用45個SNP位點組合對國家嚙齒類實驗動物種子中心3個封閉群小鼠群體的遺傳狀況分析*

李銀銀 王 洪 李長龍 郭 萌 魏 杰張 鈺 黃 韌 陳振文 杜小燕

(1.首都醫科大學基礎醫學院，北京 100069)(2.中國食品藥品檢定院實驗動物研究所，北京 100050)(3.廣東省實驗動物監測所，廣州 510633)

封閉群小鼠在生物醫學研究各個領域中廣泛應用[1]。國家嚙齒類實驗動物種子中心負責對國內各實驗動物生產單位提供種源，其動物遺傳質量關系到國家實驗動物質量安全，影響巨大。定期對群體遺傳質量實施監測可為維持群體符合封閉群要求提供可靠信息，為群體保種和繁殖方式提供指導。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms，SNP)是近年來出現的第三代遺傳標記，由于其具有數目多、分布廣、遍布整個基因組及穩定遺傳的特點，適于對小鼠遺傳狀況進行描述[2]。但在國內報道中，大多數研究者選用微衛星DNA技術對封閉群小鼠進行遺傳質量分析，而SNP則多用于近交系小鼠的遺傳檢測[2-4]。本實驗選取45個SNP位點對來自國家嚙齒類實驗動物種子中心北京分中心的ICR(BICR)和上海分中心的ICR(SICR)和KM(SKM)小鼠3個群體進行遺傳分析，以期探討單核苷酸多態性分析在封閉群小鼠遺傳質量檢測中的應用，并與我們前期完成的微衛星DNA(microsatellite DNA or short tandem repeat, STR)和生化位點方法進行了比較。

1 材料與方法

1.1 動物樣本

選取國內較常用的2個封閉群小鼠品系的3個群體，分別是來自國家嚙齒類實驗動物種子中心北京分中心的ICR群體(BICR)和上海分中心的ICR群體(SICR)及KM種群(SKM)，均為SPF級。每個群體隨機選擇30只小鼠，取0.1 g腎組織于無菌EP管中，-20 ℃凍存備用。本實驗已經通過首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員會審核(AEEI-2016-187)。

1.2 小鼠基因組DNA的制備

對EP管中的組織加入2 mL DNA裂解抽提緩沖液，20 μL 20 mg/mL蛋白酶K，10 μL RNA酶，55 ℃消化過夜，酚氯仿法提取基因組DNA，加入TE緩沖液進行溶解。經Nanodrop 2000c微量分光光度計檢測吸光度A值在1.8～2.0之間，并經1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA質檢合格。取原液適量稀釋為50～100ng/μL濃度作為DNA模板，于4 ℃保存備用。

1.3 SNP位點的選擇

本研究所用45個SNP位點從相關文獻中選取[3-5]，位點的選擇盡量均勻分布于小鼠的1～20號染色體上，較大范圍覆蓋小鼠基因組。

1.4 飛行時間質譜(MALDI-TOF)技術SNP位點基因分型[6]

1.4.1PCR擴增反應：根據SNP位點查詢NCBI數據庫中的序列信息，使用Sequenom公司的引物設計軟件Assay design 3.1設計PCR反應和單堿基擴展引物，并進行引物合成。PCR體系包括模板DNA1μL，上下游引物(500 nmol/L)各1 μL，dNTP Mix(25 mmol/L)0.1 μL，HotStarTaq DNA 聚合酶(5U/μL)0.1 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.325 μL，PCR Buffer(1.25×)0.625 μL和ddH2O 1.85 μL。擴增條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環45次；最后72 ℃持續3 min。

1.4.2產物堿性磷酸酶處理反應：反應體系包括0.3 μL蝦堿性磷酸酶(SAP)(1 U/μL)，10×的SAP Buffer 0.17 μL和ddH2O 1.53 μL，將反應混合物加入到上一步PCR產物中。設置反應程序為：37 ℃保溫20 min，85 ℃保溫5 min。

1.4.3單堿基延伸反應：將多重PCR反應混合物加入上一步SAP酶消化后的產物中。iPLEX反應體系為iPLEX酶0.041 μL，iPLEX Buffer Plus 0.2 μL，引物混合液0.94 μL，iPLEX終止混合液0.2 μL和ddH2O 0.619 μL。設置延伸反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，52 ℃退火5 s，80 ℃延伸5 s內部循環5個，持續外部循環40個。最后72 ℃延伸3 min。

1.4.4MALDI-TOF-MS檢測：PCR反應完成后向產物384孔板中加入16 μL三蒸水，翻轉離心機中室溫旋轉混勻30 min，經樹脂純化。將樹脂純化后的延伸產物點在樣品靶上，MALDI-TOF質譜儀分析，檢測結果使用TYPER4.0軟件獲取，根據質譜峰圖判讀各樣本各位點基因分型。

