玉山黑豬兩種頭型遺傳機制的初步解析

王成斌，王小鵬，鄭小明，陳 浩，張俊杰，郭源梅，丁能水*

(1.江西農業大學省部共建豬遺傳改良與養殖技術國家重點實驗室，南昌 330045；2.國家級玉江豬(玉山黑豬)保種場，玉山 334700)

豬是繼狗和羊之后第三個被人類馴養的家畜[1]。經過長時間的人工選擇和自然選擇，家豬形成了豐富的品種和多樣化的體型外貌特征。玉山黑豬是江西省第一個被列入國家級畜禽遺傳資源保護名錄的地方豬種，具有早熟易肥，肉質細嫩、鮮美等特點，其全身被毛黑色。玉山黑豬的頭型有兩類：“獅子頭”型和“馬臉”型?！蔼{子頭”型頭大，額寬，且有較深的皺紋；嘴筒短略上翹，軀干背腰不平；腹下垂，體短，體型較小，體質較疏松?！榜R臉”型頭中等大，軀干背腰平直，體長[2]。迄今為止，導致這兩種頭型的遺傳機制尚未被解析。深入揭示玉山黑豬不同頭型的形成機制對玉山黑豬種質特性形成機理研究、品種多樣性的保護及利用具有重要的指導意義。

在人工選擇的過程中，對目標基因的定向選擇會導致種群的某一性狀發生改變。目的基因優勢等位基因頻率在選擇的作用下會不斷提高，其附近與之緊密連鎖的等位基因頻率將伴隨其一同升高，此現象稱為選擇性清除(selective sweep)。因此，受到選擇的基因組區域會表現出選擇性清除信號，如連鎖不平衡值(linkage disequilibrium, LD)升高、核苷酸多態性(DNA polymorphism)下降等[3]。選擇和遺傳漂變都能導致遺傳分化和選擇信號的產生，表現為不同種群間等位基因頻率差異顯著。遺傳分化系數(Fst)是檢測群體遺傳分化程度的重要指標，由Wright[4]

提出，用于計算物種亞群之間的分化程度。

全基因組關聯分析(GWAS)自2005年首次報道應用于人視網膜黃斑變性遺傳機理研究以來，其在人類復雜疾病研究領域取得了迅速發展。研究人員通過GWAS發現了大量與疾病相關聯的遺傳變異。在家豬中，自2011年第一篇應用GWAS研究豬毛色的文章報道以來[5]，GWAS在家豬重要經濟性狀關聯基因的鑒別中同樣得到了廣泛應用[6-7]。

本研究嘗試利用豬全基因組60K SNP芯片數據，檢測玉山黑豬“獅子頭”和“馬臉”兩種頭型種群間的遺傳分化信號，并進行病例-對照的全基因組關聯分析，初步篩選與頭型相關的染色體關聯區域，并在這些區域內發現令人感興趣的候選基因，以期初步解析玉山黑豬形成不同頭型的分子機制，為深入研究玉山黑豬及中國地方豬種群體內不同頭型的形成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及表型測定

本研究選取國家級玉山黑豬保種場的36頭原種豬，其中“獅子頭”型豬12頭，“馬臉”型豬24頭(圖1)。在出生時測定初生重，斷奶時測定斷奶重，豬只180日齡時，測定其體重、體長、體高、背高、胸圍、胸深、腹圍、管圍、腿臀圍，并做好記錄。

a.馬臉型；b.獅子頭型a. Long-pointed head; b. Short head圖1 玉山黑豬不同頭型個體Fig.1 Different head types in Yushan Black pigs

1.2 DNA提取、60K SNP判型及質控

采集耳組織樣品，按常規的酚/氯仿法提取耳組織DNA，將其溶于TE緩沖液中，并統一稀釋至50 ng·μL-1，用ILLumina豬60K SNP芯片進行掃描分型。芯片分型工作委托北京怡美通德公司按照標準操作流程完成。用Plink軟件(Plink v1.07)對SNP進行質控，剔除個體檢出率<90%、最小等位基因頻率<0.05、極顯著偏離哈代溫伯格平衡(P<0.000 001)、染色體位置不確定的SNP位點和剔除SNP檢出率<90%的個體，最后剩余26 480個SNPs用于后續的統計分析[8]。

1.3 統計分析

1.3.1 玉山黑豬兩種頭型間表型差異性分析 用R語言(R v3.3.1)中的aov()函數對所記錄的11個性狀進行組間方差分析[9]。將性別、批次(年、季)和180日齡體重作為協變量，比較這些表型性狀在“獅子頭”型和“馬臉”型兩組間是否存在顯著差異。

1.3.2 玉山黑豬兩種頭型間遺傳分化系數(Fst)的計算 用R語言(R v3.3.1)中的Genepop軟件包計算“獅子頭”型和“馬臉”型兩類群體之間每個SNP位點的遺傳分化系數(Fst)值：

