補骨脂對維甲酸誘導的大鼠骨質疏松的治療

劉 穎 袁曉美 畢亞男 高玉娜 周 昆 李云章

(1.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018)(2. 天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津市中藥藥理重點實驗室，天津 300100)

中藥補骨脂為豆科植物補骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實，始載于《開寶本草》，又名破故紙。性溫，味辛、苦。中醫常用于治療腎陽不足，陽痿遺精，遺尿尿頻，腰膝冷痛，腎虛作喘，五更泄瀉；外用治白癜風，斑禿?，F代研究表明補骨脂有擴張冠脈、增加冠脈血流量、抗腫瘤、保肝、抗早孕、雌激素樣、抗骨質疏松、抗前列腺增生、平喘、提高免疫力等作用[1]。補骨脂主要含香豆素類(主要為呋喃香豆素類，如補骨脂素psoralen和異補骨脂素isopsoralen等)；擬雌內酯類(如補骨脂定psoralidin等)；黃酮類(主要有補骨脂甲素corylifolin、補骨脂乙素corylifolinin、補骨脂異黃酮corylin、補骨脂查耳酮bavachalcone等)；酚萜類(如補骨脂酚bakuchiol)化合物等，其中多個成分具有雌激素樣作用[2]。研究表明植物雌激素有著和天然雌激素相似的抗骨質疏松癥作用，且少有雌激素樣副作用的發生。體外研究提示補骨脂中多個成分可能有抗骨質疏松作用[3]，且體內研究已經證實作為補骨脂重要成分的補骨脂素和異補骨脂素對小鼠骨質疏松有較好的治療作用[4]。

補骨脂常用方式為水煎，脂溶性的補骨脂酚等成分水煎基本不能提取出來，而水煎后剩余部分是否同樣具有抗骨質疏松作用尚未有研究證實。為此，本實驗采用維甲酸致骨質疏松模型，觀察補骨脂生藥、水提物及藥渣對維甲酸致骨質疏松大鼠的影響，探討藥渣對大鼠骨質疏松的療效，為補骨脂的合理應用提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，60只，雌雄各半，體質量190～210 g，SPF級，購自北京華阜康生物科技有限公司，合格證號：SCXK(京)2009-0004。動物飼養于天津中醫藥大學實驗動物中心，飼養溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自然光照。所用飼料為天津市華榮實驗動物科技有限公司生產全價顆粒飼料,許可證號：SCXK(津)2012-0001，飲用凈化自來水。

1.2 受試藥物

補骨脂生藥，由深圳華潤三九醫藥股份有限公司提供。補骨脂水提物，批號20120920，4.78 g生藥/g粉；補骨脂藥渣，批號20120920，1.33 g生藥/g粉；均為天津中醫藥大學中醫藥研究院王躍飛副研究員團隊制備提供。

1.3 試劑

維甲酸，戊巴比妥鈉(北京索萊寶科技有限公司)；堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(北京中生北控)；酸性磷酸酶(ACP)檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；乙醇，甲醛(天津市康科德科技有限公司)。

1.4 儀器

VivaCT40骨密度儀(瑞士，SCANCO Medical AG)；7020全自動生化儀(日本，Hitachi)；InfiniteM200多功能讀板儀(瑞士，TECAN)；AE200S電子分析天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；JJ2000精密電子天平(常熟雙杰測試儀器廠)；Micro 17 R高速離心機(美國，Thermo)；LDZ5-2型離心機(北京醫用離心機廠)。

1.5 方法

1.5.1分組及給藥：60只Wistar大鼠適應性飼養7 d，隨機分為對照組、模型組、補骨脂生藥組(0.9 g生藥/kg)、補骨脂水提物組(0.9 g生藥/kg)、補骨脂藥渣組(0.9 g生藥/kg)5個組，每組12只。除對照組外，其余各組灌胃給予維甲酸70 mg/kg，連續14 d。造模后，大鼠依各組別劑量，按1 mL/100 g體質量灌胃給藥，連續給藥8周，對照組及模型組給予相應體積的飲用水。

1.5.2實驗數據采集：動物用戊巴比妥鈉麻醉后，腹主動脈取血并離心得血清，用全自動生化儀檢測堿性磷酸酶(ALP)，酸性磷酸酶(ACP)按試劑盒說明書進行檢測。取大鼠脛骨，用75%乙醇浸泡，每天換液，連續3 d，隨后置無水乙醇中長期保存。使用VivaCT 40骨密度儀進行脛骨CT掃描，進行骨密度分析。主要檢測指標為骨密度(of BV)、骨連接度(Conn.D)、骨小梁數量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.6 統計方法