1.5 群體遺傳分析

將所有樣本的每個SNP位點的基因型以AA、BB和AB等形式輸入Popgen 1.32軟件中分析[7]。利用該軟件計算不同個體在各SNP位點上的基因頻率、平均有效等位基因數(Ne)、平均雜合度(Ha)及香隆信息指數等群體遺傳參數；利用PIC_CALC軟件計算各位點的多態性信息含量(PIC)。

2 結果

2.1 MALDI-TOF-MS檢測

采用MALDI-TOF-MS技術對3個小鼠封閉群共90個樣本進行45個位點的單核苷酸多態性等位基因分型，并計算了每個SNP位點在3個群體中的等位基因頻率(表1)。從表中可以看出，大多數SNP位點(27個)在3個群體中的基因頻率有所不同，但是有6個SNP位點(rs8271367、rs29492976、rs13466915、rs3089109、rs3023342和rs3091048)在3個群體中均為單態，有相同的等位基因型；有8個位點(rs29778277、rs32390670、rs3089984、rs3023381、rs3091174、rs3023436、rs3023442和rs3089349)在2個ICR群體中均為純合而且單態，而在KM群中則存在兩種等位基因型；相反有3個位點(rs13476538、rs29315008和rs3089205)在KM小鼠群體中呈單態而在ICR中呈現多態；另有1個SNP位點(rs3089604)在ICR和KM群中的等位基因型完全不同。

2.2 群體遺傳結構分析

封閉群SKM小鼠在45個SNP位點中，15個位點表現為單態性位點，30個位點出現二等位基因型。該小鼠群體平均觀測等位基因數為1.673 9，平均有效等位基因數為1.376 9，平均雜合度為0.215 2，平均多態性信息含量為0.166 6。高度多態性位點(PIC>0.5) 有0個，中度多態性位點(0.25

而封閉群SICR小鼠在45個SNP位點中，20個位點表現為單態性位點，25個位點出現二等位基因型。該小鼠群體平均觀測等位基因數為1.555 6，平均有效等位基因數為1.220 9，平均雜合度為0.143 2，平均多態性信息含量為0.119 9。高度多態性位點(PIC>0.5) 有0個，中度多態性位點(0.25

表1 封閉群小鼠3個群體在45個SNP位點上的等位基因頻率

注：“*”標注為篩選的15個用于群體遺傳結構分析的位點；“#”標注為篩選的20個用于群體遺傳結構分析的位點

Note：“*”means 15 loci used for population genetic structure analysis；“#”means 20 loci used for population structure analysis

表2 封閉群SKM小鼠在45個SNP位點上的等位基因數、平均雜合度和多態性信息含量Table 2 Number of allele, average heterozygosity and polymorphism information content (PIC)of 45 SNP loci in SKM mice

注：Na：等位基因數；Ne：有效等位基因數；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；Ha：平均雜合度；SI：香隆指數；PIC：多態性信息含量

Note: Na:Number of allele; Ne:Number of effective allele; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; Ha: Average heterozygosity; SI: Shannon’s index; PIC: Polymorphism information content

而封閉群BICR小鼠在45個SNP位點中，22個位點表現為單態性位點，23個位點出現二等位基因型。該小鼠群體平均觀測等位基因數為1.5111，平均有效等位基因數為1.2851，平均雜合度為0.1699，平均多態性信息含量為0.1375。高度多態性位點(PIC>0.5)有0個，中度多態性位點(0.25

2.3 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

利用Popgen1.32，計算SKM小鼠45個SNP位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的P值。結果有2個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，25個位點在群體遺傳中處于Hardy-Weinberg遺傳平衡，各位點的P值見表2中所示。同樣計算SICR、BICR中Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的P值。顯示分別有0和1個位點顯著偏離Hardy-Weinberg遺傳平衡，11和17個位點在群體遺傳中處于Hardy-Weinberg遺傳平衡。

2.4 SNP位點與微衛星DNA和生化位點方法的比較

我們將SNP位點的檢測結果與前期STR和生化位點檢測同一群體的結果進行了比較，結果發現(表3)，無論是SNP還是STR位點進行群體遺傳檢測，用雜合度來評價三個群體的遺傳多樣性時，趨勢相同，均為SKM >BICR >SICR；而如果以香隆信息指數(SI)來評價時，SNP的檢測結果與雜合度評價的趨勢相同，但STR的結果卻不同，變為BICR >SICR >SKM。我們進行基因頻率排序并去除在群體中單態的SNP 位點，即用基因頻率相對高的20和15個SNP位點計算群體遺傳參數時，各遺傳參數的絕對值有所上升，尤其是SI值與STR的檢測結果更趨接近(表3)。在對群體的雜合性和均一性評價時，仍然是SKM群體的多樣性(He)和均一性(SI)均為最好。

