蒙古馬長期高負荷運動訓練前后肌肉發育關鍵基因的表達研究

白東義, 蘇日嘎，芒 來*,烏伊罕，趙一萍，李 蓓，格日樂其木格，張心壯,陶克濤,趙若陽,圖挌琴,青 柏,旭仁其木格

(1.內蒙古農業大學動物科學學院，內蒙古自治區馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，內蒙古農業大學馬屬動物研究中心，呼和浩特 010018； 2.內蒙古自治區綜合疾病預防控制中心，呼和浩特010030)

肌鈣蛋白(troponin,Tn)是橫紋肌上的結構蛋白，位于肌原纖維的細絲中[1]，同時也是與心肌和骨骼肌收縮相關的調節蛋白。肌鈣蛋白主要由肌鈣蛋白C(troponin C，TnC)、肌鈣蛋白I(troponin I，TnI)和肌鈣蛋白T(troponin T，TnT)3種不同的亞型組成。其中肌鈣蛋白C(Tnc)是肌鈣蛋白的鈣離子結合組分[2]。研究表明，肌鈣蛋白C對應有兩種蛋白異構型，即慢肌和心肌肌鈣蛋白C(cardiac and slow skeletal troponin C, cTnC)和快肌肌鈣蛋白[3]。兩種肌鈣蛋白異構型由兩種不同的基因編碼，其中，cTnC是由TNNC1基因編碼，可以在骨骼肌和心肌中特定表達；快肌肌鈣蛋白C是由TNNC2基因編碼，能在骨骼肌中進行表達[4]。在脊椎動物中兩種亞型的肌鈣蛋白的區別在于：TNNC2被鈣離子激活于N-末端的低親和力鈣離子結合位點I和II，而TNNC1僅結合在低親和力的鈣離子結合位點II[5]。

肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2，MYL-2)是肌球蛋白輕鏈家族中的一員，為調節性輕鏈，對肌纖維的活性有調控作用[6]，進而影響肌球蛋白重鏈上ATP 酶的活性，使肌纖維的類型發生轉化[7-8]，影響肌肉的生長。研究者們對該基因及其蛋白的表達研究主要集中在心肌組織中。研究發現，MYL-2的突變和過量表達可導致人的心肌增生[9-10]，慢性心臟病患者的MYL-2表達量顯著低于正常人，而嚴重心臟病患者該基因的表達量顯著低于慢性心臟病患者[11]。成年人心肌中MYL-2 的磷酸化可引起心肌擴張[12]，并與心肌扭曲等多種心臟疾病有關[13]。從而認為該基因主要對心肌細胞的正常維系有重要作用。另有研究發現，MYL-2基因在成熟的小鼠骨骼肌中表達，而在體外培養的C2C12 成肌細胞分化過程中不表達[14-15]。將小鼠心肌和骨骼肌中該基因敲除后，小鼠在胚胎期或初生期的生長出現嚴重異常，甚至有致命性的表現[16-17]。MYL-2在小鼠II 型肌纖維完整性的維持、細胞結構、細胞粘著、細胞遷移和分裂過程中起著重要作用[18]。因此認為，MYL-2 可能在哺乳動物心肌和骨骼肌的生長和發育過程中發揮重要的功能。

顯然TNCC1和MYL-2基因在慢肌和心肌的發育中起到了關鍵作用。馬作為運動性較強的動物，肌肉的發育尤為關鍵，尤其蒙古馬作為耐力性能較強的馬種,慢肌的作用顯得更為重要。但到目前為止，對以上兩種基因的研究主要集中在人和小鼠中，在家畜上的研究非常少，尤其在馬上還未見報道。

