胍基乙酸及代謝產物肌酸的研究進展

王譽杰，張進威，王 訊，李明洲，李學偉，馬繼登

(四川農業大學動物科技學院，動物遺傳育種研究所，成都 611130)

胍基乙酸最早是從人和狗的尿液中分離出來的，是一種天然存在于動物體內的氨基酸衍生物。工業合成的胍基乙酸為白色無味粉末，溶于水，摩爾質量為117.11 g·mol-1，結構穩定，室溫下可穩定保存2年[1]。目前，胍基乙酸作為一種優質的食品補充劑或飼料添加劑，廣泛地應用于人類保健及動物生產環節。胍基乙酸在酶的催化作用下能夠內源性地合成肌酸(creatine, Cr)，肌酸是一種含氮氨基酸，被認為是一種能量緩沖劑，主要作用是在肌酸激酶(creatine kinase, CK)的作用下形成磷酸化肌酸(P-Creatine，PCr)，參與三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)循環。當ATP供能不足的瞬間，磷酸肌酸通過肌酸激酶以非?？斓乃俣葘⒘姿峄鶊F轉移到二磷酸腺苷中(adenosine diphosphate，ADP)重新轉化為三磷酸腺苷。已知補充肌酸可減少糖尿病患者甲硫氨酸的消耗，同時降低肝中同型半胱氨酸的產生，阻止脂肪的積累，因此對脂肪肝和非酒精性肝病患者有益[2]。動物體內每天約有1.6%(2 g)的肌酸和磷酸肌酸不可逆的轉化為肌酐，并由尿液排出體外[3]。由于動物體內源性合成的肌酸僅占機體所需肌酸的50%，因此需外源性添加肌酸。但是肌酸價格偏高，且半衰期較短，故不適合作為飼料添加劑。而胍基乙酸作為肌酸前體，在體內能夠合成肌酸，已在畜牧生產中得以普遍應用，其主要作用包括提高生長育肥豬的生長性能和豬肉品質[4]，增加肉雞的胸肌產量，改善肉質和能量代謝[5]。

本文綜述了胍基乙酸的生理功能及其代謝產物肌酸對肌肉、脂肪細胞的影響，以期為胍基乙酸進一步的研究提供參考。

1 胍基乙酸的體內代謝途徑

胍基乙酸是脊椎動物體內天然的肌酸前體，而肌酸在細胞內能量的轉運過程中有著重要的作用[3]。胍基乙酸在體內的代謝是個復雜的過程，首先L-精氨酸在精氨酸-甘氨酸脒基轉移酶(L-arginine glycine amidinotransferase, AGAT)的作用下催化形成L-鳥氨酸，而切下的咪基被轉移到甘氨酸上形成胍基乙酸，這個過程主要在腎中進行，其次肝和胰中也能形成胍基乙酸[6]，其中AGAT是肌酸合成第一步的限速酶，在翻譯過程中受到肌酸的負反饋調節[7]。其次胍基乙酸通過血液運輸到肝中，在胍基乙酸N-甲基轉移酶(guanidinoacetate methltransferase, GAMT)的作用下將S-腺苷甲硫氨酸的甲基催化到胍基乙酸中形成肌酸和S-腺苷高半胱氨酸，這個過程主要在肝中進行。此外，GAMT同樣在小鼠的腎、心和骨骼肌中被發現，也存在于人胎兒期的肺成纖維細胞，但這些組織中的GAMT活性較低[3]。肝中的肌酸通過血液循環運輸到存在肌酸轉運受體蛋白(creatine transporter, CreaT)的組織中，例如骨骼肌和心[8-9]。肌酸轉運受體在腦部的表達量較低，這似乎說明腦部有一套自己的肌酸合成機制。相對于肌酸，胍基乙酸在體內的吸收利用的報道并不多，但與肌酸對比，胍基乙酸的添加能更有效地增加體內總肌酸(肌酸與磷酸肌酸)的含量[10-11]，造成這樣的結果可能是由于有更多的胍基乙酸轉運進細胞。胍基乙酸除了能通過肌酸轉運受體蛋白轉運到細胞內，還能通過?；撬徂D運體和γ-氨基丁酸轉運體轉運到胞漿內[12](圖1)。Fagerberg等[13]使用RNA測序技術，對人27個組織進行轉錄組測序，結果發現，GAMT表達量最高的組織為肝，其次是胰、腎；而AGAT表達量最高的組織為腎，其次為肝和胰腺。GAMT在各個組織都有表達，而AGAT似乎只在特定組織表達。然而，各種器官組織對胍基乙酸吸收的研究不多，胍基乙酸和組織間肌酸運輸的相關性尚不清楚。