其中，MSG為群體內的觀測均方差：

MSP為群體間的觀測均方差：

nc是指校正后群體間的平均樣本大?。?/p>

1.3.3 玉山黑豬兩種頭型的全基因組關聯分析 采用病例-對照的全基因組關聯分析，應用GEMMA(genome-wide efficient mixed-model association)軟件[11]中的單變量線性混合模型(univariate linear mixed model)來比較全基因組上“獅子頭”型個體和“馬臉”型個體間等位基因及基因型頻率的差異，搜尋與目標性狀基因座處于連鎖不平衡的位點。為了消除群體分層對GWAS結果的影響，GEMMA將提前生成的一個分子親緣關系矩陣作為隨機效應帶入到模型中：

y=Wα+xβ+u+ε

式中，y為所有個體的表型值向量；W為協變量矩陣；α為包含截距的相應的系數向量；x為SNP的基因型向量；β為SNP的影響效應；u為隨機效應向量；ε為誤差向量。將表型對性別和批次(年、季)進行回歸分析，并用殘差作為新的表型用于上述分析[12]。

采用Bonferroni方法確定關聯顯著性閾值，基因組顯著水平閾值為0.05/N，N為有效SNP個數，即0.05/26 480=1.89E-06。通過與最高點SNP連鎖不平衡(LD)r2≥0.8的SNP位點確定置信區間。使用Haploview程序[13]生成單倍型及單倍型框。采用QQ-plot通過比較無效假設的分布與實際關聯性分布的差異來檢測是否具有群體層化效應。

1.3.4 玉山黑豬兩種頭型候選基因的鑒別參照SusscrofaBuild 10.2基因組注釋版本(http://www.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)，查找遺傳分化顯著區域和GWAS置信區間內的基因。利用GeneCards (http://www.genecards.org/) 數據庫查找這些基因的生物學功能。為避免遺漏基因，針對家豬基因組中尚未注釋的RefSeq基因，利用UCSC Genome Browser 數據庫(http：//genome.ucsc.edu/)選出在人和小鼠中注釋的同源基因。

2 結 果

2.1 玉山黑豬兩種頭型群體間表型差異分析

本研究統計分析了玉山黑豬“獅子頭”型和“馬臉”型兩個類群的11個表型性狀(表1)，發現“馬臉”型豬比“獅子頭”型豬的體長要長，體型要大，但差異未達到顯著水平(P>0.05)?！榜R臉”型豬的管圍顯著大于“獅子頭”型豬(P<0.05)。

2.2 玉山黑豬兩種頭型群體間遺傳分化信號的檢測

玉山黑豬兩種頭型的群體間總體上不存在明顯的遺傳分化，所得Fst值平均值為0.031(圖2)。Fst值最高的10個SNP涉及11個基因(表2)。遺傳分化最顯著的選擇信號位于10號染色體上，Fst值最大的SNP位點CASI0009931位于SSC10的11.36 Mb處(圖3a)。

藍線代表Fst的平均值The blue line indicates the average Fst value圖2 所有SNP位點遺傳分化系數(Fst)值的密度分布Fig.2 Distribution of genetic differentiation coefficient (Fst) values of all the SNPs

a.全基因組SNP的Fst值分布圖；b. GWAS曼哈頓圖：圖中虛線代表5%基因組顯著水平閾值a. Distribution of Fst values of all qualified SNPs across the genome; b. Manhattan plot of GWAS: The dashed lines indicate the 5% genome-wide significant threshold values圖3 全基因組Fst值分布圖和GWAS曼哈頓圖Fig.3 The distribution of Fst values of SNPs across the genome and Manhattan plot of GWAS

2.3 玉山黑豬兩種頭型的全基因組關聯分析

通過GEMMA軟件對所有個體進行病例-對照的全基因組關聯分析，并經Q-Q plot檢驗，結果顯示，膨脹系數(λ)為1.037,表示沒有明顯的群體層化效應(圖4)。我們在SSC10上檢測到了2個基因組顯著水平的SNPs，最高點SNP(ALGA0056978，P=5.38E-07)位于11.76 Mb處(圖3b)，與Fst最高值的SNP(CASI0009931,SSC10:11.36 Mb)相距僅400 kb。通過與最高點連鎖不平衡(LD)r2≥0.8及單倍型分析,確定該位點的置信區間為11.76～12.05 Mb(圖5)。

橫坐標為預期P值對數的相反數(將負數轉換為正數)，縱坐標為計算P值對數的相反數X axis means the expected values of the opposite of exponential P values, the Y axis means the observed values of the opposite of exponential P values圖4 Quantile-quantile (QQ) 圖Fig.4 Quantile-quantile (QQ) plot

3 討 論

近年來，中國地方豬因其優異的種質特性受到研究者的廣泛關注，為科研工作在繁殖性狀、肉質性狀和遺傳進化等領域提供了重要的研究材料[14]。在《中國畜禽遺傳資源志·豬志》收錄的豬種中，有18個豬種(東串豬、山豬、岔路黑豬、金華豬、仙居花豬、皖南黑豬、濱湖黑豬、杭豬、樂平豬、玉江豬、大蒲蓮豬、確山黑豬、陽新豬、大圍子豬、通城豬、德保豬、文昌豬、漢江黑豬)存在頭型的分離。從其中心產區的分布地域來看，這些具有頭型變異的豬種主要集中在長江中下游流域。不同頭型的產生可能與長江中下游流域祭祀習俗有關。清吳谷人《新年雜詠》中寫到“杭俗，歲終禮神尚豬首，至年外猶足充饌。定買豬頭在冬至前，選皺紋如‘壽’字者，謂之‘壽頭豬頭’?！薄蔼{子頭”型豬符合了當時社會活動和人們祭祀的文化需求而受到了選擇。