經過長期的自然選擇和人工選育，賦予了馬很多運動潛質，在全球700多個馬種[19]中即有速度型馬種也有耐力型馬種。蒙古馬毋庸置疑是世界上長距離連續奔跑耐力最強的馬種[20]，這種特質可能是在13世紀行軍打仗、長途跋涉過程中形成的。雖然具有較好的遺傳潛質，但蒙古馬在賽前還是需要合理的訓練才能取得優異的成績。說明訓練對蒙古馬耐力的形成有重要的作用。近些年運動馬的研究多集中于純血馬[21]。對馬匹速度的形成和相關基因的調控機制已越來越清晰。但對馬匹耐力形成的分子機制知之甚少，只見在阿拉伯馬上有相關的研究[22]。尤其對蒙古馬超強耐力特性形成的分子機制的研究更不多見。本實驗室前期進行了蒙古馬高負荷運動訓練前后的轉錄組差異表達分析[23]。本試驗試圖通過蒙古馬長期高負荷運動訓練模擬耐力訓練，比較運動前后與肌肉發育相關的基因在不同水平上的表達變化。試圖為今后馬的耐力訓練提供科學的參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試劑耗材： TRIzol試劑、RNA反轉錄試劑盒(TaKaRa)、SYBR Premix Ex TaqⅡ定量試劑盒(TaKaRa)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(Cwbiotech公司)、兔多克隆GAPDH抗體(Abcam)、兔單克隆MYL-2抗體(Abcam)、兔多克隆TNNC1抗體(Abcam)、羊抗兔IgG-HRP(Jackson公司)、羊抗鼠IgG-HRP(Jackson公司)。

儀器設備：實時熒光定量PCR 儀(Agilent Technologies Stratagene Mx3000P)、酶標儀(Thermo NANODROP 2000c)、WB轉膜儀(J-MAX，ST-2)。

1.2 馬匹訓練與肌肉樣品采集

選擇3匹5歲雌性蒙古馬作為試驗動物，在長期高負荷運動訓練前，將馬匹保定并注射局部麻醉劑，從臀中肌采取試驗所需肌肉樣品(30 g)，肌肉組織離體后，迅速用蒸餾水反復沖洗并剪成黃豆顆粒大小的塊狀，立即放入液氮預冷的無RNase Ep-pendorf管中。投入液氮冷凍，帶回實驗室后轉移至-80 ℃冰箱中保存，用于后續試驗。

待休息1周后開始為期4 個月的高負荷運動訓練，試驗用馬的運動在一個直徑為30 m，周長約100 m 的圓形調教圈中進行。為避免高負荷運動訓練對馬造成損傷，運動方案將4個月按照天數分為3個階段，每階段又分為若干周期，循序漸進地加強運動強度，讓馬慢慢適應逐漸增強的負荷。

第一階段(第1～15天)：該階段持續15 d，每5 d為1個周期，起始運動距離為8 km，每個周期中前4 d 每日運動距離以2 km遞增，即第二天10 km，第三天12 km，第四天14 km，第五天休息，下一周期起始距離回到8 km，如此循環。將奔跑速度控制在20 s每圈，即大約每100 m用時20 s。此階段內主要目的是進行體能適應性強度運動，使肌腱、韌帶和骨骼得到強化，幫助馬匹適應后面高強度運動時的壓力。

第二階段(第16～108天)：該階段持續92 d，也是高負荷運動訓練方案的主體部分。每4 d為1個周期，起始距離為15 km，每個周期中前3 d每日運動距離以5 km遞增，即第二天20 km，第三天25 km，第四天休息。如此循環，將速度控制在18～20 s每圈，即每100米用時18～20 s。此階段運動程序是為了使肌肉有氧適應性最大化，距離逐步增加，并及時下降回歸，讓訓練馬匹得到休息。使肌肉、心和肺等器官能夠適應遞增的高強度運動。

第三階段(第109～122天)：在運動期最后的兩周里，要盡可能延長運動時間和距離，運動起始距離為20 km，每日以10 km遞增，即第二天30 km，第三天40 km，第四天50 km，第五、六天休息，同時提高日糧中精飼料比例。將速度控制在15 s左右每圈，即每100 m用時15 s。