內源性合成肌酸需要3種氨基酸：甘氨酸、甲硫氨酸和精氨酸，以及兩種酶：AGAT和GAMT。由于甘氨酸易于合成，因此肌酸合成幾乎不會對機體中甘氨酸代謝帶來負擔。然而甲硫氨酸和精氨酸作為人體必需氨基酸和條件性必需氨基酸，在人體內不能自主合成或合成量不足以滿足人體正常需求，因此整個肌酸合成將對機體甲硫氨酸和精氨酸的代謝產生明顯的負擔，但外源補充胍基乙酸將只消耗甲硫氨酸。

L-Arg. 左旋精氨酸；Gly. 甘氨酸；AGAT. 精氨酸-甘氨酸脒基轉移酶；L-ornithine. 左旋鳥氨酸；GAA. 胍基乙酸；GAMT. 胍基乙酸甲基轉移酶；γ-GABAT. 伽馬氨基丁酸轉運體；TaurineT. ?；撬徂D運體； CreaT. 肌酸轉運膜蛋白；Cr. 肌酸；CK. 肌酸激酶；P-Cr. 磷酸肌酸；ADP. 二磷酸腺苷；ATP. 三磷酸腺苷L-Arg. L-arginine; Gly. Glycine; AGAT. L-arginine glycine amidinotransferase; L-ornithine. L-ornithine; GAA. Guanidinoacetic acid; GAMT. Guanidinoacetate methltransferase; γ-GABAT. Gamma-aminobutyric acid transporter; TaurineT. Taurine transporter; CreaT.Creatine transporter; Cr. Creatine; CK. Creatine kinase; P-Cr. Phosphorylated creatine; ADP. Adenosine diphosphate; ATP. Adenosine triphosphate圖1 胍基乙酸體內代謝途徑Fig.1 Guanidinoacetic acid metabolism in vivo

2 胍基乙酸的主要生理功能

早在20世紀50年代就有報道稱，外源性添加胍基乙酸能夠提高心代償失調病人的生理機能，并且提出胍基乙酸提高生理機能可能是基于肌酸的生物合成。但除了作為肌酸的前體，胍基乙酸還具有許多生理功能，包括促進胰島素的分泌[14]，影響神經調節[15-16]，改變精氨酸的代謝[17-18]以及影響機體氧化和抗氧化系統[19]。

2.1 胍基乙酸促進胰島素的分泌

胍基乙酸能夠促進胰島素分泌，最早在動物試驗中被發現。體外注射胍基乙酸及胍基衍生物，能夠刺激嚙齒動物的胰腺分泌胰島素，并且胍基團可能是刺激胰島素分泌的一個重要原因[14]。胍基乙酸刺激胰島素分泌的具體機制可能是由于胍基乙酸分子的極性能影響胰島細胞膜去極化，并通過蛋白激酶A和C增強靶細胞膜表面胰島素受體的活性，從而激活胰島素信號通路[20]。胰島素的生理功能主要表現為降低血糖，因此，外源性添加胍基乙酸能夠降低血漿中的葡萄糖水平。由于胍基乙酸的促胰島素分泌作用，似乎說明胍基乙酸可以通過影響胰島素的體內平衡，作為一個抗糖尿病合成代謝劑，從而維持血糖穩態。

2.2 胍基乙酸改變機體精氨酸代謝

精氨酸對于禽類為必須氨基酸，有研究表明，胍基乙酸能有效地代替飼料中的精氨酸[17]。因為精氨酸作為胍基乙酸的前體，在禽類體內一部分精氨酸用于合成胍基乙酸，因此在肉雞日糧中添加胍基乙酸能夠節約出更多的日糧精氨酸并參與精氨酸的其他生理學功能，例如蛋白質的合成、激素的釋放(如生長激素)、提高胸肌產量[5,18]。其次，精氨酸也可以作為一氧化氮(NO)的前體，因此外源性添加胍基乙酸也能夠影響一氧化氮介導的促生長的生理功能[21]。