表3 同一群體分別用SNP、STR和生化位點檢測的遺傳參數比較

注：Na：等位基因數；Ne：有效等位基因數；Ho：觀測雜合度；He：期望雜合度；Ha：平均雜合度；SI：香隆信息指數；PIC：多態性信息含量

Note: Na: Number of allele; Ne: Number of effective allele; Ho: Observed heterozygosity; He: Expected heterozygosity; Ha: Average heterozygosity; SI: Shannon’s index; PIC: Polymorphism information content

3 討論

昆明小鼠(KM)和ICR小鼠，廣泛應用于藥物實驗、生物制品及化妝品的鑒定、評價和篩選實驗中，是我國應用最廣泛的封閉群小鼠[8]。為了保證實驗數據的重復性和可靠性，需要定期對KM和ICR小鼠乃至所有封閉群實驗動物實施遺傳質量檢測[9]，來監測其遺傳穩定性[10]。單核苷酸多態性作為第三代遺傳標記物在小鼠近交系遺傳研究中已經得到應用，國內有多位研究者采用SNP對常用近交系小鼠的遺傳質量狀況進行了分析，表明SNP可用于小鼠遺傳質量檢測[3, 11-12]。MALDI-TOF質譜技術具有分析速度快、準確、分辨率高、自動化、靈敏等特點，已經成為快速、準確檢測蛋白質和核酸分子的技術，是一種理想的SNP檢測方法。因此本研究選取45個SNP位點，運用MALDI-TOF質譜技術對來自上海、北京的3個封閉群小鼠遺傳狀況分析，來探索SNP在封閉群小鼠遺傳質量狀況分析中的應用。

本研究選取位于小鼠1～20號染色體上的45個SNP位點，保證標記物對基因組的代表性及研究結果的可靠性。從我們的結果可知(表1)，在3個群體中45個位點的基因頻率顯示，僅在KM小鼠群體中呈單態的位點有3個，相反僅在ICR小鼠群體中呈單態的位點有8個，此外，雖然rs3089604位點在ICR和KM群體都呈現單態，但基因型則完全不同。所以我們認為可以參考以上位點在兩種群體中的等位基因頻率的不同對ICR和KM小鼠群體進行辨別，即這些位點有可能作為ICR和KM兩個品系的鑒定依據，這對于同為白色小鼠的KM和ICR非常有意義。

有效等位基因數和期望雜合度是反映群體遺傳變異大小的指標。但由于SNP是二等位基因型，所以其有效等位基因數偏低，但也在一定程度上反映群體中等位基因的分布情況。本實驗中3個封閉群中平均觀測等位基因數分別為SKM 1.6739、SICR 1.5556和BICR 1.5111，群體觀測等位基因數與有效等位基因數有偏差，說明所檢測的SNP位點的等位基因在群體基因組中的分布還不夠均勻[7]。有多個遺傳標準認為一個較好的封閉群其平均雜合度在0.5～0.7之間，而本實驗中SKM、SICR和BICR小鼠群體平均雜合度絕對數值偏低，用15個SNP計算后雖然數值有所升高，也遠遠達不到0.5。究其原因一方面可能是我們選的部分位點在兩個封閉群中為單態；另一方面也可能是由于遺傳標記本身的性質決定，STR本身就是多等位基因的，有時候一個位點的等位基因數能達到十幾甚至幾十個[13]，而SNP只有兩個等位基因，這說明用不同的遺傳標記檢測封閉群時可能不應以雜合度的絕對值作為其雜合性和多樣性的判定標準。盡管如此，進行3個群體平均雜合度比較時，SNP位點的檢測結果與STR的檢測結果趨勢一致，即SKM>BICR>SICR，從等位基因數和平均雜合度角度可以認為SKM小鼠的遺傳多樣性高于北京和上海的ICR小鼠群體。但是我們發現，用香隆信息指數(SI)來評價時，SNP的檢測結果與等位基因數和平均雜合度判斷的趨勢相同，而STR的結果卻不盡相同。我們知道，SI代表了等位基因在群體內個體分配的均勻性，這可能說明所選SNP和STR位點在KM和ICR兩個群體中的均勻性不同。

總之，本研究表明在封閉群小鼠遺傳狀況的分析中，SNP可以作為一項遺傳標記來反應其遺傳狀況，而且有些SNP位點可能具有進行封閉群小鼠品系鑒定的潛在應用前景。另外本研究所選的位點中有部分位點屬于單態性，在群體遺傳中可以適當舍棄，有必要開發更多的SNP位點及群體分析擴展SNP在小鼠封閉群中的應用前景。