該階段結束后，靜養3 d，在清晨空腹安靜狀態下將馬匹保定，注射局部麻醉劑，從臀中肌采取試驗所需肌肉樣品30 g，方法同“1.2”。

1.3 試驗步驟與方法

1.3.1 RNA提取 提取每匹馬長期高負荷運動訓練前后骨骼肌總RNA，步驟按常規TRIzol提取法完成。

1.3.2 將提取的總RNA反轉錄合成cDNA 首先去除基因組DNA，在冰上將反應混合液(5×gDNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，總RNA 10 μL，用RNase Free dH2O補至20 μL)混勻，然后42 ℃反應2 min，4℃保存。其次進行反轉錄反應，在冰上配制反應混合液(去除基因組DNA混合液10 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 1 μL，RT Primer Mix 1 μL，5×PrimeScript Buffer 2 4 μL，RNase Free dH2O 4 μL)，輕柔混勻后立即進行反轉錄反應：37 ℃反應15 min；85℃反應5 s；溫度降到4 ℃終止反應，-80 ℃保存。

1.3.3 PCR引物設計 以GAPDH為內參基因，MYL-2和TNNC1為目的基因，用Primer Premier 3.0軟件設計引物，并且通過NCBI 中的Blsat功能檢測各引物的特異性。并由上海生物工程有限公司合成(引物序列見表1)。

1.3.4 實時熒光定量PCR分析 實時熒光定量 PCR反應在Agilent Technologies Stratagene Mx3000P實時熒光定量PCR 儀上完成。具體方法參照 SYBR?Rremix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)試劑盒流程進行。擴增體系(20 μL)：SYBR?Rremix ExTaqTMⅡ(Perfect Real Time)10 μL，PCR Forward Primer(20 μmol·L-1)0.8 μL，PCR Reverse Primer(20 μmol·L-1)0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ0.4 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6 μL。反應條件:反應40個循環(95 ℃ 變性1 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸5 min。

1.3.5 Western blot分析 首先按常規方法提取每匹馬在長期高負荷運動訓練前后骨骼肌中總蛋白。采用BCA法對提取的蛋白濃度進行測定。然后通過蛋白變性、凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、成像及灰度分析一系列步驟對目的蛋白的表達量進行定量。

1.3.6 數據處理和分析 本研究以GAPDH基因為內參基因，采用2-△△Ct定量分析方法對運動訓練前后蒙古馬骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因的表達量進行比較分析，目的基因的相對表達量=2-△△Ct；△Ct=(運動前目的基因的Ct 值-運動前GAPDH的Ct 值)；△Ct=(運動后目的基因的Ct 值-運動后GAPDH的Ct 值)。試驗進行3個重復，從而減少外界以及人為操作因素對試驗的影響。將得到的數據采用SAS9.0 軟件進行單因素方差分析和顯著性檢驗。

2 結 果

2.1 蒙古馬肌肉樣品總RNA的質量檢測

將提取的總RNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。結果顯示，28S 和 18S 條帶清晰，亮度較好(圖略)，表明RNA完整性較好。采用酶標儀分別測定提取的RNA在260 nm和280 nm 光密度下的純度和濃度。檢測結果顯示，樣品總RNA的OD260 nm/OD280 nm值均為1.8～2.0，說明提取的RNA 樣品純度較好。結合檢測結果判定，提取的總RNA可以用于后續試驗。

2.2 蒙古馬肌肉樣品BCA法蛋白定量結果

提取的蒙古馬肌肉樣品的蛋白濃度為3.5～6.1 μg·μL-1，定量標準曲線線性回歸方程公式為y=0.997 8x+0.121 7，R2=0.989 8(y為蛋白濃度，x為OD值，R為相關系數)。標準曲線(圖1)比較理想，預示測定的蛋白濃度數據可信，可用于后續的試驗。

2.3 運動訓練前后蒙古馬肌肉組織中MYL-2和TNNC1基因在mRNA水平的表達量

本試驗以GAPDH基因作為內參基因，采用2-△△Ct定量分析法對MYL-2和TNNC1基因在長期高負荷運動訓練前后蒙古馬骨骼肌中的表達量進行分析。試驗結果顯示，經長期高負荷運動訓練后蒙古馬骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因的表達量極顯著高于訓練前(P<0.01)。說明運動訓練對該基因的表達量有明顯的促進作用，從而對蒙古馬的運動性能產生影響，結果如圖2所示。

**表示差異極顯著(P<0.01)。圖3同** represent the extremely significant difference(P<0.01).The same as Figure3圖2 運動訓練前后蒙古馬骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因mRNA相對表達量Fig.2 Relative expression quantity of MYL-2 and TNNC1 genes in Mongolian horses skeletal muscle before and after high loading exercise

