診。單發IA患者70例，多發IA患者(IA數量≥2個)17例；共計107個囊狀IA，其中位于頸內動脈48個、后交通動脈25個、大腦中動脈13個、大腦前動脈5個、前交通動脈12個、基底動脈4個。另選111例健康體檢者作對照(對照組)，男45例，女66例；年齡(61.58±8.46)歲。均同期MRA排除IA。所有入選對象均來自廣西壯族，同時排除顱內梭形動脈瘤、夾層動脈瘤、腦動靜脈畸形。此研究經廣西醫科大學第一附屬醫院倫理委員會批準，所有調查及抽血均獲患者及家屬同意并簽署知情同意書。

1.2 EDNRA基因rs6841581位點多態性檢測 ①DNA提?。撼槿∷醒芯繉ο笸庵莒o脈血5 mL，使用磁珠法手工核酸提取試劑盒(Xiamen Zeesan Biotech Co.Ltd)提取外周血有核細胞DNA。②PCR擴增：1.引物設計：根據NCBI提供的DNA序列，由上海生物工程公司設計合成PCR引物。PCR特異性擴增產物長度為408 bp。2.PCR反應體系組成：Template 1 μL(第一輪為基因組DNA，第二輪為首輪PCR產物)，2×Es Taq MasterMix 10 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 μL，ddH2O 8 μL混勻，3 000 r/min瞬時離心后PCR儀擴增。3.巢式PCR反應條件：預變性94 ℃、5 min，隨后進行第一輪循環20個周期，第二輪循環35個周期的變性94 ℃、30 s，復性60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，再延伸72 ℃、10 min。4.PCR產物電泳檢測：使用1%瓊脂糖凝膠(Agarose LE)置于0.5×TBE電泳液在100 V恒壓下水平電泳30 min，檢測是否有特異性的擴增產物。③RFLP分析：取PCR產物0.5 μL，10×Buffer R 1 μL，Eco72Ⅰ內切酶(10 U/μL)0.5 μL，ddH2O 8 μL，混勻，3 000 r/min瞬時離心，37 ℃、15 min，80 ℃、10 min酶切。取5 μL酶切產物加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，置于0.5×TBE電泳液并在120 V恒壓下水平電泳30 min后取出，放置在紫外光凝膠成像系統下觀察帶型。④DNA測序檢驗：從受試對象中隨機抽取AA、AG、GG三種基因型各15例PCR產物樣本，使用Sanger雙脫氧鏈終止法測序檢驗(3730XL測序儀)。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計數資料比較采用Pearson′sχ2檢驗及Fisher確切概率法檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR-RFLP反應產物電泳及基因型判定 PCR產物在紫外光凝膠成像系統下顯示為408 bp的單一條帶。PCR產物經Eco72Ⅰ限制性內切酶消化后，電泳檢測結果為rs6841581純合子型(G/G)顯示為252、156 bp兩根條帶。純合子型(A/A)顯示為408 bp一根條帶。雜合子型(A/G)顯示為408、252、156 bp三根條帶。隨機選取三型PCR產物各10份行Sanger雙脫氧鏈終止法DNA測序，結果與PCR-RFLP基因型判定一致。雜合子(A/G)基因型在該SNP位點顯示為A/G雙峰。

2.2 兩組基因型和等位基因頻率分布 結果見表1。

表1 兩組基因型和等位基因頻率分布(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 兩組不同性別入選對象基因型和等位基因頻率分布 結果見表2。

表2 兩組不同性別入選對象基因型和等位基因頻率分布(例)

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4 觀察組IA單發、多發者基因型和等位基因頻率分布 結果見表3。由表3可知，單發IA和多發IA EDNRA基因rs6841581位點的基因型、等位基因頻率分布比較無顯著性差異。

表3 觀察組IA單發、多發者基因型和等位基因頻率分布(例)

3 討論

Vernooij等[5]認為，IA具有明顯的家族聚集性，超過20%IA患者具有家族史。Brown等[6]使用MRA篩查報告家族性IA患者一、二級親屬中IA患病風險為8.7%～13.0%，遠高于普通人群患病率。許多遺傳性結締組織病，包括常染色體顯性遺傳多囊腎疾病、Ⅰ型神經纖維瘤病、馬凡綜合征等也與IA形成有關[7]。根據IA家族聚集性特點及其與遺傳性結締組織病的聯系，可推斷遺傳因素在IA發生發展過程中可能扮演重要角色。本研究發現，觀察組EDNRA基因rs6841581位點三種基因型(AA/AG/GG)頻率及等位基因(A/G)頻率分布與對照組比較均無統計學差異，而在隱性遺傳模式下純合子GG基因型在觀察組中的頻率顯著高于對照組，提示EDNRA基因rs6841581位點可能與廣西壯族人群IA相關，純合子GG基因型可能是易感基因型。