2 結果

給藥8周后，補骨脂生藥組，水提組，藥渣組的ACP與模型組相比均有明顯下降，有統計學意義。其中補骨脂藥渣組下降程度>生藥組>水提物組；比較ALP/ACP值，藥渣組>生藥組>水提物組>模型/對照組(見表1)。

表1 補骨脂給藥8周各組血清中ACP和ALP含量Table 1 Serumindexes of rats of each groupafter8 weeks’ administration

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

用VivaCT 40骨密度儀對大鼠脛骨進行骨CT掃描，各給藥組與模型組相比，生藥組、水提物組和藥渣組的骨密度要高于模型組，其中藥渣組具有顯著性；各給藥組的骨連接度和骨小梁數均顯著高于模型組，而骨分離度均顯著低于模型組，有統計學意義(見表2,圖1)。給藥后各組指標與對照組均無統計學差異。

表2 補骨脂給藥8周各組大鼠脛骨CT指標Table 2 CT indexes of rat tibia after 8weeks’ administration

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01

表2 (續)補骨脂給藥8周各組大鼠脛骨CT指標Table 2 (Continued) CT indexes of rat tibia after 8weeks’administration

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01

Note: Compared with model group，*P<0.05，**P<0.01

圖1 各組大鼠脛骨CT圖像Fig.1 3D spiral CT images of rat tibia

3 討論

骨質疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征，致使骨的脆性增加以致易于發生骨折的一種全身性的骨骼疾病[4]。維甲酸是維生素A的衍生物，可影響骨的生長、發育和代謝。維甲酸在用于腫瘤或銀屑病等治療當中，常引發骨痛、骨質疏松等不良反應。有文獻報道，維甲酸可促進成骨細胞的增值和分化，又可增加破骨細胞的骨吸收，造成高轉化型的骨質疏松，但總趨勢是骨吸收大于骨形成[5]。且大鼠灌胃給予維甲酸來引導建立模型，與去卵巢法相比，操作簡單，成模時間短，因此被許多研究者采用。本實驗中選用成年大鼠，灌胃給予維甲酸70 mg/kg，連續14 d建立骨質疏松模型，且未出現其他文獻提到的高死亡率現象[6]。從脛骨CT重建圖像上看，維甲酸誘導的病變并不是典型的骨質疏松狀態，其對軟骨組織的破壞更加明顯，與劉和娣等[7]研究結果相符。

預實驗中我們用活體進行掃描，希望在實驗過程中根據掃描結果決定是否繼續給藥，節約動物資源的同時還可以減少實驗中的誤差，保證同批大鼠實驗的準確性。但活體掃描后大鼠死亡率達到3/4以上，解剖可見明顯的臟器損壞，可能與射線下暴露時間過長(掃描時間30 min)有關，故本實驗中采用離體CT掃描方法。

補骨脂不同工藝給藥治療，主要關注補骨脂藥渣對維甲酸骨質疏松模型的治療作用，根據大鼠血清生化指標及脛骨骨CT掃描結果，補骨脂藥渣組的骨密度、骨小梁數和骨連接度均明顯高于模型組，骨分離度明顯低于模型組，血清酸性磷酸酶比模型組顯著降低，且具有統計學意義。顯示補骨脂藥渣對維甲酸誘導的骨質疏松模型的大鼠有治療作用，且治療效果顯著。中藥絕大多數來源于植物，其藥渣中含有粗纖維、粗蛋白、粗脂肪以及多種微量元素等。近年來，中藥藥渣主要從以下幾個方面進行再利用：再提取其他有效成分、用于栽培食用菌、用作飼料或飼料添加劑、制成有機肥料、處理廢水、用作生物質能源、用作造紙原料、用于發酵生產等[8]。本研究證明了補骨脂藥渣對維甲酸造成的大鼠骨質疏松有一定療效，為藥材的充分利用及開發制藥新工藝提供了理論依據。

自2005年韓國報道44歲婦女因以補骨脂泡茶飲用而導致急性膽汁淤積性肝損害[9]，近年來補骨脂的肝毒性成為研究熱點。前期研究發現，補骨脂水提物及其主要成分補骨脂素和異補骨脂素有肝毒性[10-11]，而本研究提示補骨脂藥渣同樣有良好藥效，如果其肝毒性較低，那么補骨脂水提取后的藥渣將成為一個新的可用部分。因此，補骨脂水提取后的藥渣的安全性考察將成為進一步研究的方向。