2.4 蒙古馬高負荷運動訓練前后MYL-2和TNNC1基因在翻譯水平的表達

本試驗以GAPDH為內參，采用Western blot技術對蒙古馬高負荷運動訓練前后骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因在翻譯水平的表達進行檢測。圖3a顯示，在蒙古馬長期高負荷運動訓練前后的肌肉組織中MYL-2和TNNC1蛋白均有表達，但在高負荷運動訓練前后表達水平不同。使用Gel Image ststem ver.4.00 軟件對圖像進行灰度分析，結果顯示(圖3b)，MYL-2和TNNC1蛋白在高負荷運動訓練后在蛋白水平的表達量均高于高負荷運動訓練前，且MYL-2蛋白在高負荷運動訓練后的蛋白表達量較高負荷運動訓練前有了極顯著的增加(P<0.01)，而TNNC1蛋白在高負荷運動訓練后蛋白表達量的增加相比高負荷運動訓練前并未達到顯著水平(P>0.05)。

a.Western blot檢測MYL-2 和TNNC1的蛋白表達：1前和1后為一號馬運動前后肌肉樣品；2前和2后為二號馬運動前后肌肉樣品；3前和3后為三號馬運動前后肌肉樣品。b.MYL-2 和TNNC1蛋白表達的灰度分析a.The expression of MYL-2 and TNNC1 proteins detected by Western blot: The number represent the sample number before and after exercise. b.The gray value analysis of MYL-2 and TNNC1 proteins expression圖3 蒙古馬高負荷運動訓練前后骨骼肌中MYL-2 和TNNC1的蛋白表達Fig.3 Expression of MYL-2 and TNNC1 proteins in skeletal muscle before and after high loading exercise in Mongolia horses

3 討 論

本試驗首先對蒙古馬長期高負荷運動前后肌肉發育相關基因進行了轉錄水平的表達差異性分析。結果顯示，經過高負荷運動后蒙古馬肌肉組織中TNNC1和MYL-2基因的表達量發生上調，極顯著高于高負荷運動前(P<0.01)。其次，為了進一步研究高負荷運動對蒙古馬肌肉發育相關基因在mRNA水平和蛋白質水平上的表達是否一致，采用免疫印跡方法對這兩個基因進行了檢測。結果顯示，在高負荷運動后MYL-2和TNNC1在蛋白水平的表達量均高于高負荷運動前，且MYL-2在高負荷運動后的表達量較高負荷運動前有了明顯的上調，差異極顯著(P<0.01)，這與本試驗的熒光定量結果完全一致。而TNNC1在高負荷運動后蛋白表達量相比高負荷運動前也有一定的上調趨勢，但未達到顯著水平(P>0.05)，這與本試驗熒光定量的結果趨勢一樣。

在其他研究中，通過對100頭豬肉樣品及肉質性狀的數據處理，發現基因TNNC1與豬肉的肉質性狀密切相關。隨后進一步驗證了TNNC1基因在豬背最長肌中的表達量與肉質性狀的相關性，發現TNNC1基因的表達量與滴水損失、pH24 h、肉色等肉質性狀相關[24]。對山羊的TNNC1基因研究發現，該基因在非肌肉組織中，如肝和腦，其表達量很低，甚至沒有表達。因而，無論是在非肌肉組織中沒有表達或是表達量極低，都印證TNNC1基因表達的獨特性，即在心中和慢肌纖維含量高的肌肉中高表達，而在其他組織中都是低表達甚至是不表達。此外，TNNC1及MyHC基因以及肌纖維類型之間存在著緊密的共表達規律[25]。研究證明，體外培養成肌細胞時，在成肌細胞呈指數增長的時候，綠頭鴨TNNC1基因的表達量相對減少，而在肌纖維形成和成熟時，該基因的表達量較高[26]。在細胞增長的快速階段主要是Desmin基因表達，但在營養耗盡，或是說在細胞增長的平臺期，主要表達Mckand和TNNC1基因。因而TNNC1基因與肌肉生長有一定的關系[27-28]。趙啟南等[29]通過對訓練前后蒙古馬肌肉轉錄組的測定也發現，TNNC1基因為高表達基因。熒光定量PCR分析表明，天府肉羊TNNC1基因在心肌、慢骨骼肌(比目魚肌)高表達，極顯著高于在快肌骨骼肌和其他內臟組織中的表達[30]。研究顯示，TnC與TnT、TnI結合成肌鈣蛋白復合物(Tn),肌鈣蛋白復合物 (Tn) 再與原肌球蛋白(Tm) 一起構成 Tm-Tn 復合體，調節肌肉收縮與舒張的力量和速度。Tm-Tn 復合體位于橫紋肌的細肌絲和心肌細胞的細肌絲上。Tm-Tn 復合體對肌肉收縮的調節作用需要在Ca2 +的誘導下進行。鈣從肌質網 (sarcoplasmic reticulum) 釋放出來，與肌鈣蛋白結合而使其結構發生改變，于是被抑制的肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，致使肌肉發生收縮。如果鈣被去除，肌鈣蛋白恢復原來狀態，肌肉便發生松弛，這就是肌肉收縮的一個循環過程[14, 31-36]。

