AM真菌對藍莓根際微生態的影響*

潘 霞， 韓薛婧娉， 陳僑月， 楊 莉， 朱友銀， 郭衛東， 陳文榮

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

0 前 言

藍莓(Vacciniumspp.)為杜鵑花科越桔屬漿果類經濟植物，其果實內富含花青素等物質，具有提高視力、延緩衰老及防癌等功效，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一，近幾年引起廣泛關注[1].藍莓雖然有近百年的商業種植歷史，但我國藍莓種植起步較晚，近年來，浙江等南方省份藍莓產業發展迅猛，但栽培相關配套技術研究卻嚴重滯后，目前僅有少量有關于藍莓品種篩選及果實品質特性的研究報道[2].藍莓根系淺，僅具大量細根而無根毛；同時，藍莓為喜酸性植物，在堿性環境下容易出現葉片缺鐵性失綠，引起藍莓生長不良甚至死亡[3].這些特殊的生物學特性均與藍莓根與根際土壤互作關系密切，在這一相互作用中，AM真菌可能發揮了重要的作用.

研究表明,接種AM真菌能夠改善植株營養狀況、促進植株生長[4]、增強植物抗病及抗逆性[5-6]；同時，AM真菌通過生態位競爭等方式對土壤微生態進行有益調節[5-6].目前,國內外對大豆[6]、玉米[7]等作物的相關研究較多，對果樹等木本植物的有限報道表明，AM真菌對果樹具有促進養分吸收的作用，從而促進植株生長[8].已有研究表明，接種AM真菌后增強了‘奧尼爾’藍莓對干旱脅迫的適應能力[9]，接種不同AM真菌能不同程度提高藍莓的抗寒性[10]，但AM接種后對藍莓的生物量生長及根際微生物的影響仍未見報道，AM菌侵染規律等相關機理仍缺乏研究.

AM真菌的接種效果取決于菌株、宿主植物、菌株與宿主植物的協調性及土壤生態條件等[11].基于氣候、立地條件等因素的菌種選擇是AM真菌在藍莓生產上應用的關鍵，浙江等南方省份藍莓產業發展較晚[2]，目前未見相關研究報道.本研究以浙江省主栽藍莓品種‘布里吉塔’為材料，接種4種AM真菌，從生物量生長、根系解剖結構等方面研究AM真菌與藍莓根系的互作；從土壤酶活及微生物多樣性調查等角度分析AM真菌對藍莓根際微生物的生態結構組成的影響；深入分析AM真菌對藍莓生長的作用機理，以期明確促進藍莓生長的AM真菌種類，同時建立相關技術體系，促進藍莓產業的健康發展.

1 材料與方法

1.1 植物材料及AM真菌處理

供試的4種AM真菌購自中國農業微生物菌種保藏管理中心.以通過組培苗扦插生長的一年生北高叢藍莓‘布里吉塔’(Brigitta)作為供試藍莓材料(取自浙江師范大學特色經濟植物生物技術研究重點實驗室)，隨機分成6組，每組10株，按盆栽培養的方法[12]將組培苗移植到滅菌土壤中，分別在植株根部1 cm處接種厚約1 cm的蜜色無梗囊霉、聚叢球囊霉、幼套球囊霉和摩西球囊霉(分別標記為A,B,C,D)，另外2組分別用干熱法進行滅菌處理(為M組)及空白對照(為K組).

所有藍莓苗均置于同一室外條件下，使其在光照充足的26 ℃通風環境下生長，每2 d澆水1次，每5 d觀察藍莓長勢.處理72 d后收獲樣品，稱重，取樣進行切片觀察；同時用抖土法收集根際土進行酶活測定及微生態的分析(易于從根系上抖落的土壤為土體土壤，和根系緊密結合不易抖落的土壤為根際土壤).

1.2 AM真菌侵染情況觀察

將72 d收獲后的新鮮藍莓幼苗洗凈晾干，分別選取各組別粗細長短一致的初生根段進行切割，置FAA固定液(V(70%乙醇)∶V(冰醋酸)∶V(38%甲醛)=18∶1∶1)中充分浸透，固定3 h.將固定好的材料在70%乙醇中放置12 h后，依次經過70%，85%，95%直至100%乙醇的脫水處理，每次時間為2 h.經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟等步驟制成藍莓根系石蠟切片[13]，在光學顯微鏡下觀察AM真菌對藍莓根系的侵染情況[14]，并對其侵染情況進行分析.