2.3 胍基乙酸的神經調節

胍基乙酸可以激活腦和外周組織中的γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)受體。這是由于胍基乙酸與γ氨基丁酸的結構非常相似(圖2)，因此，在GAMT缺乏癥患者(一種常染色體隱性遺傳疾病)體內內源性的胍基乙酸不能及時合成肌酸導致血清或者腦部中累積高濃度(10～30 μmol·L-1)的胍基乙酸，并激活神經細胞電壓門控或配體門控的氯離子通道，導致自發性的神經元損傷[15]。也就是說，胍基乙酸能夠作為一種γ氨基丁酸競爭性抑制劑，激活影響神經系統的興奮性。研究表明，給健康人每天補充3 g的胍基乙酸，3周之后發現，血漿中γ氨基丁酸水平顯著下降[16]，這似乎說明胍基乙酸的添加能夠負向調節γ氨基丁酸的血漿水平。然而，胍基乙酸的添加是否能夠激活γ氨基丁酸介導的神經元或肌肉興奮性還需進一步研究。

GABA. γ氨基丁酸，一種重要的抑制性神經遞質；GAA. 胍基乙酸GABA. Gamma-aminobutyric acid, an important inhibitory neurotransmitter; GAA. Guanidinoacetic acid圖2 胍基乙酸與γ氨基丁酸結構式Fig.2 The structural formula of guanidinoacetic acid and gamma-aminobutyric acid

2.4 胍基乙酸影響機體氧化-抗氧化系統

目前，在動物體水平上的一些研究表明，胍基乙酸可能影響氧化-抗氧化系統，它能同時作為一種超氧化物和抗氧化化合物。小鼠在注射胍基乙酸后誘導了氧應激，并且在病理狀態下累積過量的氧自由基[22]。當胍基乙酸的濃度在腦部提高(大約100 μmol·L-1) 并累積后，胍基乙酸表現出明顯的超氧化作用，簡單的說，胍基乙酸作為一個純凈的超氧化劑能夠從它的共軛堿提供一個電子生成超氧陰離子—氧自由基，從而產生活性氧[19]。然而另有研究表明，飼糧中添加胍基乙酸可以通過提高總抗氧化能力和活化抗氧化酶活性的方式提高機體抗氧化形態[4]，在攝取胍基乙酸后血清胍基乙酸濃度(大約5 μmol·L-1)較低時才體現出抗氧化作用。這是由于胍基乙酸的攝取能淬滅其相關代謝物(肌酸和精氨酸)的氧自由基[5]，因此，胍基乙酸有著間接的抗氧化作用。也就是說，如果胍基乙酸代謝保持原狀或提供了低濃度的外源性胍基乙酸，就體現出了抗氧化的作用，而當體內產生了過多的胍基乙酸，其可作為一種強氧化劑，并誘導氧應激。

3 胍基乙酸安全性的研究

膳食胍基乙酸的添加最初應用于人研究中。早期研究發現，胍基乙酸能夠對心代謝失調和抑郁焦慮的患者有良好的作用，且沒有明顯的副作用。代重山等[23]對胍基乙酸的致突變性進行研究，發現胍基乙酸的添加不會致誘變或基因毒性，也不會對環境造成危害。因此，胍基乙酸能夠普遍地應用于人類保健和動物生產環節。胍基乙酸的服用對人肝和肌肉的酶表達譜沒有明顯影響，且服用帶來的副作用也是可接受的，例如體重增加、惡心、腹脹、肌肉痙攣、腹痛。但值得注意的是，服用胍基乙酸除了會增加血清肌酐含量和肌肉中肌酸的含量外，還能夠提高血清中同型半胱氨酸的含量[24-25]。這是由于胍基乙酸被甲基化形成肌酸的同時還能夠形成S-腺苷高半胱氨酸，然后在體內被水解成半胱氨酸和腺苷。由于血清中同型半胱氨酸是臨床上動脈粥樣硬化和心血管疾病的重要指標[26]，因而胍基乙酸的攝入提高了血漿中同型半胱氨酸的含量，可以考慮作為胍基乙酸的一種副作用。因胍基乙酸合成肌酸所需的甲基基團由S-腺苷甲硫氨酸提供，當胍基乙酸與甲基供體(如甜菜堿、膽堿、維生素B)一起作為添加劑添加時，能夠抑制因胍基乙酸攝入后血清同型半胱氨酸的升高[27]。此外，歐洲食品安全局指出，飼喂高劑量的胍基乙酸不會導致豬和雞的肉制品中胍基乙酸、肌酸和同型半胱氨酸對消費者帶來影響[28-29]。由于胍基乙酸的攝取能夠增加血清中同型半胱氨酸的含量，因此胍基乙酸作為一種運動保健藥品或動物飼料添加劑時，需密切關注血清中同型半胱氨酸的濃度。