我們對玉山黑豬兩種頭型的群體進行了遺傳分化信號檢測，Wright[4]建議，Fst為0～0.05表明群體間遺傳分化程度較小，可以忽略，Fst為0.05～0.15表明群體間分化程度為中等，Fst為0.15～0.25表明群體間分化程度較大，Fst大于0.25則表明群體間分化程度很大。本研究所得到的Fst平均值為0.031(圖2)，說明玉山黑豬兩種頭型的群體間總體上不存在明顯的遺傳分化。我們對玉山黑豬“獅子頭”型和“馬臉”型兩個類群的11個表型性狀進行了差異性分析，結果表明大部分性狀(除管圍外)均差異不顯著。這些結果符合了玉山黑豬品種選育的實踐-即無論是“獅子頭”型還是“馬臉”型都是按照相同的方向進行選育的，玉山黑豬并沒有形成兩種特定的、存在明顯遺傳分化和表型巨大差異的亞群。這為后續基于“病例-對照”的兩種頭型群體的全基因組關聯分析奠定了基礎。將僅存在頭型差異的兩組玉山黑豬群體進行了基于“病例-對照”的全基因組關聯分析，結果顯示，在10號染色體上檢測到了與遺傳分化信號相互重合的顯著關聯位點。通過連鎖不平衡(LD)和單倍型分析，將置信區間定位在11.76～12.05 Mb(圖5)。此區間內包含兩個可能的候選基因：RAB3GAP2和IARS2。

RAB3GAP2(RAB3-GTP酶激活蛋白催化亞單位2)編碼的蛋白質屬于RAB3蛋白質家族，參與調節胞外分泌的神經遞質和激素，可能參與神經發育過程如增殖、遷移和分化前突觸的形成[15]。在人中，與RAB3GAP2相關的疾病有Martsolf綜合征和Warburg Micro綜合征，其癥狀表現為顱面部骨骼發育異常(顴骨扁平、高顎)和智力障礙[16]。Aligianis等[17]報道，RAB3GAP2基因的一個低倍純合剪切突變在一個家族中造成Martsolf綜合征。Borck等[18]報道，一個純合移框突變造成一個土耳其女孩的Warburg Micro綜合征。IARS2(異亮氨酰-tRNA合成酶2)編碼蛋白可氨?；c其tRNA同源的氨基酸，氨酰合成酶被認為是在進化過程中最早出現的蛋白質。在人中，與IARS2相關的疾病包括骨骼發育異常、生長激素缺乏癥、白內障和感音神經性聽力損失等[19-20]。GO注釋表明，與該基因相關的生物學活動包括核苷酸裝配和氨酰-tRNA編輯[21]。近年來多項研究表明，IARS2基因在人類中與多種疾病相關，如肥厚型心肌病[22]、非小細胞肺癌[23]、胃癌[24]等。H?gg等[25]利用全基因組基因薈萃分析認為，IARS2等基因與歐洲人肥胖相關。Gomes等[26]發現，IARS2等蛋白質合成和降解基因與內洛爾牛的重要經濟性狀相關。根據與這兩個基因相關的人疾病綜合征表現特征(骨骼發育，尤其是顱面部骨骼發育)，筆者推測，RAB3GAP2和IARS2基因可能參與調控玉山黑豬兩種頭型的形成過程。驗證這一推測需要更多深入的后續研究，如精細定位和多組學聯合分析。

a.最顯著位點附近4 Mb的區域GWAS，四邊形塊代表不同顯著程度的SNP位點，不同顏色代表與最高點不同的連鎖不平衡程度；b. 290 kb置信區間內的基因；c. 包含最高點的LD熱圖，最高點SNP用紅線表示，一段包含最高點的392 kb單倍型框用黑色線框圈出a. Regional plot of a 4 Mb region around the most significant SNP, diamonds represent the SNPs with differet significance, the colored diamonds indicate different linkage disequilibrium (LD) extents between the top SNP and other SNPs; b. Genes within the 290 kb confidence interval; c. LD heatmap for the SSC10 locus, the top SNP is indicated in red line, a haplotype block with 392 kb harbors containing the top SNP are highlighted by black triangles圖5 10號染色體上的顯著關聯位點Fig.5 The significant associated region on SSC10

4 結 論

本研究基于全基因組60K芯片數據，結合群體遺傳分化分析和全基因組關聯分析，在SSC10上鑒別到了與玉山黑豬兩種頭型形成顯著關聯的遺傳位點。結合統計分析結果和目標區域內的基因功能，筆者推測，RAB3GAP2和IARS2是影響玉山黑豬頭型的重要候選基因。該結果為玉山黑豬及中國地方豬種群體內不同頭型形成機制的深入研究奠定了基礎。