1.3 土壤微生物種類多樣性分析

采集的土壤樣品根據Omega Soil Kit試劑盒說明書進行總DNA的提取，總DNA適當稀釋后進行2輪PCR擴增.PCR反應體系為50 μL，其中包括10×PCR反應緩沖液(MgCl2) 5 μL，10 mmol/L的dNTP溶液4 μL，上下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶1 μL，DNA模板為2 μL，蒸餾水34 μL.擴增程序設定：94 ℃下預變性5 min，94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，經過35個循環后，72 ℃延伸10 min，最后在4 ℃條件下保存.擴增結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物.

第1次PCR：引物為真菌ITS通用引物58Sf-GC 和28S1-r擴增，細菌通用引物534和341-GC擴增.以上述PCR產物為模板進行再次PCR 擴增(Reconditioning-PCR).

第2輪PCR產物濃縮后取15 μL，采用Bio-Rad公司Dcode TM的基因突變檢測系統進行DGGE分析.制備DGGE梯度凝膠[15].真菌采用8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為45%～80%(40%的去離子甲酰胺與7 mol/L的尿素的混合物為100%變性劑)；細菌則采用6%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為40%～60%.65 ℃，50 V電泳13 h.電泳完成后，采用銀染法[16]進行DGGE膠染色.將觀察到的結果用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統進行拍照，并使用Bio-Rad Quantity One軟件對DGGE條帶進行系統分析.

1.4 土壤微生物豐度測定

采用稀釋涂平板[17]的方法，分別配制牛肉膏蛋白胨培養基、高氏培養基和PDA培養基以適合細菌、放線菌和真菌生長，制備不同稀釋度的根際土壤懸液.在各培養基中選取稀釋度為10-3，10-4和10-5的土壤菌懸液進行接種，分別在適宜溫度下培養至菌落數穩定后，計算菌落數.同一平板計數時，至少對其進行重復3次計數，然后記錄其平均值.土壤微生物數量(CFU/g)為每克土壤中的菌落平均數乘以稀釋倍數.

1.5 土壤酶活性的測定

采集的土壤樣品風干后進行酶活性測定.脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，其活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的mg數表示[18]；蔗糖酶與纖維素酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法，活性分別以24 h后1 g干土生成的葡萄糖mg數，以及72 h后1 g干土生成的葡萄糖mg數表示[19]；過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法，活性以每g干土1 h內消耗的0.1 mol/L KMnO4體積數表示[19].

所有實驗結果的測定，至少重復3次，數據采用平均數±標準誤差表示，并進行方差分析.主要應用方差分析、最小差異顯著性(鄧肯氏新復極差法)檢驗(P<0.05)、T檢驗這3種方法對數據進行分析，均采用SPSS 10.0統計軟件進行分析.

2 結果與分析

2.1 AM真菌處理對藍莓植株生長的影響

與滅菌處理組(M組)相比，4種AM真菌處理后的藍莓生長量普遍提高，這種對生物量的促進作用在地下部尤為顯著；而在地上部，僅B，C組顯著高于對照組(K組)，分別為對照組的169%及170%.4種候選AM真菌中，聚叢球囊霉(G.agregatum，即B組)的接種對藍莓植株生長的促進作用最明顯，地下部分及地上部分別為對照組的1.12和1.29倍，而接種蜜色無梗囊霉對藍莓植株生長的效果與對照組無顯著差異.