4 肌酸

肌酸最先在骨骼肌中被發現。直到20世紀70年代，在培養的骨骼肌細胞和心肌細胞中添加肌酸，能增加肌特異蛋白的合成。目前有大量試驗證明，外源性添加胍基乙酸能夠提高機體肌酸或磷酸化肌酸的含量[10, 24-25]。并且肌酸能增加肌肉細胞成肌相關基因的mRNA表達和蛋白質合成，并促進肌肉細胞和成骨細胞的分化[30-31]，抑制脂肪細胞的分化[32]。

4.1 肌酸對肌肉細胞的影響

近年來，肌酸對肌肉細胞的影響引起了越來越多研究者的關注，Willoughby和Rosene[33-34]研究發現，肌酸的補充與物理訓練的共同作用可以增加成年人肌肉的強度和肌纖維長度，并且調節肌球蛋白重鏈的合成，促進Myog、MYF6的mRNA和蛋白的表達水平。2003年，Vierck等[35]研究發現，在肌衛星細胞分化期，添加肌酸能顯著地促進肌衛星細胞的分化。幾年后，Louis等[36]和Sestili等[37]研究進一步確定，在C2C12細胞分化期添加肌酸，除了能調節成肌調控因子家族(MRFs)的基因表達外，還能夠上調IGF-1基因的表達。由于IGF-1介導的骨骼肌細胞肥大的典型信號通路有PI3K-Akt/PKB-mTOR、MAPK/ERK和鈣調磷酸酶信號通路[36]，這些研究對將來研究肌酸介導骨骼肌細胞肥大提供了指導性方向。隨后Deldicque等[38]的研究進一步確定肌酸的添加確實能夠使Akt/PKB、p53-MAPK的mRNA和蛋白表達上調，并提出p38-MAPK和Akt/PKB通路可能是肌酸發揮作用的中間介質。

對于人體骨骼肌，肌酸的添加確實增加了MRFs家族基因和IGF-1基因表達量，并且提高了4E-BP1的磷酸化水平，其中4E-BP1是PI3K-Akt/PKB-mTOR信號通路下游的效應物，該信號通路受到IGF-1的激活[39]。Safdar等[40]研究報道，短期補充肌酸能增加青年人骨骼肌中SPK1、PKB-α、p38、MAPK表達水平，這些蛋白因子的共同作用促使成肌細胞分化。在有素食習慣的青年人膳食中添加肌酸能在其物理訓練中進一步增加肌內IGF-1含量[41]。

此外，肌酸還有抗氧化應激的作用。氧化應激對成肌細胞的增殖和分化有極大的影響，并伴隨著肌纖維的大量損失[37, 42-43]。H2O2誘導的氧化應激能夠阻礙C2C12細胞的成肌能力，包括顯著減少MyoD、Myog、MYF6和IGF-1基因的轉錄，抑制成肌細胞的分化[44-45]，而外源性添加肌酸能顯著減少氧化應激的作用，并恢復C2C12成肌細胞的分化能力[46]。

4.2 肌酸對脂肪細胞的影響

隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，肥胖的發病率也急劇上升，從而引起了一系列代謝疾病，如Ⅱ型糖尿病和心血管疾病。肥胖的根本原因是由于脂肪細胞數目和體積的增加[47]。脂肪作為一種儲能器官，當食物攝入體內，轉換成的大部分能量以產熱的方式散發到外界環境中。若持續過多的能量攝入，多余的能量將以三酰甘油的形式儲存于脂肪細胞中。因此，肥胖可以由食物攝入的增加和能量消耗(散熱)的減少所引起[48]。

相對于肌肉細胞來說，肌酸對脂肪細胞影響的研究較少。肌酸的功能是通過從ATP或ADP接收或轉移高能磷酸鹽來調節能量水平[3]。研究表明，肌酸能通過下調胰島素誘導的PI3K信號通路的方式抑制前體脂肪細胞(3T3-L1)和間充質干細胞(MSCs)的細胞質積累三酰甘油，并呈現出劑量效應[32]。但肌酸只能抑制前體脂肪細胞的早期分化，一旦脂肪生成被激發，肌酸就不能阻止脂肪細胞的成熟。但有研究提出，肌酸抑制脂肪細胞的形成是不依賴肌酸的磷酸化水平，這意味著肌酸抑制脂肪形成不是由細胞內能量供應變化所引起的[32]。Kazak等[49]研究再次證實了以上發現，該試驗構建了GAMT脂肪細胞特異性敲除小鼠，并發現與對照組相比，高脂日糧能夠誘導GAMT敲除鼠累積更多的脂肪，但在攝取和排出的能量、糞能、沉積能等表型中并沒有顯著差異，而GAMT基因敲除小鼠在耗氧量上顯著低于對照組。這是由于脂肪細胞能通過一種非顫抖的方式散熱，也就是說由于基因敲除小鼠降低了肌酸的生成，抑制了因采食而誘導的產熱，從而促進了脂肪細胞的肥大。