而本研究發現，在蒙古馬長期高負荷運動前后的臀中肌中TNNC1基因均有所表達。并且通過為期4個月的高負荷運動后表達量明顯提高，呈現了極顯著差異(P<0.01)。由此可推斷，通過高負荷運動可能促進了蒙古馬肌肉的有效發育，甚至改變了快肌和慢肌的比例，從而有效提高蒙古馬骨骼肌中TNNC1基因的表達量。TNNC1基因雖在蒙古馬高負荷運動前后mRNA水平上有顯著差異，但在蛋白水平上的結果為差異不顯著(P>0.05)，總結原因為兩方面：一方面可能與蛋白表達的延滯性有關；另一方面，基因的表達是DNA-RNA-蛋白，期間有轉錄水平的調控、轉錄后的調控以及翻譯后調控等多種調控機制影響著該基因的表達，也有可能在mRNA到蛋白的翻譯過程中由于非編碼RNA等的相應調控作用導致在蛋白水平上的表達不顯著。

吳華俊等[37]的研究結果顯示，在松墨天牛成蟲身體的各個部位中MYL-2表達量不盡相同，其中松墨天牛成蟲足部MYL-2的表達量最高，這是由于足部是動物運動的主要器官，因此足部富含肌肉蛋白。頭部、觸角和胸部MYL-2的表達量次之，這與動物在覓食和求偶等活動中離不開運動有密切相關。而在腹部MYL-2的表達量極低，這正是因為腹部為松墨天牛成蟲的整體部分，不參與運動功能，因此MYL-2表達量低。近年來發現，MYL-2 可能在肌肉肥大過程中執行作用。經檢測，MYL-2 在成熟肌肉中表達，而在培養的鼠 C2C12成肌細胞分化過程中不表達[38-39]。在鼠非肌肉成纖維細胞中，MYL-2 對 II 型肌纖維完整性的維持起著重要的作用，進而對細胞的結構、細胞粘著、遷移和分裂起著關鍵的作用[18]。說明MYL-2對 II 型肌纖維的活性有調節作用。同樣地，將小鼠的心肌和骨骼肌中該基因敲除后，發現小鼠在胚胎期或初生期出現嚴重的反常，甚至有致命性的表現[14]。

本試驗中，長期高負荷運動后蒙古馬臀中肌中MYL-2基因及其蛋白水平的表達都有顯著的提高，這與先前的研究基本一致，運動增強的肌肉中該基因表達量明顯增高。因此，高負荷運動能夠有效提高蒙古馬肌肉組織中MYL-2基因的表達量，從而促進肌肉的發育，提高其耐力性能。

4 結 論

本研究結果表明，MYL-2和TNNC1基因與蒙古馬的耐力性能存在著密切的關系，更全面地了解到先前篩選的與肌肉結構發育相關的基因在蒙古馬長期高負荷運動前后的變化及調控。為下一步對蒙古馬進行系統的訓練和探討耐力基因的作用機理奠定了基礎。