不同小寫字母表示同一品種不同處理在P<0.05水平上呈顯著差異

2.2 藍莓根系AM真菌侵染影響

接種AM菌72 d后，從石蠟切片的顯微結構觀察到，AM真菌在藍莓根中形成泡囊、叢枝及菌絲，表明叢枝真菌與藍莓根系建立了明顯的的共生關系(見圖2).而對照組及滅菌處理組內的菌絲與泡囊均很少見，呈現正常的根縱切圖.菌絲可存在于根外及細胞間隙中，也可存在于細胞內；菌根形成泡囊結構，其結構為球形和橢圓形，分布在根的皮層.根系的泡囊豐度代表了泡囊在整個根系中的豐富程度，圖2中c為B菌接種的藍莓根內典型細胞圖，泡囊密度顯著高于其他菌株處理及空白對照.各處理組樣品侵染程度有所差別，B組顯著高于其他組別.藍莓菌根侵染率分級標準與侵染強度標準參考文獻[20].侵染后供試植株的孢子數量也存在顯著差異，接種聚叢球囊霉(B組)的孢子數量最高，平均為38個，而A組、C組和D組的平均孢子數分別為17個、26個和21個(見表1).

a～f分別為：根外菌絲、根內菌絲及叢枝、泡囊、侵入點、M組根系切片和K組根系切片

表1 接種不同AM真菌后藍莓根際菌根侵染率

組別AM菌種菌根侵染率/%侵染等級侵染強度孢子數量A蜜色無梗囊霉(A. mellea)20.82弱17B聚叢球囊霉(G. aggregatum)25.12弱38C幼套球囊霉(G. Etunicatum)22.72弱26D摩西球囊霉(G. mosseae)21.22弱21

2.3 AM真菌處理對藍莓根際土壤微生物量的影響

經AM真菌處理后的藍莓根際微生物的分布發生大幅度的改變，其中細菌的分布顯著減少，而放線菌與真菌的分布大幅度增加(見圖3).與未處理的藍莓組相比，接種蜜色無梗囊霉(A組)的處理放線菌、真菌、細菌分別為對照的197.1%，157.4%及61.5%；接種聚叢球囊霉(B組)相應變化率為275.5%，189.3%及8.3%；另2個菌接種后微生物多樣性變化率介于以上二者之間.由此可見，AM真菌接種促使根際微生態向“真菌型”發展.

不同小寫字母表示同一品種不同處理在P<0.05水平上呈顯著差異

2.4 PCR-DGGE 法探究根際微生物多樣性

變性梯度凝膠電泳(DGGE)能夠分離PCR產物中不同堿基序列的片段，由此得到數目及位置各不相同的電泳條帶，從而用來分析菌群結構在不同處理下的差異性及多樣性.DGGE中的每一個條帶都和菌群中的某一優勢群落或操作分類單元(operational taxonomic unit，OUT)相對應，條帶數目與微生物多樣性的豐富程度相對應，而染色后DGGE條帶的亮度越亮，則說明了該種群數量越多，從而能夠反映土壤中微生物的種類和數量.

圖4 16S rRNA V3擴增片段的DGGE圖譜 圖5 ITS rRNA擴增片段的DGGE圖譜

由DGGE結果可知，各處理PCR產物通過變性梯度凝膠電泳得到了有效地分離，每一條泳道上都出現了大量條帶.對所得到的DGGE圖譜進行Quantity one軟件分析，結果顯示,在不同處理條件下土壤DGGE圖譜上條帶的數目不等，位置也存在一定差異，細菌群落結構處理組有許多公共條帶，且這些條帶在亮度上變化不大(見圖4)，這表明細菌群落結構單一，與對照組相比，4個處理組的細菌豐富度變化不明顯；真菌群落結構處理組A，B，C，D與對照組M，K相比,有明顯差異.對DGGE數據分析可知(見圖5)，不同處理組之間存在某些特有條帶，這表明不同處理下，土壤中真菌種群的構成發生了改變，真菌類型出現了不同程度的增加或減少.對比各處理間的公共條帶，發現有些條帶的亮度產生了明顯的差異，這說明這些共有的真菌種群在數量上發生了變化.從總體上看，真菌群落變化較大，4個處理組均比對照組豐富度高且處理組之間差異較明顯，真菌類型發生了改變，說明不同的真菌對藍莓土壤中的真菌群落結構的影響不同，從而改變了土壤中的真菌群落結構.