5 小 結

胍基乙酸是天然的肌酸前體，外源性添加胍基乙酸能夠提高機體總肌酸水平，并且胍基乙酸的攝入不會帶來明顯的副作用。除了作為肌酸前體，胍基乙酸的一些生理功能可能會與其作為運動員保健藥或飼料添加劑密切相關，其中包括促進胰島素的分泌，參與神經調節，改變精氨酸的代謝，參與氧化和抗氧化形態的轉換。但是胍基乙酸促進胰島細胞分泌胰島素的具體分子機制、激活γ-氨基丁酸的機理、代替精氨酸的效率和明確的調節氧化-抗氧化系統的機制還需進一步研究。正是因為胍基乙酸影響生理功能的具體機制還不清楚，所以人們將目光轉向胍基乙酸的代謝產物肌酸。由于人體內每天約有1.6%(2 g)的肌酸和磷酸肌酸不可逆的轉化為肌酐，故需通過從頭合成或從動物性蛋白中攝取肌酸以補充機體肌酸的消耗。肌酸在肌酸激酶的作用下形成磷酸化肌酸，參與能量代謝。肌酸與磷酸化肌酸系統不會存在于所有細胞中，相反它僅存在于能量需求高的組織中，特別是骨骼肌中。外源性添加肌酸能夠通過調控PI3K-Akt/PKB-mTOR、MAPK/ERK信號通路促進肌分化和骨骼肌肥大，但肌酸是如何引起一系列信號通路的激活還有待進一步探究。此外，肌酸還能促進成骨細胞的分化，抑制成脂細胞的分化，并參與調控因飲食誘導的產熱。肌酸在能量供應中起到關鍵作用，但在缺乏GAMT的情況下(圖3)，GAA可能使肌酸激酶飽和，產生磷酸胍基乙酸(P-GAA)從而代替磷酸肌酸[50]。GAMT敲除小鼠確實能夠通過磷酸化胍基乙酸，從而積極應對肌酸的缺乏[51-52]。

在動物生產環節，胍基乙酸的添加除了能提高豬的屠宰性能，增加肉雞的胸肌產量之外，還能夠改善宰后pH、滴水損失、蒸煮損失、硬度和剪切力等肉質指標[53]。究其原因是動物在屠宰后，血液循環停止，無氧酵解增多，從而產生乳酸，而在日糧中添加胍基乙酸能夠提高機體能源物質(磷酸化肌酸)的儲備，增加ATP的含量，從而延緩糖酵解的進程。同樣地，直接添加肌酸也能延緩因屠宰后糖酵解帶來的pH降低[54]。與肌酸相比，胍基乙酸作為飼料添加劑更穩定且更便宜，因此更適合用于動物營養。盡管如此，胍基乙酸形成肌酸的甲基化消耗比所有其他甲基化反應需要更多的S-腺苷甲硫氨酸[55]。外源性補充胍基乙酸極大程度地增加了甲基基團需求[56]，這同時也引起了血液中同型半胱氨酸的積累[57-58]或導致蛋氨酸的缺乏。研究者發現胍基乙酸與甲基供體如甜菜堿、膽堿、葉酸或維生素B12組合添加時能降低單一補充胍基乙酸導致的同型半胱氨酸提高，且不會影響肌肉肌酸含量和機體能代謝系統[53]。

GAA. 胍基乙酸；GAMT. 胍基乙酸甲基轉移酶，肌酸合成第一限速酶；Cr. 肌酸；CK. 肌酸激酶；P-Cr. 磷酸肌酸；ADP. 二磷酸腺苷；ATP. 三磷酸腺苷；P-GAA. 磷酸化胍基乙酸GAA. Guanidinoacetic acid; GAMT. Guanidinoacetate methltransferase; Cr. Creatine; CK. Creatine kinase; P-Cr. Phosphorylated creatine; ADP. Adenosine diphosphate; ATP. Adenosine triphosphate; P-GAA. Phosphorylated guanidinoacetic acid圖3 胍基乙酸的代替機制Fig.3 The substitution mechanism of guanidinoacetic acid