以往文獻報道，不同地區、種群間aSAH發病率存在顯著差異。研究[8]認為，中國北京漢族人群發病率較低(2.0/10萬)。文獻[9]報道，芬蘭和日本是aSAH高發地區，發病率分別為19.7/10萬和22.7/10萬。荷蘭、芬蘭和日本人群GWAS研究均證實EDNRA基因rs6841581位點與IA相關，且等位基因G為易感基因[10]。EDNRA基因與中國漢族人群散發IA相關性研究也表明，rs6841581等位基G攜帶者患IA風險較等位基因A高，純合子GG攜帶者患病風險是純合子AA的2.85倍[11]。IA的組織學特點主要為動脈血管壁的局部完整性受損，包括血管內皮功能異常、內膜增生、細胞成分的消亡及細胞外基質的紊亂等[12]。血管內皮素是血管壁損傷后組織重塑過程中的強烈收縮劑。EDNRA是一種主要存在于血管平滑肌細胞，包括腦血管、心臟、腎臟及神經元等在內的G蛋白偶聯受體，具有調節內皮素主要的同工型-EDN1的血管收縮及有絲分裂的作用。EDNRA通過加快細胞周期進程和增殖來調節內皮素1的有絲分裂效應。血管內皮素信號在血管壁受損的地方被迅速激活可能有利于促進內皮細胞修復損傷?；蚬δ苎芯勘砻?，EDNRA基因rs6841581位點的等位基因G可使EDNRA基因轉錄下調[13]。EDNRA轉錄下調可抑制EDN信號，干擾血管損傷的修復過程，限制血管祖細胞的活動而導致修復缺陷，進而可能促使IA形成和發展[10]。

本研究顯示，觀察組女性基因型、等位基因頻率分布和對照組比較無顯著差異。觀察組男性等位基因G頻率顯著高于男性對照組，提示SNPrs6841581等位基因G與廣西壯族人群男性IA患者相關。Nguyen等[14]流行病學研究發現，女性IA患病率高于男性，認為女性是IA的主要危險因素之一。女性患者動脈瘤擴大的風險是男性的1.26倍[15]。在不同年齡段中，女性aSAH患者發病率均高于男性，女性占IA相關SAH患者的比重也隨年齡增高而增大，女性易感IA的原因可能與內分泌等因素有關，性激素受體在血管內廣泛存在，除直接作用外還可能通過對脂肪代謝和凝血功能的影響產生作用。女性絕經后體內雌激素水平下降， 可使組織內膠原蛋白含量降低， 從而導致血管壁強度降低，在血流作用下促使局部血管壁擴張而形成IA。由于女性額外具有的IA風險，使得 SNPrs6841581等位基因G作用對女性IA形成和發展的影響比重降低。這也可能是導致本研究中女性IA患者多于男性，而女性與SNPrs6841581相關關系卻呈陰性結果的原因。

本研究觀察組中多發IA患者17例，占IA患者總人數 19.5%，低于文獻[16]報道的27.9%。多發IA常分布在兩側腦動脈，特別是在兩側頸內動脈及大腦中動脈上。多發IA的年破裂率為 6.8%，而單發IA的年破裂率僅為1．9%。學者認為多發性顱內動脈動脈瘤在青少年IA患者中更為常見，相對于單發IA，多發IA可能與家族性IA及先天血管發育不良性IA更為相關[17]。兩種不同IA亞型特征提示它們的形成和發展機制以及易感基因位點多態性可能存在差異。本研究對單發IA患者和多發IA患者兩個亞組的EDNRA基因rs6841581位點基因型及等位基因頻率分布進行了相互比較，未發現該位點基因型和等位基因頻率在兩個IA患者亞組間有顯著性差異。造成這種結果的原因，可能由于IA是一種復雜基因遺傳病，EDNRA基因rs6841581位點基因型及等位基因頻率分布對廣西壯族IA人群的單、多發IA分型影響較小，也可能是由于總體樣本量偏少且分組后兩個IA亞組的人數較為懸殊，造成了統計學偏差。EDNRA基因rs6841581位點多態性與單發IA和多發IA亞組分型的關系還需進一步研究。

總之，廣西壯族人群IA患者存在EDNRA基因rs6841581位點多態性，GG基因型可能是IA的易感基因型。