2.5 AM真菌對土壤酶活的影響

4種AM菌株均顯著提高藍莓根際土壤的纖維素酶、蔗糖酶及過氧化氫酶活性，其中蜜色無梗囊霉(A組)處理下的藍莓根際土壤中纖維素酶活達到最大值為5 U；4種AM菌種相較而言，蜜色無梗囊霉(A組)和幼套球囊霉(C組)對纖維素酶活的促進要高于另外2個菌種(見圖6).4種AM菌種處理之間對藍莓根際蔗糖酶及過氧化氫酶均有促進作用，但4種菌株間無顯著差異.接種4種AM真菌中，僅聚叢球囊霉對脲酶酶活性產生顯著影響.

不同小寫字母表示同一品種不同處理在P<0.05水平上呈顯著差異

3 討 論

藍莓作為淺根系植物，根系結構獨特，僅具細根而無根毛，目前普遍認為根部共生的AM真菌對其養分吸收發揮了重要作用[21].但也有研究表明，AM真菌與兔眼及高叢藍莓的互作對其生物量的生長均無明顯作用[22-23].本研究中，4種AM真菌處理后的藍莓生長量普遍提高，對生物量的促進作用在地下部尤為顯著，表明AM真菌對藍莓生產普遍具有積極的意義.4種候選AM真菌菌種中，聚叢球囊霉(即B組)的接種對藍莓生長促進作用最大，這與高麗霞等[24]的研究結果相一致.AM接種效果受菌株及土壤生態條件等多重因素影響[9]，球囊霉屬的適應范圍最廣、能力最強，pH 5.0～9.0的土壤中均有分布[25]，本研究中的聚叢球囊霉很可能更加適應藍莓根際微環境.

AM真菌侵染宿主植物根系形成菌根后，顯微切片能夠較好地顯示侵染結果.本研究中，雖然4種AM真菌對藍莓根系的侵染率較弱，但根系在光學顯微鏡下均能觀察到明顯的叢枝菌根真菌的菌絲、泡囊，其可存在于細胞中，也可存在于細胞間隙[26]；同時在根部皮層結構內可觀察到典型的泡囊結構，呈球形和橢圓形.聚叢球囊霉(即B組)接種后的藍莓細根中泡囊密度及頻度均最高，侵染率達25.1%，表明其在根內的豐富度最大[27]，這可能是該處理組生物量生長最大的重要原因.

植物與AM真菌的共生關系還可能通過調節根際微生物多樣性間接影響宿主植物的生長[28].本研究中，AM真菌對藍莓土壤中的真菌群落生長起到促進作用，同時，細菌群落結構出現“真菌化”現象，即形成真菌菌群結構多樣性增加、細菌菌群豐度減少的趨勢.龔娜等[32]研究發現，接種真菌促生菌液使根際細菌數量顯著減少，真菌數量有所增加，這與筆者的研究結果相一致.一般而言，以真菌為主的根際微生物結構更加有利于植物生長[11]，據此推測AM真菌接種藍莓后通過生態位競爭方式將有害菌生長勢弱化，從而使有益菌成為優勢菌種[29].

土壤酶主要來自微生物及植物根系分泌等途徑，蔗糖酶和纖維素酶參與蔗糖及纖維素等糖類的降解，其活性可表征土壤生物學活性強度及評價土壤熟化程度和土壤肥力[30].本研究中，4種AM菌株均顯著提高藍莓根際土壤的纖維素酶、蔗糖酶，表明AM真菌可通過增加有益菌群而促進土壤酶活的改變，達到增加土壤可溶性營養的目的.許慶龍[9]研究發現接種AM真菌后提高了藍莓植株根圍土壤酸性磷酸酶、脲酶和過氧化氫酶活性，尤以聚叢球囊霉處理明顯.過氧化氫酶能將H2O2分解成H2O和O2，對動植物的生長發育和代謝活動具有保護作用[31]，AM真菌對其活性的提高作用有利于根部的抗氧化保護.本研究采用的4種AM菌株中僅聚叢球囊霉(即B組)接種后脲酶活性顯著高于空白對照，從側面反映了聚叢球囊霉可對根際土壤進行有益調節.

由此可見，藍莓根系接種AM真菌后能形成共生體系，此種共生關系能夠顯著改善根際微生態環境，使根際微生物向“真菌型”轉變，有益微生物的增加還可使蔗糖酶等土壤有益酶酶活提高，增強了根際可溶性營養，并最終促進藍莓的生物量生長.